液體發酵生產靈芝三萜酸的過程調控研究進展

李麗，楊云麗，楊小凡，何偉，袁愷，朱威宇，彭超，何一凡，董銀卯，周衛強*

1(北京工商大學 化學與材料工程學院，北京, 100048)2(北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京, 100048) 3(中糧營養健康研究院有限公司，北京, 102209)

靈芝(Ganodermalucidum)是多孔菌目、靈芝科、靈芝屬真菌，被列為九大仙草之一。靈芝三萜酸(簡稱三萜酸)是靈芝的主要活性成分之一。目前從子實體、菌絲體和孢子中提取得到的三萜酸共有200余種，含有羧基和多羥基結構(圖1)，是一類高度氧化的脂溶性羊毛甾醇衍生物[1]。三萜酸具有抗癌、抗炎、抑菌、保肝、抗氧化、助睡眠等功效[2-4]。例如靈芝酸A可以抑制大腸桿菌與金黃色葡萄球菌活性、抗乳腺癌[5]，同時對脂多糖誘導的炎癥因子的釋放具有抑制作用[6]，靈芝酸D可以降低結腸癌細胞存活率[7]，靈芝烯酸F、靈芝酸DM具有抗腫瘤、抗炎活性[8]等。

目前，在中國靈芝生產量超過11萬t/年，占世界總產量的70%[9]。靈芝常被加工為保健食品進行銷售，在我國注冊上市的靈芝保健品已有600余種。此外，靈芝還可被加工為藥品、生物輔料、化妝品等[10]。例如，靈芝與其他物質進行發酵，得到發酵液可制作成飲品，靈芝孢子粉破壁后被加工成膠囊或者提取孢子油等成分[11]。2019年11月，靈芝作為藥食同源物質進行試點工作，研究論證將靈芝納入食藥物質目錄管理的可行性。自此，靈芝不僅可以應用于藥品和保健食品中，而且也可以應用于普通食品中，靈芝的需求量日益增長。

靈芝三萜酸主要存在于靈芝子實體、孢子粉和液體發酵的菌絲體、發酵液中。靈芝子實體生長周期長，受季節影響，而且土壤污染、農藥使用等增加了安全風險。而液體發酵技術可以在短時間內培養靈芝菌絲體，使其快速生長，定向促進靈芝三萜酸積累，具有發酵周期短、發酵成本低廉、發酵條件易精確控制，并可工業化生產等優點[12]。因此，液體發酵技術成為目前獲取三萜酸的有效手段及研究熱點。但是與靈芝子實體相比，液體發酵技術獲得的三萜酸種類較少、含量較低，所以系統研究三萜酸的發酵調控工藝，對進一步提高三萜酸的產量具有重要意義。本文從發酵過程調控角度，闡述并探討了發酵條件和外源物質干預對靈芝三萜酸的調控機制，為提高三萜酸產量提供發酵技術參考。

圖1 靈芝菌絲體內常見的三萜酸骨架Fig.1 Triterpenic acid skeleton in the mycelium of Ganoderma lucidum

1 發酵條件對靈芝液體發酵法產三萜酸的影響

1.1 較高溫度促進靈芝三萜酸的產生

溫度是影響微生物生長代謝的重要因素之一。溫度改變會影響微生物體內各種生化反應，進而影響其生長繁殖以及物質代謝。其一，升高溫度會加快靈芝菌絲體對葡萄糖的消耗速度，加快菌絲體快速進入生長對數期[13]。FENG等[14]采用5 L發酵罐研究了23、26、29和32 ℃下G.lucidumG0119的恒溫深層液體發酵過程。在23～29 ℃，隨著溫度上升，靈芝菌終點生物量增加，當溫度提高至32 ℃時，靈芝菌終點生物量降低。從發酵全過程來看，29 ℃下恒溫深層液體發酵最有利于靈芝三萜的合成，達到2.54 mg/100mg DW。但是發酵0～80 h，較高的發酵溫度可以縮短菌絲體生長延滯期，快速進入靈芝三萜積累階段。

其二，溫度會影響靈芝生長發育以及代謝酶活性[15]。靈芝菌絲體生長適合溫度一般是26～30 ℃[16]，而靈芝代謝酶最佳活性溫度一般高于菌絲體最適生長溫度[15]。劉月芹等[15]研究發現，與對照組(30 ℃培養條件)對比， 32、34、36 ℃培養靈芝生物量均呈下降趨勢，但是胞外靈芝酸產量增加，其中在34 ℃培養下發酵12 d，靈芝酸含量比對照組提高了20.58%。ZHANG等[17]將二級種子液在42 ℃熱脅迫處理0～24 h，發現熱脅迫12、24 h后的胞內總靈芝酸分別增加了65%、80%，鯊烯比對照組高1.9、2.3倍，羊毛甾醇比對照組高2、3倍。在熱脅迫12 h后，靈芝酸合成關鍵基因hmgr、sqs比對照組高2、3.5倍。

較高溫度加速發酵前期靈芝菌的生長速度，提高靈芝酸合成酶活性，從而縮短三萜酸合成的延滯期。根據發酵液溫度構建靈芝生長及三萜酸合成動力學模型，制定變溫策略，使發酵前期合成三萜酸延滯期縮短，發酵后期菌絲體積累量提升，以提高三萜酸的比合成速率。

1.2 弱酸性環境促進三萜酸的合成

pH會影響靈芝細胞膜通透性，從而影響營養物質吸收、產物分泌以及三萜酸合成相關酶的活性[18]。在PalRim信號途徑傳遞過程中，pH升高激活轉錄因子PacC/Rim 101的表達，從而調控三萜酸的合成。研究發現PacC沉默菌株中靈芝酸含量、sqs和ls的轉錄水平、鯊烯和羊毛甾醇含量均明顯提高，表明PacC抑制三萜酸的生物合成[19]。在中性和堿性環境下PacC大量轉錄表達，所以在酸性環境更利于三萜酸合成。曠思敏等[20]對初始pH進行單因素實驗，靈芝三萜酸含量隨著pH增加呈現先增加后下降的趨勢，pH值為5.5時，胞外三萜酸達到最大值，為266.79 mg/L。pH值為6.0時，胞內三萜酸達到最大值，為257.98 mg/L。FANG等[21]發現初始pH值為5.5時，胞內靈芝酸含量最高，為1.25 mg/100mg DW，而當初始pH值為6.5時，胞外三萜酸含量達到最大值，為207.9 mg/L;結果差異可能是由于菌種不同導致。WANG等[22]采用兩階段pH控制策略實現了三萜酸的高濃度積累。通過0～72 h時控制pH值為5.07，72～144 h時控制pH值為4.37，三萜酸最大質量濃度達到449.37 mg/L。潘江安等[23]根據靈芝菌絲體的比生長速率和靈芝胞內三萜的比合成速率綜合因素，制定了四階段pH控制策略，大幅提高了胞內三萜的產量，達到279.59 mg/L，比對照(pH自然)和pH 4.5時分別提高了47.72%和17.52%。

上述實驗證明，靈芝在弱酸環境(pH 4～6.5)時利于三萜酸的合成。主要原因是當發酵環境呈弱酸性時，PacC轉錄表達受到抑制，三萜酸合成關鍵酶表達上調，從而促進靈芝三萜酸的合成。

1.3 低溶氧促進三萜酸的合成

靈芝屬于好氧型真菌，菌體的生長需要較高濃度溶氧[16]，較低溶氧則有利于靈芝酸合成[24]。TANG等[25]發現當溶氧為25%時，有利于靈芝菌絲體生長，當溶氧濃度為10%時，有利于靈芝酸合成。

FANG等[26]采用振蕩靜置兩階段方式對靈芝進行培養。將靈芝先振蕩培養4 d后再靜置培養12 d，與振蕩培養16 d相比，靈芝酸產量從1.36 mg/100mg DW提高到3.19 mg/100mg DW。徐軼寧[27]對靜置培養過程中分子機制進行研究，發現靜置培養過程中靈芝酸合成關鍵酶基因hmgr，sqs，ls的表達量分別比振蕩培養時高1.9、4.3、2.1倍。振蕩靜置兩階段培養方式，振蕩為靜置階段提供菌絲量和合成三萜酸的基礎，靜置階段使三萜酸合成關鍵酶基因轉錄增強，促進三萜酸的合成。

在微量泵技術操作中，護理評估及宣教不全面是常見的錯誤之一，有可能導致護理不良事件的發生。護理評估主要對患者、藥物、環境等進行評估，是護理程序的第一步，而護理宣教是貫穿在整個操作過程中對患者進行健康教育，包括藥物作用、儀器使用及注意事項等，這些在護理操作過程中必不可少。本結果提示，年資越高的護理人員，出錯率越低，可能是隨著工作時間的延長，護理人員在患者疾病觀察、治療和護理方面臨床經驗越豐富，溝通能力越強，因此，在操作過程中出錯率越低[10]。而低年資的護理人員知識儲備不足，工作能力相對較低，對評估和宣教的重點內容把握不足，不能將理論知識應用于實踐，因此，宣教不夠全面[11]。

發酵轉速改變影響溶氧以及剪切力變化。趙娜等[28]將靈芝以150 r/min培養1.5 d后降為 100 r/min培養，其靈芝三萜產量比對照組(150 r/min 恒轉速)高了21%，其靈芝三萜含量高達 58.65 mg/g。這是因為降低轉速減少了體系中溶氧量，從而促進菌絲體內靈芝三萜積累。低攪拌轉速會降低剪切力，影響發酵液混合以及氧傳遞，導致溶氧量降低。張偉[29]研究發現低剪切力組(剪切力為0.154～1.234 m/s)靈芝酸含量和產量比高剪切力組(剪切力0.154 ～2.161 m/s)分別提高85%和276%，其靈芝酸含量和產量分別為3.53 mg/100mg DW和798.0 mg/L。

通氣量直接影響菌體對培養基中溶解氧攝取，因此在發酵過程中需要合適的通氣量。馮杰等[30]采用5 L發酵罐研究通氣量對三萜酸合成影響。實驗結果顯示8、10 L/min通氣量使菌體生長的遲滯期縮短，快速進入穩定期，穩定期時三萜酸的合成速率明顯提高。研究發現，8 L/min通氣量，三萜得率最大，為2.33 mg/100mg DW，比4、6、10 L/min 通氣量的靈芝三萜得率分別提高了1.39、0.99、0.84倍。孫金旭[31]采用通氣量為0.4 L/(L·min)時，靈芝酸產量達到最大，為171.26 g/L。由此可見，適中通氣量對于菌絲體生長和三萜酸合成有明顯促進作用。

振蕩靜置兩階段方式、攪拌轉速/剪切力以及通氣量會影響發酵液中的溶氧濃度，發酵后期降低轉速或者通氣量，達到降低溶氧目的，使靈芝細胞產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)信號，以提高三萜酸合成酶表達，促進三萜酸合成。

1.4 指數補料方式利于三萜酸的合成

補料培養具有富集高密度菌體、改善發酵環境、降低培養基底物抑制等特點，被廣泛用于發酵次級代謝產物生產中[32]。不同補料發酵方式對靈芝生長及三萜酸合成具有較大影響。馮杰等[33]對比了間歇式補料、恒速補料、變速補料、指數補料培養對三萜酸合成的影響。研究發現，采用指數補料方式補充葡萄糖得到三萜含量最高，達到4.58 mg/100mg DW。在發酵過程中，補料葡萄糖速率隨著菌絲體干重指數增加呈指數方式增加，特別是發酵后期為菌絲體合成三萜酸提供能量。指數補料方式更適合靈芝生長和三萜酸合成。TANG等[34]開發了分批補料發酵策略，當殘糖質量濃度在5～10 g/L時，補加15 g/L乳糖，靈芝酸產量達到330.2 mg/L，有效提高了靈芝酸產量。通過在過程中補料碳源(葡萄糖/乳糖)，減少初始糖濃度，可以避免較高糖濃度對三萜酸合成抑制。在發酵過程中補充糖為靈芝菌絲體合成三萜酸提供能量，從而提高總三萜酸的產量。

在發酵過程中，pH、溫度、溶氧、補料方式等發酵過程參數是影響靈芝發酵三萜酸合成關鍵因素。綜合考慮靈芝菌絲體的比生長速率和靈芝胞內三萜的比合成速率，將各個因素分階段調控靈芝發酵，或者在某個因素控制發酵的基礎上結合其他影響因素，對液體發酵提高三萜酸含量具有參考意義。

2 外源物質對三萜酸的調控

13C同位素標記證明靈芝三萜酸是通過甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVA)合成[35]。三萜酸主要通過三個階段合成(圖2)。第一階段：前體物質法尼基焦磷酸生成。第二階段：羊毛甾醇骨架生成。第三階段：不同三萜酸的生成。羊毛甾醇經過氧化、羥基化和糖基化后生成不同結構的三萜酸。在靈芝三萜酸合成上游途徑中有4種關鍵酶，分別為3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR)、法尼基磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，FPS)、鯊烯合成酶(squalene synthase，SQS)、羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase，LS)[36]，在下游途徑中，CYP450參與合成各種結構靈芝三萜酸[37]。

研究發現，在發酵體系中加入一些外源物質干預三萜酸合成途徑，是獲取高濃度三萜酸有效策略。本文闡述了中草藥、金屬離子、植物激素、油脂類化合物及其他物質對三萜酸合成的影響。

2.1 添加中草藥雙向液體發酵

我國中草藥資源豐富，所含活性物質多樣。采用雙向發酵技術，將中藥添加到發酵液中，可為靈芝生長提供營養基質并影響靈芝細胞壁通透性，促進菌絲體生長和三萜酸合成。

朱強等[38]發現添加6 g/L甘草后靈芝胞內三萜量達到最大值，為0.238 g/L；添加8 g/L甘草后胞外三萜量達到最大值，為0.653 g/L。比未添加甘草組分別提高了179.49%和204.91%；李小娟等[39]也證明了甘草水提物對三萜合成具有促進作用。枸杞、金銀花、桔梗、板藍根水提物對靈芝菌絲體胞內外三萜合成均有促進作用。其中1 g/L枸杞水提物使得胞內三萜含量最高，達87.02 mg/L，0.25 g/L枸杞水提物得到胞外三萜含量最高為140.22 mg/L。另有研究報道枸杞、金銀花、桔梗的醇提物也顯著促進胞內外三萜的合成[40]。所以中草藥提取物并非是作為有效碳源促進三萜酸合成，可能是中草藥活性成分對三萜酸合成影響。從中草藥種類來看，不同中草藥其活性物質有所差異，而且提取液中活性物質成分復雜，對胞內外三萜酸影響并不是某個成分直接影響，而是各種成分綜合效應的結果。

AACT-乙酰輔酶A乙酰轉移酶；HMGs-3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合酶；HMGR-3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶；MK-甲基戊酸激酶； MPK-甲羥戊酸激酶；MVD-甲羥戊酸脫羧酶；IDI-異戊烯焦磷酸異構酶；FPS-法尼基磷酸合酶；SQS-鯊烯合酶；SE-鯊烯環氧酶；LS-羊毛甾醇合酶圖2 靈芝三萜酸合成途徑Fig.2 Synthesis pathway of ganoderma triterpene acid

魚腥草和杜仲對胞內三萜合成具有一定抑制作用，但是可以促進胞外三萜酸合成；而黨參、茶葉對靈芝菌絲體胞內三萜酸合成有促進作用，但是抑制胞外靈芝三萜酸合成[39]。其原因可能是中草藥的添加影響了靈芝細胞壁某些成分的合成代謝, 使靈芝細胞壁通透性增加/減少，另者是中草藥能促進/抑制胞外三萜酸的合成代謝。目前已有研究表明，與靈芝細胞壁合成相關基因(mapk4、SWI6、Skn7、14-3-3蛋白)影響靈芝三萜酸合成[41-44]，可通過檢測中草藥對靈芝細胞壁相關蛋白表達的影響，進而判斷中草藥是否影響細胞壁的合成或者通透性來調控三萜酸的合成或分泌。

2.2 添加金屬離子

金屬離子在真菌的生長發育以及代謝中具有重要作用，不僅參與細胞生長、調節細胞通透性、作為酶的輔因子參與次級物質代謝[45]，而且影響細胞內外離子平衡，進而引起胞內Ca2+濃度上升，觸發鈣信號，調節三萜酸代謝[46]。

根據研究報道，在發酵培養基中添加10 mmol/L Ca2+，總靈芝酸產量、靈芝酸Mk、靈芝酸T，靈芝酸S和靈芝酸Me比對照組提高了3.7、2.6、4.5、3.2、3.8倍，含量分別為86.45、2.55、10.90、2.79、5.08 mg/g DW[47]。LI等[48]在發酵過程中將氮源限制與Ca2+添加相結合，比單獨添加Ca2+更能提高靈芝酸產量。此外，添加Na+、Mn2+均可促進靈芝酸的合成。添加Ca2+、Na+、Mn2+后，靈芝酸合成基因hmgr，sqs和ls以及鈣感應蛋白基因cam，cna和crzl的轉錄水平均顯著上調，說明添加Ca2+、Na+、Mn2+是通過激活Ca2+信號通路和三萜酸合成關鍵酶基因的轉錄水平來提高三萜酸產量[47, 49- 50]。Cu2+在3 mmol/L下，靈芝酸合成量最高，其含量高于對照組91%[51]，鮑銳[52]在培養基中添加100 mol/L硫酸銅作為Cu2+供體，靈芝酸產量達到207.773 mg/L，是對照組的1.57倍。銅離子通過增強ROS和Ca2+信號轉導，并上調ls和sqs的轉錄水平誘導三萜酸的合成。

微量的稀土元素鐠與鑭同樣具有明顯的誘導三萜酸合成的作用。當兩者在0.1 mmol/L時，胞內三萜的產量分別達到347.59、398.49 mg/L，分別為對照組的1.67、1.91 倍；當在0.001 mmol/L時，胞外三萜產量分別達到610.08、489.22 mg/L，分別為對照組的2.03、1.63 倍[53]。

2.3 添加植物激素

植物激素具有調節真菌生長、次級代謝產物合成以及誘導孢子萌發的作用[54]。在眾多植物激素中，茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)研究較為深入。REN等[55]在發酵第6天向培養基中添加254 μmol/L MeJA，根據Rt-PCR檢測發現，靈芝酸合成途徑相關酶基因(hmgr、mvd、fps、sqs、ls)的轉錄水平上調，從而誘導靈芝酸的合成，靈芝酸含量達到4.52 mg/100mg DW，比對照組提高了45.3%。辛燕花等[56]使用100 μmol/L的 MeJA對靈芝菌進行誘導，發現誘導后的胞內靈芝酸是對照組的1.93倍，胞外靈芝酸產量是對照組的2.21倍。另有研究表明，50 μmol/L的MeJA會導致細胞氧化還原酶失衡，進而產生ROS信號，參與調控靈芝酸生物合成。此外，MeJA可以誘導細胞色素P450氧化還原酶合成[57]，細胞色素P450氧化還原酶含量增加也進一步表明MeJA可以促進靈芝酸的合成。

葉麗云等[58]在靈芝液體發酵第12天時添加150 μmol/L水楊酸(salicylic acid，SA)，對關鍵酶分析發現，fps、sqs和ls的表達量上調，導致三萜含量增加，三萜含量達到45.74 mg/g，比對照組高37.19%。LIU等[59]發現SA是通過抑制線粒體復合體Ⅲ的活性，增加了ROS的生成，從而誘導三萜的生物合成。

乙烯作為重要的植物激素，對靈芝生長及三萜酸合成具有促進作用。因乙烯很難處理，乙烯利會釋放出乙烯，所以在植物中常用乙烯利(又稱2-氯乙基磷酸)代替乙烯。使用15.9 mmol/L乙烯利誘導靈芝15.5 h后，靈芝酸產量增加了90%，含量為33 mg/g DW，羊毛甾醇及角鯊烯的含量增加了近2倍。與對照組相比hmgr,sqs和ls的mRNA 水平分別上升了2.6、4.3、3.8倍[60]。

植物激素可能是通過ROS信號轉導途徑上調靈芝三萜酸合成關鍵酶基因轉錄表達，促進三萜酸的合成。

2.4 添加油脂類化合物

油脂類化合物在液體發酵過程中除了作為消泡劑使用，也可作為誘導物質影響真菌細胞膜的結構及通透性或者酶活性，刺激真菌的生長代謝[61]。油酸存在于動植物體內，具有食用安全性，價格低廉等優點。孫冰沁[62]在培養基中添加4.38%(體積分數)油酸，發酵9 d后三萜產量達287.67 mg/100mL。進一步發現，添加油酸后，合成靈芝三萜的sqs和cyp450關鍵基因表達上調，從而促進三萜的合成。FENG等[63]發現，添加30 mL/L油酸，得到三萜的產量為1.076 g/L。姚強等[64]研究發現亞油酸對三萜合成具有較強的促進作用, 當添加量為2.0 g/L 時, 胞內、胞外三萜量分別達到394.23、551.32 mg/L，比對照組分別提高了1.13、1.12 倍。同時研究者還發現硬脂酸與棕櫚酸對三萜酸的產生具有抑制作用。對薏苡仁油成分分析發現，薏苡仁油含有89.54%酸類物質，其中油酸占比高達49.26%，亞油酸占比為31.94%，棕櫚酸占比為17.83%，硬脂酸占比為0.97%[65]。LIU等[66]在發酵培養基中添加1.5 g/L薏苡仁油發酵6 d后，總靈芝酸含量79.90 mg/g，比對照組增加1.29倍。進一步研究發現，薏苡仁油誘導靈芝合成的CYP450酶比對照組增加了153%，NO、H2O2濃度也增加了5.37、6.23 倍，導致細胞內NO、ROS信號被激活。薏苡仁油通過促進CYP450酶的表達以及NO、ROS雙信號串聯轉導途徑調控三萜酸合成。

由于脂肪酸鏈的長短以及飽和度的不同導致油脂類化合物誘導三萜酸合成的效果不同[67]。植物油中富含不同類型及不同比例脂肪酸，對三萜酸的誘導效果也會有所差異，植物油對三萜酸的誘導應該是其所含的不同脂肪酸共同作用的效果。

2.5 其他干預物質

苯巴比妥是一種典型的P450誘導劑，能增加多種植物細胞色素P450酶的轉錄[68]。LIANG等[69]研究發現，添加100 μmol/L苯巴比妥能誘導總靈芝酸含量增加，為41.4 mg/g DW。與對照組相比，靈芝酸Mk，靈芝酸T，靈芝酸S，靈芝酸Me分別增加了47%，28%，36%，64%。醋酸是醋的主要成分，相對于其他誘導劑對人體的安全性較高。研究發現，5 mmol/L的醋酸可促進三萜酸生物合成的中間代謝物羊毛甾醇和鯊烯合成，并顯著上調合成途徑中sqs、ls、hmgs和cyp51的mRNA轉錄水平，使靈芝酸含量提高了92.4%，為3.98/100mg DW[70]。阿斯匹林通過Hog-1磷酸化介導靈芝細胞凋亡并誘導ROS大量產生，誘導三萜酸的大量合成。據報道，4 mmol/L阿斯匹林能顯著提高lanosta-7,9(11), 24-trien-3α-01-26-oic acid(靈芝酸 24)和總靈芝酸的產量，分別為515.2、5 385 μg/100mg DW[71]。

靈芝在野外生長于木材中，木材中含有的木質素、纖維素以及半纖維素等可為靈芝生長提供能量，靈芝分泌木質纖維素酶降解木材中纖維素成分[72]，纖維素部分解聚為微晶纖維素，1.5%微晶纖維素顯著增加hmgr、sqs、ls表達水平，三萜含量顯著提高了85.96%[73]。王俊杰等[74]研究發現培養基中添加15 g/L微顆粒Talc時，總靈芝酸含量達到1.51 mg/100mg DW，靈芝酸Mk，靈芝酸T和靈芝酸Me的含量最高為6.02、5.08、1.71 μg/100 mg DW，分別是對照組的1.6、4、1.9和1.4倍，并且鯊烯和羊毛甾醇含量比對照組高2.60、4.20倍，靈芝酸生物合成途徑關鍵基因fps和cyp5150l8的表達量分別比對照組高2.35、1.53倍。

目前，液體發酵過程中添加誘導劑是提高三萜酸產量的主要策略。研究表明，一些中草藥提取物(例如甘草、枸杞、金銀花等)、MeJA、SA、油酸、大豆油、薏苡仁油、金屬離子等均可通過增強信號轉導并促進關鍵酶基因表達從而誘導三萜酸合成。但是中草藥原產地不同導致效果存在差異，茉莉酸甲酯、水楊酸等價格昂貴，金屬離子可能會產生安全性問題，因此需要通過實驗才能篩選出安全性高、價格低廉且效果明顯的誘導劑。

3 討論

靈芝三萜酸具有抗癌、抗炎、免疫調節、助睡眠等多種藥理作用，是開發藥品及保健品的重要原料。液體發酵技術可以短時間制備三萜酸并且可大規模工業化生產，助力相關三萜酸產品的產業化發展。三萜酸合成是靈芝對外源脅迫防御反應的一部分，受環境條件和誘導物質調控。將發酵條件和外源物質模擬環境脅迫，從而促進三萜酸的生物合成。但是不恰當的環境脅迫會造成靈芝菌絲體生長抑制，導致總體三萜酸產量降低。通過綜合考慮靈芝菌絲體的比生長速率和三萜酸比合成速率兩方面因素，制定出既能促進菌絲體快速生長、縮短三萜酸合成延滯期，又能保證發酵后期三萜酸合成速率達到最大值的最佳發酵工藝。

外源物質的添加可誘導靈芝三萜酸的合成。一方面需要篩選出安全有效的誘導物質，制定最佳添加工藝(添加時間與添加量)。另一方面，三萜酸的合成過程涉及兩個或多個協同信號通路，需要對各種誘導信號的轉導機制進行研究,有助于提高三萜酸產量。目前，已有研究利用基因工程技術操作對三萜酸合成途徑中關鍵酶基因過表達，轉錄因子進行基因修飾提高了三萜酸的產率。為此，將基因工程操作與誘導干預相結合的技術，或許可以作為提高三萜酸發酵生產的新策略。