桑葉生物堿對氧化應激小鼠糖脂代謝異常及肝損傷的改善作用

楊忠敏，沈以紅，黃先智，王祖文，丁曉雯,

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400716；2.西南大學科技處，重慶 400716）

長時間連續大量攝入D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）會造成機體細胞內D-Gal大量堆積，D-Gal在半乳糖氧化酶的作用下生成醛糖和活性氧（reactive oxygen species，ROS）等，這些物質不能被細胞代謝，進而導致機體氧化應激-自由基損害[1]作用的發生。肝臟是D-Gal的主要代謝器官，也是機體最重要的解毒器官，大量D-Gal產生的有毒物質（如醛類）會直接損害肝細胞[2]。研究表明，氧化應激參與糖尿病的發生或發展，是糖尿病發生的重要環節[3]。氧化應激會損害胰島β細胞，導致細胞內抗氧化酶水平降低，抗氧化能力下降，進而使得胰島β細胞對ROS的敏感性增加[4]。過量的ROS不僅會直接促進胰島β細胞凋亡，還可以作為信號分子參與調節胰島素的分泌，從而間接抑制胰島β細胞的功能[5-6]。胰島β細胞受損使得胰島素的分泌量降低，進而影響機體的糖代謝能力[7]。同時，氧化應激也會促進胰島素抵抗的發生和進一步加劇脂代謝紊亂。脂代謝水平升高會增加耗氧量，進而產生大量ROS，過量的ROS又會導致脂肪、蛋白質等大分子變性，造成胰腺受損，進而反向影響脂代謝，發生脂代謝紊亂[8]。而糖尿病是以糖代謝紊亂為主的代謝性疾病，同時也會引發脂代謝異常，繼而引發組織、器官以及消化系統病變[9]。因此，尋找能夠改善機體氧化應激的物質，尤其是天然產物，對預防氧化應激導致的糖脂代謝異常和肝損傷的發生或發展具有重要意義。

桑葉是一種藥食兩用植物資源，味苦、甘，性寒，歸肺、肝經，具有疏風清熱、清肝明目等功效[10]。研究表明，桑葉中含有豐富的活性成分如黃酮、多糖和生物堿等，在抗高血壓[11]、抗凝血[12]、降血糖[13]、降脂[14]、抗腫瘤轉移[15]等方面有重要利用價值。桑葉生物堿所含的特殊羥基結構使其具有許多生理功能。王祖文等[16]研究表明，桑葉生物堿對四氯化碳聯合高脂飲食誘導的小鼠肝損傷具有較好的改善作用；文晉等[17]初步證明了桑葉生物堿粗提液可以調節小鼠體內膽固醇代謝；王玲等[18]研究結果表明，桑葉生物堿的特征物質1-脫氧野尻霉素能較好改善肥胖小鼠脂代謝。此外，桑葉生物堿對機體血糖水平也具有較好的調控作用[19]。但桑葉生物堿對氧化應激伴隨的糖脂代謝異常及肝損傷情況作用效果的研究鮮見報道。本課題前期研究結果表明，桑葉生物堿能較好地改善氧化應激小鼠機體DNA、脂質及蛋白質的氧化損傷，同時對氧化應激導致的腎臟損傷也具有明顯的改善作用。因此，本研究采用D-Gal誘導小鼠建立氧化損傷模型，通過評價小鼠血糖、血脂水平及肝損傷指標的變化，探討桑葉生物堿對氧化應激小鼠糖脂代謝異常與肝損傷的影響，旨在為開發桑葉生物堿相關保健食品提供理論依據，為氧化應激導致糖脂代謝紊亂及肝損傷的預防與治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明種小鼠220 只（體質量18～20 g），4 周齡，購自重慶醫科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK（渝）20180003；使用許可證號：SYXK（渝）2018 0003）?；A飼料購于重慶醫科大學實驗動物中心。

干燥桑葉粉由重慶市蠶業科學技術研究院提供；桑葉生物堿為實驗室自制，采用硅鎢酸法測定得到干燥桑葉粉樣品中總生物堿質量分數為93.57%。

D-Gal（純度≥99%）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）等檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Symergy H1酶標儀 基因有限公司；RE52CS-1旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；811DK高速冷凍離心機 德國Eppendorf AG公司；KQ5200DB超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；DW-HL438超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀 上海精科實業有限公司；EG1105H型石蠟切片機德國Leica公司；包埋盒 江蘇世泰實驗器材有限公司；生物顯微鏡 日本Olympus株式會社；ONE TOUCHTMBasicTMPlus血糖監測儀 美國理康公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養、造模及分組

小鼠按照西南大學實驗動物保護和使用規則飼養，室溫（（23±2）℃）、相對濕度40%～60%，整個實驗期間室內通風條件良好，12 h明暗交替（9∶00—21∶00），所有小鼠均飼喂基礎飼料，自由覓食、飲水。

220 只雄性SPF級昆明種小鼠，飼養7 d適應環境后，隨機選擇40 只小鼠為正常對照組，腹腔注射與造模試劑等體積的生理鹽水；其余180 只小鼠腹腔注射D-Gal（1 000 mg/kgmb），連續注射20 d后，頜下采血，測定造模組、正常對照組小鼠血清中丙二醛濃度、超氧化物歧化酶活力是否存在顯著差異，若存在，則判定小鼠造模成功[19]，用于后續實驗。

保留正常對照組小鼠40 只。剔除造模未成功及造模過程中死亡的20 只小鼠，剩余造模成功的160 只小鼠，取10 只作為灌胃0 周實驗小鼠，根據1.3.2節方法采樣后用于相關指標測定；剩余150 只小鼠隨機分為模型組（灌胃等體積生理鹽水），陽性藥物組（灌胃200 mg/kgmbGSH），桑葉生物堿低、中、高劑量組（分別灌胃50、100、200 mg/kgmb桑葉生物堿，灌胃劑量根據預實驗結果確定），每組30 只。所有小鼠每天灌胃1 次，分別連續灌胃4、8、12 周。

1.3.2 樣本采集

分別于灌胃第4、8、12周末，每次每組各取10 只小鼠，禁食不禁水16 h，眼球取血于含有肝素鈉的真空采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，收集上清液即為血漿，于-80 ℃保存備用。

1.3.3 血糖、血脂相關指標的測定

采用血糖監測儀測定小鼠空腹血糖濃度；按照試劑盒說明書操作步驟測定小鼠血漿TC、TG濃度及ALT、AST活力。

1.3.4 肝臟組織病理學觀察

肝臟經體積分數10%福爾馬林溶液固定48 h后，脫水，石蠟包埋，切片（厚度約為4 μm），蘇木精-伊紅染色，在光學顯微鏡下進行組織病理學觀察。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，每個樣本平均測定3 次，結果以平均值±標準差表示，用單因素方差分析及多重比較進行顯著性差異分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 桑葉生物堿對氧化應激小鼠空腹血糖水平的影響

機體的空腹血糖水平是糖尿病最常規的檢查指標之一，可以反映胰島β細胞功能，一般能表示基礎的胰島素分泌功能[20]。

表1 桑葉生物堿對氧化應激小鼠空腹血糖濃度的影響Table 1 Effect of mulberry leaf alkaloids on fast blood glucose in mice suffering from oxidative stressmmol/L

由表1可知，在實驗周期內，正常對照組小鼠的空腹血糖濃度隨灌胃時間的延長呈緩慢升高趨勢，但變化不明顯，基本保持穩定；灌胃0、4、8、12 周后，模型組小鼠空腹血糖濃度較相同灌胃時間的正常對照組小鼠分別增加了30.27%、29.48%、31.01%、24.96%（P＜0.05），提示氧化應激小鼠機體空腹血糖濃度升高，糖代謝發生紊亂。隨著桑葉生物堿灌胃劑量的增加，桑葉生物堿各劑量組小鼠空腹血糖濃度呈現逐漸降低的趨勢。灌胃4、8、12 周后，相同灌胃時間下，與模型組小鼠相比，陽性藥物組小鼠的空腹血糖濃度分別降低了21.73%、17.59%、20.58%（P＜0.05），桑葉生物堿高劑量（200 mg/kgmb）組小鼠的空腹血糖濃度分別降低了24.58%、22.03%、17.92%（P＜0.05）。桑葉生物堿中、高劑量組和陽性藥物組小鼠的空腹血糖濃度接近，并且均與正常對照組小鼠空腹血糖濃度無顯著差異（P＞0.05），表明100 mg/kgmb劑量以上桑葉生物堿的降糖作用與實驗劑量GSH作用效果相當，能夠使氧化應激小鼠的空腹血糖濃度恢復到正常水平，其作用效果呈現較明顯的劑量依賴效應，但無明顯的時間依賴效應。

2.2 桑葉生物堿對氧化應激小鼠血脂水平的影響

血脂是血漿中中性脂肪的總稱，是生命基礎代謝的必需物質，TG、TC為血脂主要成分。由表2可知，在實驗周期內，正常對照組小鼠的血漿TC濃度隨灌胃時間的延長呈現逐漸增加的趨勢，但變化不明顯；與正常組對照組相比，灌胃0、4、8、12 周后，模型組小鼠的血漿TC濃度分別增加了57.75%、75.88%、70.86%、71.41%，差異極顯著（P＜0.01），提示氧化應激小鼠機體出現血脂紊亂現象，表現為高血漿TC濃度。相同灌胃時間下，桑葉生物堿各劑量組小鼠的血漿TC濃度均隨灌胃劑量的增加呈現逐漸降低的趨勢。灌胃4、8、12 周后，相同灌胃時間下，與模型組小鼠相比，陽性藥物組小鼠的血漿TC濃度分別降低了46.88%、42.68%、40.17%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量（200 mg/kgmb）組小鼠血漿TC濃度分別降低了41.73%、39.77%、40.80%（P＜0.01）。桑葉生物堿高劑量組小鼠血漿TC濃度與陽性藥物組接近，且兩組均與正常對照組無顯著差異（P＞0.05），說明200 mg/kgmb桑葉生物堿對血漿TC濃度的降低作用達到實驗劑量GSH的水平，能夠使氧化應激小鼠血漿TC濃度恢復到正常水平，作用效果呈現劑量依賴效應，但無明顯的時間依賴效應。

表2 桑葉生物堿對氧化應激小鼠血漿TC濃度的影響Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TC in mice suffering from oxidative stressmmol/L

表3 桑葉生物堿對氧化應激小鼠血漿TG濃度的影響Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TG in mice suffering from oxidative stressmmol/L

由表3可知，在實驗周期內，正常對照組小鼠血漿TG濃度基本保持穩定；與正常組對照組相比，灌胃0、4、8、12 周后，相同灌胃時間下，模型對照組小鼠血漿TG濃度分別增加了36.84%、35.00%、38.10%、31.82%（P＜0.01），提示氧化應激小鼠機體出現血脂紊亂現象。相同灌胃時間下，桑葉生物堿各劑量組小鼠的血漿TG濃度均隨灌胃劑量的增加呈現逐漸降低的趨勢。灌胃4、8、12 周后，相同灌胃時間下，與模型組小鼠相比，陽性藥物組小鼠的血漿TG濃度分別降低了22.22%、24.14%、24.14%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量（200 mg/kgmb）組小鼠血漿TG濃度分別降低了22.22%、31.03%、24.14%（P＜0.01）。桑葉生物堿中、高劑量小鼠血漿TG濃度與陽性藥物組接近，且3 組均與正常對照組無顯著差異（P＞0.05），說明100 mg/kgmb以上桑葉生物堿對血漿TG濃度的降低作用達到實驗劑量GSH的水平，能夠使氧化應激小鼠血漿TG濃度恢復到正常水平，其作用效果呈現劑量依賴效應，但無時間依賴效應。

2.3 桑葉生物堿對氧化應激小鼠肝損傷的影響

ALT、AST活力是評價肝功能的重要指標，通過肝臟病理切片能更直觀地判斷肝臟受損情況[21]。為考察桑葉生物堿對氧化應激小鼠肝損傷的影響，測定小鼠血漿ALT、AST活力并進行肝組織切片病理學觀察。

表4 桑葉生物堿對氧化應激小鼠血漿ALT活力的影響Table 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma ALT activity in mice suffering from oxidative stressIU/L

由表4可知，在實驗周期內，正常對照組小鼠血漿ALT活力隨灌胃時間的延長呈逐漸增加趨勢，但變化不明顯；與正常組對照組相比，灌胃0、4、8、12 周后，相同灌胃時間下，模型組小鼠的血漿ALT活力分別增加了58.48%、56.76%、84.97%、86.14%（P＜0.01），提示氧化應激小鼠機體出現肝損傷現象。相同灌胃時間下，桑葉生物堿各劑量組小鼠的血漿ALT活力均隨灌胃劑量的增加呈現逐漸降低的趨勢。灌胃4、8、12 周后，在相同灌胃時間下，與模型組小鼠相比，陽性藥物組小鼠的血漿ALT活力分別降低了35.96%、49.26%、43.51%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量（200 mg/kgmb）組小鼠血漿ALT活力分別降低了32.27%、41.27%、41.97%（P＜0.01）。桑葉生物堿中、高劑量組小鼠血漿ALT活力較為接近，但均高于陽性藥物組和正常對照組，桑葉生物堿高劑量組小鼠血漿ALT活力與正常對照組無顯著差異（P＞0.05），說明100 mg/kgmb以上的桑葉生物堿能夠使氧化應激小鼠的血漿ALT活力恢復到正常狀態，且作用效果接近實驗劑量的GSH水平，呈劑量依賴性，但無明顯時間依賴效應。

由表5可知，在實驗周期內，正常對照組小鼠血漿AST活力呈現逐漸增加趨勢，但變化較??；與正常對照組相比，灌胃0、4、8、12 周后，相同灌胃時間下，模型組小鼠血漿AST活力分別增加了170.94%、183.12%、216.07%、208.48%（P＜0.01），提示氧化應激小鼠機體出現肝損傷現象。相同灌胃時間下，桑葉生物堿各劑量組小鼠的血漿AST活力均隨灌胃劑量的增加呈現逐漸降低的趨勢。灌胃4、8、12 周后，在相同灌胃時間下，與模型組小鼠相比，陽性藥物組小鼠血漿AST活力分別降低了62.91%、66.78%、65.99%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量（200 mg/kgmb）組小鼠血漿AST活力分別降低了62.09%、65.92%、65.77%（P＜0.01）。桑葉生物堿高劑量組小鼠血漿AST活力與陽性藥物組接近，與正常對照組無顯著差異（P＞0.05），說明200 mg/ kgmb桑葉生物堿降低血漿AST活力的作用達到實驗劑量GSH水平，并能夠使氧化應激小鼠血漿AST活力恢復到正常水平，其作用效果呈劑量依賴性，但無明顯時間依賴效應。

表5 桑葉生物堿對氧化應激小鼠血漿AST活力的影響Table 5 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma AST activity in mice suffering from oxidative stress IU/L

圖1 不同組小鼠肝組織病理切片圖（×200）Fig.1 Histopathological observation of liver tissue of mice in all groups (× 200)

由于桑葉生物堿能夠顯著降低ALT、AST活力，且無明顯時間依賴效應，因此，選擇實驗灌胃周期結束（12 周）時進行小鼠肝臟病理學觀察。由圖1可知，正常對照組小鼠肝小葉結構規整，肝細胞呈多邊形整體排列，細胞質豐富，清亮透明，細胞核大而圓；注射D-Gal后，與正常對照組相比，模型組小鼠肝小葉結構不規整，肝細胞存在點狀壞死，細胞體積增大，細胞質可見明顯疏松、腫脹；與模型組相比，陽性藥物組和桑葉生物堿各劑量組小鼠肝損傷情況明顯改善，且隨著劑量的增大，肝損傷程度降低，桑葉生物堿高劑量組小鼠肝組織狀態與陽性藥物組和正常對照組類似。

3 討 論

隨著對桑葉活性成分的深入研究，發現桑葉中的重要活性成分生物堿類化合物對桑葉的藥理作用具有關鍵作用。前期研究已證實桑葉生物堿對氧化應激造成的生物大分子氧化損傷具有較好的改善作用，但桑葉生物堿對氧化應激小鼠糖脂代謝、肝功能損傷的影響鮮有報道。本研究建立D-Gal誘導氧化應激小鼠模型，研究桑葉生物堿對氧化應激所致小鼠糖脂代謝與肝功能異常是否具有改善作用。

孫豐艷等[22]研究表明，隨著年齡增長，機體中血糖、血脂（TG、TC）水平均呈現上升趨勢。本研究中，隨著喂飼時間的延長，正常對照組小鼠空腹血糖、TG、TC濃度及ALT、AST活力均增加。當機體發生氧化應激時，大量ROS導致糖脂代謝異常，血糖、血脂水平會有不同程度的升高[23-24]。本研究中模型組小鼠的測定結果也證實了此結論，并與Huang[25]、Do[26]等的研究結果一致。在本實驗灌胃周期內，桑葉生物堿調節氧化應激小鼠血糖和血脂水平的作用不具有明顯的時間依賴效應，其原因有待深入研究。提示可從抑制氧化應激的角度進一步探討桑葉生物堿調節糖脂代謝異常的具體作用機理。

長期肝損傷通常會導致嚴重的肝臟病變以及不可逆的損傷，如肝纖維化、肝硬化，最終導致肝癌的發生[27]。研究證實，當肝細胞及肝細胞線粒體發生損傷時，ALT、AST會被釋放進入血液，血液中ALT、AST水平顯著升高，表明血液中ALT、AST水平與肝臟組織受損情況密切相關[28]。楊敏[29]的研究表明，正常組小鼠血漿ALT、AST活力呈基本穩定狀態，隨著桑葉生物堿粗提液灌胃劑量的增加和時間的延長，模型組小鼠血漿ALT、AST活力顯著降低（P＜0.05），且在實驗劑量和周期范圍內表現出顯著的劑量依賴效應和時間依賴效應。本研究中，氧化應激導致小鼠肝臟發生損傷，血漿中ALT、AST活力極顯著升高（P＜0.01），隨著桑葉生物堿灌胃劑量的增加和時間的延長，有效降低了模型組小鼠血漿ALT、AST活力，并且桑葉生物堿高劑量組小鼠的血漿ALT、AST活力恢復至正常水平，但在本實驗劑量和周期范圍內，僅表現出顯著的劑量依賴效應，無明顯時間依賴效應，這與楊敏[29]研究結果存在差異，原因有待進一步探討。有研究表明，桑葉生物堿中的特征物質1-脫氧野尻霉素可通過促進血脂血糖的轉運來改善小鼠肝損傷[30]。本研究結果表明，桑葉生物堿通過抑制氧化應激作用，從而調節糖脂代謝，改善肝損傷，但其具體作用的氧化應激信號轉導通路尚不明確。

綜上認為，桑葉生物堿可以改善氧化應激導致的糖脂代謝異常和肝損傷，其機制可能與抑制氧化應激的發生發展有關。該研究結果有助于為研究糖脂代謝異常的發生原因及改善糖脂代謝異常、保護肝功能提供新思路。