黑果腺肋花楸多糖的提取及抗氧化活性研究

馬士超 賈艷菊 馬啟迪 張壽常 林龍慧美 于夢 李振

摘要 [目的]研究黑果腺肋花楸多糖的最佳提取工藝，并考察其體外抗氧化活性。[方法]采用超聲波輔助提取，探究提取溫度、提取時間、超聲功率、料液比對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響，采取正交試驗法對其工藝參數進行優化，并進行體外抗氧化活性分析。[結果]超聲波輔助提取黑果腺肋花楸多糖最佳工藝為提取時間30 min、料液比1∶25、提取溫度30 ℃、超聲功率360 W，在此條件下，黑果腺肋花楸多糖提取率為13.09%。在黑果腺肋花楸多糖濃度為6.0 mg/mL時，其對·OH清除率為73.08%;當濃度為0.60 mg/mL時，其在所選濃度范圍內還原能力最大，吸光度為0.879，對DPPH自由基的清除率達97.99%。[結論]該研究可為黑果腺肋花楸多糖工業化生產提供理論依據，并對其食品開發具有重要意義。

關鍵詞 黑果腺肋花楸;多糖;提取;抗氧化活性

中圖分類號 R284文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）02-0154-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.042

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Sorbus arborescens

MA Shichao，JIA Yanju，MA Qidi et al

（College of Pharmacy，Linyi University，Linyi，Shandong276005）

Abstract [Objective]To study the best extraction process of polysaccharides from Sorbus arborescens and to investigate its antioxidant activity in vitro. [Method]Ultrasoundassisted extraction was used to explore the effects of extraction temperature， extraction time， ultrasonic power， and solidliquid ratio on the extraction rate of polysaccharides from S. arborescens， and orthogonal process was used to optimize its process parameters. The antioxidant activity in vitro was analyzed. [Result]The best technology of ultrasonicassisted extraction of polysaccharides from S. arborescens was extraction time 30 min， solidliquid ratio 1∶25， extraction temperature 30 ℃， ultrasonic power 360 W. Under those conditions， the extraction rate of S. arborescens polysaccharide was 13.09%. At the concentration of 6.0 mg/mL polysaccharides of S. arborescens， the scavenging rate for hydroxyl radicals was 73.08%; when the concentration was 0.60 mg/mL， the reducing power（0.879） was the largest in the selected concentration range， for DPPH，the free radical scavenging rate reached 97.99%. [Conclusion] This research can provide a theoretical basis for the industrial production of polysaccharides from S. arborescens and has important significance for the development of its food.

Key words Sorbu arborescens;Polysaccharides;Extraction;Antioxidant activity

黑果腺肋花楸又名野櫻莓、不老莓，屬薔薇科植物[1-2]。原盛產于北美州的東北部，國外已經有幾百年的種植經驗[3-4]。其果實中含有豐富的原花青素、酚酸、多糖等多種活性成分[5-6]，具有抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等作用[2]。多糖是由醛基和羰基通過苷鍵連接的高分子聚合物，廣泛存在于植物中，可清除機體自由基，防治細菌、病毒、腫瘤、糖尿病等疾病。因此，積極開發植物多糖具有重要的臨床價值。該研究擬測定黑果腺肋花楸多糖的含量，篩選出最佳提取工藝，考察其體外抗氧化作用，以期為黑果腺肋花楸的開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：黑果腺肋花楸果實（遼寧鞍山）;試劑：葡萄糖（分析純）、濃硫酸、6%苯酚、70%乙醇、水楊酸、無水乙醇、FeSO4、H2O2、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、K3[Fe（CN）6]、三氯乙酸（TCA）、FeCl3、Tris-HCl緩沖液（pH=8.2）、鄰苯三酚均為市售分析純試劑。試驗用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

TU1820紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;BSA124S電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）;KQ-600E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;DJ-10A粉碎機（青州精誠醫藥裝備制造有限公司）;TG16-WS離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）;DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海森信試驗儀器有限公司）;BCD-331WDGQ冰箱（海爾集團）。

1.3 方法

1.3.1 材料處理。

取黑果腺肋花楸果實，烘干，粉碎，過80目篩，備用。

1.3.2

葡萄糖標準曲線繪制。精確稱取經干燥恒重的葡萄糖標準品10 mg，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，配成100 μg/mL葡萄糖標準溶液。分別吸取葡萄糖標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 置于試管中，加蒸餾水至 10.0 mL。分別用移液管移取2.0 mL 于比色管中，加入苯酚溶液 1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL 濃硫酸搖勻，靜置10 min，40 ℃水浴30 min。以葡萄糖標準溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線（圖1）。

試驗所得線性回歸方程為y=0.017 3x+0.049 0，式中y為吸光度（A），x為質量濃度（μg/mL），R2=0.987 6，表明在該濃度范圍內葡萄糖濃度與吸光度線性關系良好。

1.3.3 黑果腺肋花楸多糖提取率的測定。

取一定量的黑果腺肋花楸果實粉末溶于70%乙醇溶液中，采用超聲波輔助提取;濾紙過濾，濾液條件為 5 000 r/min 離心10 min;取上清液定容于 50 mL容量瓶，根據苯酚-硫酸法測定黑果腺肋花楸多糖含量，根據下式計算黑果腺肋花楸多糖的提取率：

黑果腺肋花楸多糖提取率=10-6XVnm×100%

式中，n為稀釋倍數;X為葡萄糖質量濃度（μg/mL）;V為提取液體積（mL）;m為預處理后粗多糖質量（g）。

1.3.4 單因素試驗。

分別以料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]、超聲功率（240、300、360、420 W）、提取時間（10、20、30、40 min）、提取溫度（30、40、50、60 ℃）4個因素進行單因素試驗，研究各因素對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

1.3.5 正交試驗。

以黑果腺肋花楸多糖提取率為評價指標，考察超聲輔助提取中提取時間、料液比、提取溫度、超聲功率4個因素對黑果腺肋花楸多糖提取的影響。根據單因素試驗結果確定各個因素的水平，并以此進行L9（34）正交試驗，因素和水平見表1。

1.3.6 黑果腺肋花楸多糖體外抗氧化活性測定。

1.3.6.1 ·OH清除率的測定。

對照組（A0）：1.0 mL蒸餾水+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL 0.88 mmol/L H2O2溶液。樣品組（A1）：取1.0 mL 不同質量濃度的黑果腺肋花楸多糖提取液+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL 0.88 mmol/L H2O2溶液?？瞻捉M（A2）：1.0 mL蒸餾水+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL蒸餾水。37 ℃水浴30 min，于510 nm波長處測定吸光度[8-9]。

·OH清除率=（1-A1-A2A0） ×100%

式中，A1為樣品溶液的吸光度;A0為對照溶液的吸光度;A2為空白溶液的吸光度。

1.3.6.2 還原力的測定。

取不同質量濃度的黑果腺肋花楸多糖提取液1.0 mL于試管中，各加入2.0 mL 0.2 mol/L pH為6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1%K3[Fe（CN）6]溶液混勻，50 ℃水浴20 min后，立即冷卻至室溫，加入2.0 mL10%三氯乙酸，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，搖勻，常溫下反應30 min后，用蒸餾水代替樣品作為空白，于700 nm波長處測定吸光度。吸光度越大表明還原力越大[10]。

1.3.6.3 DPPH自由基清除能力的測定。

參考Brand[7]的方法測定，取不同質量濃度的黑果腺肋花楸多糖提取液1.0 mL于試管中，分別加入4 mmol/L DPPH乙醇溶液 1.0 mL，混勻，暗處靜置30 min，以2.0 mL乙醇作為空白，1.0 mL 4 mmol/L DPPH乙醇溶液與1.0 mL乙醇混合液作為對照，于517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除活性（RAS）計算公式如下：

DPPH自由基清除率=（1-A1/A0）×100%

式中，A1為樣品溶液的吸光度;A0為對照溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

由圖2可知，在超聲功率為360 W、提取時間30 min、提取溫度50 ℃條件下，料液比對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響結果：料液比在1∶10～1∶15時黑果腺肋花楸多糖提取率顯著增加;料液比1∶20～1∶25時，提取率顯著降低;料液比為1∶15時多糖提取率達到峰值，為11.49%。故最佳料液比為1∶15。

2.1.2 超聲功率對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

由圖3可知，在料液比1∶15、提取時間30 min、提取溫度50 ℃條件下，超聲功率對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響結果：超聲功率在240～360 W時，提取率隨超聲功率的增大而增加;360 W以后提取率呈減小趨勢，最大提取率為11.56%。故最佳超聲功率為360 W。

2.1.3 提取時間對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

由圖4可知，在料液比1∶15、提取溫度50 ℃、超聲功率360 W條件下，提取時間對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響結果：在10～30 min，隨提取時間的增加，黑果腺肋花楸多糖提取率不斷增加;在30 min后，提取率呈下降趨勢，最大提取率為1017%。故最佳提取時間為30 min。

2.1.4 提取溫度對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

由圖5可知，在料液比1∶15、提取時間30 min、超聲功率360 W條件下，提取溫度對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響結果：30～40 ℃ 時提取率呈緩慢增加趨勢;50～60 ℃時提取率呈緩慢下降趨勢，最大提取率為11.69%。故最佳提取溫度為40 ℃。

2.2 黑果腺肋花楸多糖提取工藝的優化

在超聲輔助乙醇法提取黑果腺肋花楸多糖單因素試驗結果的基礎上，研究黑果腺肋花楸多糖的提取率與料液比、提取溫度、超聲時間、超聲功率之間的相互關系，并確立最優組合，以得到黑果腺肋花楸多糖的最佳提取條件，上述4因素各取3水平，采用L9（34）正交試驗設計，正交試驗結果見表2。

通過提取率極差分析結果可知，影響黑果腺肋花楸多糖提取率的因素依次為B>A>D>C，即料液比影響最大，提取溫度影響最小。試驗指標提取率越大越好，從k得出黑果腺肋花楸多糖的最佳提取條件為A3B3C1D2，即提取時間30 min、料液比1∶25、提取溫度30 ℃、超聲功率360 W。由方差分析結果可知，因素B 對黑果腺肋花楸多糖提取率有顯著影響（P<0.05），因素 A、C、D 對黑果腺肋花楸多糖提取率無顯著影響（P>0.05），對多糖提取率影響的主次順序為B>A>D>C，即料液比、提取時間、超聲功率、提取溫度，與直觀分析結果一致。

2.3 黑果腺肋花楸多糖體外抗氧化活性測定

2.3.1 黑果腺肋花楸多糖對·OH清除率的影響。

·OH一般被認為是活性最強的自由基，也是毒性最大的自由基，是造成生物有機體過氧化損傷的主要因素，輻射損傷等物理、化學因子都會促進其形成[11]。由圖6可知，在所選濃度范圍內隨著濃度的增大，黑果腺肋花楸多糖對·OH清除率也逐漸增大，當多糖濃度為6.0 mg/mL時，清除率達73.08%。

2.3.2 黑果腺肋花楸多糖還原力的測定。

由圖7可知，在所選濃度內，隨著黑果腺肋花楸多糖濃度的提高，其還原力逐漸增強，當多糖濃度為6.0 mg/mL時，其對鐵還原能力為最大，吸光度為0.879。

2.3.3 黑果腺肋花楸多糖對DPPH自由基清除率的測定。

DPPH自由基是一種很穩定的以氮為中心的自由基，當有自由基清除劑存在時，由于其單電子配對而使其顏色由深紫色褪至黃色，其褪色程度與自由基清除能力存在一定的關系，被色程度越明顯，清除能力越強[12-14]。由圖8可知，黑果腺肋花楸多糖對DPPH自由基有明顯的清除能力。在所選濃度內，多糖的清除能力隨其濃度的增加而增大，在濃度為0.60 mg/mL時，黑果腺肋花楸多糖對DPPH的清除率達97.99%。

3 結論

該研究采用超聲輔助提取黑果腺肋花楸多糖，通過考察

料液比、提取時間、提取溫度和超聲功率對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響，結果表明當料液比為1∶25、提取溫度為30 ℃、提取時間為30 min、超聲功率為360 W時，黑果腺肋花楸多糖提取率最高，為13.09%。黑果腺肋花楸多糖對 DPPH、·OH均具有較強的清除能力，且隨多糖濃度的增加清除能力也逐漸增強，在黑果腺肋花楸多糖濃度為6.0 mg/mL時，對·OH清除能力為73.08%;在黑果腺肋花楸多糖濃度為0.60 mg/mL時，在所選濃度內還原能力最大，吸光度為0.879，對DPPH自由基的清除率達97.99%。由此可知，黑果腺肋花楸多糖具有一定的抗氧化活性。

參考文獻

[1] 陳妍竹，胡文忠，姜愛麗，等.黑果腺肋花楸功能作用及食品加工研究進展[J].食品工業科技，2016，37（9）：397-400.

[2] 于雪，胡文忠，姜愛麗，等.黑果腺肋花楸營養物質與功效的研究進展[J].食品工業科技，2016，37（10）：396-400.

[3] 景安麒，朱月.基于文獻計量的黑果腺肋花楸國內研究現狀分析[J].食品工業科技，2018，39（23）：351-356.

[4] 劉靜，徐莉莉.黑果腺肋花楸黃酮提取工藝優化及體外抗氧化研究[J].食品研究與開發，2017，38（3）：60-65.

[5] 宋健剛.黑果腺肋花楸果實活性成分的提取、純化及體外活性研究[D].吉林：吉林化工學院，2019.

[6] 滕飛.黑果腺肋花楸原花青素類成分分析及功能食品的研制開發[D].長春：長春師范大學，2019.

[7] BRANDWILLIAMS W，CUVELIER M E， BERSET C.Use of a freeradical method to evaluate antioxidant activity[J].LWTFood Scienceand Technology，1995，28（1）：25-30.

[8] 陳瑩.抗氧化劑的抗氧化活性評價方法研究[D].無錫：江南大學，2012.

[9] 張明.幾種體外抗氧化檢測方法的評價研究[D].西安：陜西師范大學，2010.

[10] 李鑫鑫，徐尤美，陳琛，等.天麻不同極性成分的體外抗氧化綜合評價[J].食品科技，2018，43（7）：66-71.

[11] 陳海光，葉丹杰.氧自由基及其清除劑[J].仲愷農業技術學院學報，2002，15（1）：53-60.

[12] 李卓悅，馮玉祥，張洪影，等.國槐花活性多糖抗氧化和免疫增強作用的研究[J].山東畜牧獸醫，2018，39（6）：1-3.

[13] 唐小涵，陳艷妮，湯紅玉，等.牛筋果中酚性化合物及其對DPPH自由基的清除活性[J].天然產物研究與開發，2019，31（10）：1738-1744.

[14] 王榮，孫艷平，楊寬，等.DPPH和T-AOC測定法評價黃芪桂枝配伍的抗氧化能力研究[J].中醫藥導報，2018，24（23）：63-64，69.