解磷菌PSBHY-3的發酵培養工藝參數優化

胡曉娟 許云娜 徐創文 楊鏗 文國樑 曹煜成

摘要：【目的】優化解磷菌PSBHY-3的培養參數，為水產養殖專用解磷菌的工業化發酵生產提供技術支持?！痉椒ā客ㄟ^單因素試驗篩選適合解磷菌菌株PSBHY-3生長的發酵培養基碳氮源及其含量;采用Plackett-Burman試驗篩選獲得對菌量影響最顯著的3個因子;通過最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗確定顯著因子的最佳水平，建立主要培養參數的回歸方程，得出優化后顯著因子的最佳值及預測菌量;通過搖瓶試驗驗證，檢驗模型方程的準確性?！窘Y果】菌株PSBHY-3的最佳碳源、氮源分別為可溶性淀粉和蛋白胨—酵母膏（1∶1）。以溫度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和轉速（C）為因素變量，菌株PSBHY-3的菌量為響應值，擬合得到二次多元回歸方程Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2。優化得到的解磷菌菌株PSBHY-3最佳發酵培養參數為：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨10.18 g/L，酵母膏10.18 g/L，氯化鈉3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7，培養溫度35.54 ℃，轉速164 r/min，接種量1%，裝液量60%（V/V）。在最佳發酵培養條件下，菌量實際值為1.81×109 CFU/mL，與理論菌量（1.72×109 CFU/mL）間無顯著差異（P>0.05），但顯著高于優化前采用營養肉湯培養的菌量（1.90×108 CFU/mL）（P<0.05）?！窘Y論】通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗等優化了菌株PSBHY-3的發酵參數，顯著提高了目的菌量，回歸方程預測準確，優化后的發酵參數可用于水產養殖專用解磷菌的工業化發酵生產。

關鍵詞： 解磷菌;解淀粉芽孢桿菌;發酵;培養參數

中圖分類號： S917.1;Q178.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）02-0475-08

Abstract：【Objective】The cultivation parameters of phosphate solubilizing bacteria PSBHY-3 were optimized， in order to provide technical support for its industrial fermentation production of phosphate solubilizing bacteria preparations for aquaculture. 【Method】Based on single-factor experiment， the optimal carbon and nitrogen source and their contents for the growth of phosphate solubilizing bacteria for phosphate solubilizing bacteria PSBHY-3 were screened. Then， three significant factors affecting the amount of bacteria were determined with the Plackett-Burman experiment. The optimal level of significant factors was determined with the steepest ascent and Box-Behnken experiment， the regression equation of culture parameters was established. Then the optimal values of the significant factors after optimization and the predicted bacterial amount were obtained. Finally， the validity of the model equation was verified with the shake flask experiments.【Result】The results showed that the optimal carbon source and nitrogen source of PSBHY-3 were soluble starch and pe-ptone-yeast extract（1∶1）， respectively. The temperature（A）， applied amount of yeast extract-peptone（B）， and rotation speed （C） were selected as the factor variables， and amount of strain PSBHY-3 was selected as the response variable. The quadratic multiple regression equation was proposed as follow：Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2. The optimum fermentation parameters of strain PSBHY-3 were as follows：soluble starch 10.0 g/L， peptone 10.18 g/L， yeast extract 10.18 g/L， sodium chloride 3.0 g/L， magnesium sulfate 1.0 g/L， pH 7， temperature 35.54 ℃， rotation speed 164 r/min， inoculum quantity 1%， liquid volume in flask 60%（V/V）. Under the above optimum conditions， the amount of bacteria was 1.81×109 CFU/mL， which was not significantly different with the theoretical prediction（1.72×109 CFU/mL）（P>0.05）. But it was significantly higher than that cultured by nutrient broth without optimization（1.90×108 CFU/mL）（P<0.05）. 【Conclusion】Through single-factor test， Plackett-Burman test， steepest ascent test and Box-Behnken test， the fermentation parameters of strain PSBHY-3 are optimized， which significantly increases the target bacterial amount. The prediction of regression equation is accurate. The optimized fermentation parameters can be used in the industrial fermentation of phosphorus preparation for aquaculture.

Key words： phosphate solubilizing bacteria; Bacillus amylolyticus; fermentation; cultivation parameters

Foundation item： Basal Research Fund of Chinese Academy of Fishery Sciences（2020TD54）; Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund of South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences（2019TS06）; Modern Agriculture Industry Technology System Construction Project（CARS-48）; Guangdong Provincial Special Fund for Modern Agriculture Industry Technology Innovation Teams（2019KJ149）

0 引言

【研究意義】磷元素既是養殖池塘微藻生長的必需元素之一，也是限制池塘初級生產力的重要元素之一（胡曉娟等，2010）。在養殖水體中，大量磷肥和含磷餌料進入池塘后多沉積于底泥中，轉化為難溶性磷，水體中可供浮游微藻利用的活性磷相對缺乏（胡百文等，2014），不僅易使水體呈磷限制潛在富營養化，還會導致水體營養失衡和池塘底質污染等問題（劉孝竹等，2009）。研究表明，微生物可控制和影響池塘底泥的釋磷效應（Tomblom and Rydin，1998;吳鵬飛等，2008）。在種植業中常通過施用解磷菌（Phosphate solubilizing bacteria，PSB）來提高植物對磷肥的利用效率（Amanullah and Khan，2015;Bakhshandeh et al.，2015）。若能將解磷菌菌劑應用于養殖池塘中，既可促進底泥中沉積磷的轉化，滿足池塘微藻的生長需求，又能避免外源大量添加磷肥，還可促進池塘的物質循環，減輕環境負荷。而在水產養殖業中解磷菌菌劑產品較少見報道?！厩叭搜芯窟M展】胡曉娟等（2017a）研究發現對蝦養殖池塘的底泥中總磷濃度高，水體中活性磷濃度較低，水體和底泥中的解磷菌數量少;其后，通過多次的分離篩選，從池塘環境得到了一株解磷菌——解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）PSBHY-3，其對池塘底泥總磷具有較好的降解效果，可將其作為水產養殖用解磷菌菌劑的備選菌株（胡曉娟等，2018）。研究表明，培養條件對菌株濃度具有顯著的影響（楊鶯鶯等，2005;夏立群等，2013）。楊鶯鶯等（2015）研究解磷菌YC4在不同條件下的生長狀況，結果發現，菌株YC4在溫度20～35 ℃、鹽度5～20、pH 6.0～8.5的條件下生長良好。而發酵培養的工藝水平決定了菌劑產品的菌體濃度及品質（劉惠知等，2009;Behle and Jackson，2014）。鄭雙鳳等（2017）優化枯草芽孢桿菌NTGB-178的發酵工藝，有效提高了發酵液中的生物量及芽孢產量，其芽孢產量較優化前提高了8.48倍。錢文靜等（2018）研究表明，解淀粉芽孢桿菌JT-84的最佳發酵培養基配方為葡萄糖17.51 g/L、酵母粉9.88 g/L和CaCl2 2.11 g/L。雖然胡曉娟等（2017b）、李莎莎等（2017）優化了蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）的培養參數，顯著提高了蠟樣芽孢桿菌的菌量，但兩株蠟樣芽孢桿菌的發酵工藝和生態功能均不盡相同?！颈狙芯壳腥朦c】當前，有關解磷菌的研究主要聚焦于新菌株的篩選及其功能評價（Li et al.，2019;Ameni et al.，2020），而鮮見優化解磷菌培養參數的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】以解磷菌PSBHY-3為研究對象，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗等優化菌株PSBHY-3的發酵培養參數，獲得可用于發酵生產的培養條件，為水產養殖專用解磷菌的工業化發酵生產提供數據支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 菌株 解磷菌菌株PSBHY-3篩選自養殖池塘環境，該菌種已在中國典型培養物保藏中心保藏（編號為CCTCC NO：M2015260）。

1. 1. 2 培養基 優化前采用營養肉湯培養基培養菌株PSBHY-3，24 h的菌量為1.90×108 CFU/mL。原發酵培養基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，氯化鈉3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7.2±0.2。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 單因素試驗 將保存的菌株PSBHY-3用營養肉湯培養基活化。在原發酵培養基的基礎上，選取不同的碳源（0.5%葡萄糖、1%葡萄糖、2%葡萄糖、0.5%可溶性淀粉、1%可溶性淀粉、2%可溶性淀粉、0.5%糖蜜、1%糖蜜、2%糖蜜、0.5%蔗糖、1%蔗糖、2%蔗糖）和氮源[0.5%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、1%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、2%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、0.5%蛋白胨、1%蛋白胨、2%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%酵母膏、2%酵母膏]，其他成分不變。按1%的接種量將菌株PSBHY-3接種至不同培養基中，30 ℃條件下200 r/min振蕩培養24 h，計數各組菌株PSBHY-3菌量。

1. 2. 2 Plackett-Burman試驗 根據單因素試驗的結果，選取可能影響菌株PSBHY-3生長的7個因子（可溶性淀粉、蛋白胨—酵母膏、溫度、pH、轉速、接種菌量、裝液量）作為因素，另外再設置4個虛擬因素以減少系統誤差，每個因素設置高、低值2個水平，菌量為響應值Y（表1）。共設置12組試驗，試驗后通過方差分析篩選得到對菌株PSBHY-3菌量影響最顯著的3個因子。

1. 2. 3 最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗 選取Plackett-Burman試驗得出的3個影響因子進行最陡爬坡試驗，確定顯著因素的最佳區域與水平，建立擬合方程。然后開展Box-Behnken試驗對顯著因子進行3因素3水平分析。試驗共包括17個組合（中心試驗5個和析因試驗12個）。試驗后，以菌量為響應值，對17個組合的響應值進行回歸分析，建立主要發酵參數的回歸方程。

1. 2. 4 驗證試驗 采用搖瓶試驗對優化后顯著因子的最佳值及預測菌量進行驗證，檢驗模型方程準確性。

1. 3 統計分析

采用SPSS 20.0檢驗不同碳源及氮源對菌株PSBHY-3菌量影響的顯著性，采用Design-Expert 8.0.6對Box-Behnken試驗結果進行多元回歸分析及回歸方程的方差分析。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 不同碳源對菌株PSBHY-3菌量的影響 由圖1可看出，在碳源篩選試驗中，可溶性淀粉組的菌量最高，在1.04×109～1.62×109 CFU/mL，尤以1%可溶性淀粉組最高，顯著高于其他組（P<0.05，下同）。因此，后續選擇1%可溶性淀粉組作為菌株PSBHY-3發酵培養基的碳源。

2. 1. 2 不同氮源對菌株PSBHY-3菌量的影響 由圖2可看出，在氮源篩選試驗中，1%和2%蛋白胨—酵母膏組的菌量最高，在4.15×108～4.26×108 CFU/mL，因此，后續選擇1%蛋白胨—酵母膏組作為菌株PSBHY-3發酵培養基的氮源。

2. 2 Plackett-Burman試驗結果

根據Plackett-Burman試驗結果（表2）及回歸方程方差分析（表3）可知，7個潛在因子對菌株PSBHY-3菌量影響的排序為：溫度>蛋白胨—酵母膏>轉速>接種菌量>可溶性淀粉>pH>裝液量。因此，在后續試驗中，選擇溫度、蛋白胨—酵母膏和轉速3個因子作為影響菌株PSBHY-3菌量的顯著因素。

2. 3 最陡爬坡試驗結果

菌株PSBHY-3的菌量隨溫度、蛋白胨—酵母膏及轉速3個因素水平的升高呈先升高后降低的變化規律，在第7組試驗時菌量達最大（表4），即該組試驗因素水平的菌量接近最大值，因此，將第7組的因素與水平設定為Box-Benhnken試驗的中心點。

2. 4 Box-Behnken試驗結果

以最陡爬坡試驗確定的中心點設計Box-Behnken試驗（表5），并對試驗結果（表6）進行回歸分析，得到溫度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和轉速（C）與菌株PSBHY-3菌量（Y）的回歸方程：

Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2

回歸方程方差分析的結果（表7）顯示，回歸系數模型的P=0.0024（P<0.01），說明二次回歸模型顯著，模型建立有意義;方程失擬項P=0.0898（P>0.05），失擬不顯著，說明試驗數據與模型不相符情況不顯著，該模型方程可靠性良好;相關系數R2=0.9334（R2>0.9），說明模型擬合度較好。此外，溫度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和轉速（C）3個變量的二次項對菌量影響顯著。

2. 5 優化驗證試驗結果

通過Design-Expert 8.06得到的2.4所述回歸方程，在試驗因素水平范圍內預測菌株PSBHY-3的最佳發酵培養條件為：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨 10.18 g/L，酵母膏 10.18 g/L，氯化鈉3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7，培養溫度 35.54 ℃，轉速164 r/min，接種量1%，裝液量60%（V/V）。優化后菌株PSBHY-3的理論菌量為1.72×109 CFU/mL。經驗搖瓶試培養24 h的結果顯示，菌量實測值為1.81×109 CFU/mL，與理論值差異不顯著（P>0.05）。表明該模型方程預測準確，可用來指導水產養殖專用解磷菌PSBHY-3的發酵生產。

3 討論

芽孢桿菌屬菌株是解磷細菌的常見菌屬之一，且作為解磷菌在水域環境中廣泛存在（Golterman，1996）。Jana（2007）認為芽孢桿菌對磷酸鈣和磷礦粉等難溶性磷酸鹽有很好的溶解作用。Sahu和Jana（2000）將解磷菌應用于養殖魚池時所使用的解磷細菌為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和多粘芽孢桿菌（B. polymyxa）。芽孢桿菌因其可產生芽孢，既易存活與繁殖，又易于發酵生產，使其成為微生物產品的重要菌種之一（王星云等，2007）。本研究中，選用從養殖池塘中分離得到的高效解磷菌株——解淀粉芽孢桿菌PSBHY-3作為優化發酵工藝的研究對象。

碳氮源是微生物必需的基礎營養物質，其為微生物的生長提供原材料和所需的能量（趙能等，2016）。宋瑛瑛等（2016）認為由于菌株存在種屬特異性，不同種類的菌株生長代謝所產生酶的種類及活性有所不同，這樣菌株可以選擇性地吸收碳氮源。因此，篩選適合芽孢桿菌生長的最佳碳氮源可有效提高菌株的產菌量（李莎莎等，2017）。本研究選取不同添加量的葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜和蔗糖作為備選碳源，選取不同添加量的蛋白胨、酵母膏和蛋白胨—酵母膏作為備選氮源，進行篩選優化，結果表明，菌株PSBHY-3的優選碳氮源為1%可溶性淀粉和1%蛋白胨—酵母膏。經鑒定，菌株PSBHY-3即為解淀粉芽孢桿菌，其對可溶性淀粉良好的利用效果體現了該類菌株特性。而蛋白胨和酵母膏作為常用的氮源，不僅能促進細菌的生長，還有利于其代謝產物的生成（許翠等，2015）。

最陡爬坡試驗結果表明，溫度和轉速也是影響菌株PSBHY-3菌量的關鍵因素。孫鎮平等（2014）的研究表明解淀粉芽孢桿菌固體發酵的最適溫度約為38 ℃;單哲等（2015）采用智能溫控發酵系統發酵解淀粉芽孢桿菌，可使其保持在最適宜的生長溫度范圍（35±0.2）℃內。本研究得到優化后的培養溫度35.54 ℃與上述研究結果基本一致。菌株PSBHY-3的發酵屬于需氧型發酵，可通過改變轉速來調節培養系統的通氣量，如果轉速過慢，通氣量小，不利于細菌生長;但若轉速過快，可能會引起菌體自溶，致使菌量減少（劉惠知等，2009）。根據本研究對溫度、氮源和轉速3個因素的參數值進行優化分析，最終得到菌株PSBHY-3的最佳培養參數為：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨10.18 g/L，酵母膏10.18 g/L，氯化鈉3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7，培養溫度35.54 ℃，轉速164 r/min，接種量1%，裝液量60%（V/V）。在上述培養條件下，菌株PSBHY-3的菌量實測值為1.81×109 CFU/mL，顯著高于優化前采用營養肉湯培養的菌量（1.90×108 CFU/mL）。由此說明優化后的菌株PSBHY-3發酵培養參數可顯著提高目的菌量，可為水產養殖專用解磷菌的工業化發酵生產提供數據支持。

4 結論

通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗等優化了菌株PSBHY-3的發酵參數，顯著提高了目的菌量，回歸方程預測準確，優化后的發酵參數可用于水產養殖專用解磷菌的工業化發酵生產。

參考文獻：

胡百文，胡曉娟，曹煜成，許云娜，吳垠，李卓佳. 2014. 解磷微生物在養殖池塘中應用的可行性探討[J]. 廣東農業科學，（3）：180-184. doi：10.16768/j.issn.1004-874x.2014.03. 005. [Hu B W，Hu X J，Cao Y C，Xu Y N，Wu Y，Li Z J. 2014. Feasibility of application of phosphate-solubilizing microorganism in aquaculture ponds[J]. Guangdong Agricultural Sciences，（3）： 180-184.]

胡曉娟，李卓佳，曹煜成，楊宇峰. 2010. 養殖池塘生態系統中磷的收支及解磷微生物的研究進展[J]. 安全與環境學報，10（1）： 7-11. doi：10.3969/j.issn.1009-6094.2010.01. 002. [Hu X J，Li Z J，Cao Y C，Yang Y F. 2010. Progress in research of phosphorus budgets in aquaculture pond ecosystem and phosphate-solubilizing microorga-nisms[J]. Journal of Safety and Environment，10（1）： 7-11.]

胡曉娟，文國樑，李卓佳，徐煜，徐武杰，楊鏗，蘇浩昌，曹煜成. 2017a. 四種典型蝦池的磷含量及解磷細菌數量分析[J]. 安全與環境學報，17（6）： 2405-2410. doi：10.13637/j.issn.1009-6094.2017.06.068. [Hu X J，Wen G L，Li Z J，Xu Y，Xu W J，Yang K，Su H C，Cao Y C. 2017a. Comparative analysis of the phosphorus content and phosphate-solubilizing bacteria in four kinds of shrimp ponds[J]. Journal of Safety and Environment，17（6）： 2405-2410.]

胡曉娟，徐創文，李卓佳，文國樑，楊鏗，許云娜，李莎莎，曹煜成. 2017b. 響應面法優化藍藻溶藻菌CZBC1發酵培養工藝[J]. 南方農業學報，48（11）： 2092-2099. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2017.11.27. [Hu X J，Xu C W，Li Z J，Wen G L，Yang K，Xu Y N，Li S S，Cao Y C. 2017b. Fermentation culture technique of cyanobacteria algae-lysing bacteria CZBC1 optimized by response surface method[J]. Journal of Southern Agriculture，48（11）： 2092-2099.]

胡曉娟，許云娜，胡百文，徐煜，楊鏗，文國樑，李卓佳，曹煜成. 2018. 解磷菌PSBHY-3對池塘底泥的解磷效果[J]. 南方農業學報，49（10）：2096-2102. doi：10.3969/j.issn. 2095-1191.2018.10.28. [Hu X J，Xu Y N，Hu B W，Xu Y，Yang K，Wen G L，Li Z J，Cao Y C. 2018. Phosphate solubilizing effects of phosphate solubilizing bacteria PSBHY-3 on pond sediment[J]. Journal of Southern Agri-culture，49（10）： 2096-2102.]

李莎莎，曹煜成，胡曉娟，李卓佳，徐煜，楊鏗，徐創文，文國樑. 2017. 響應面法優化芽孢桿菌（Bacillus sp.）A4的培養參數[J]. 南方水產科學，13（5）： 85-93. doi：10.3969/j.issn.2095-0780. 2017.05.012. [Li S S，Cao Y C，Hu X J，Li Z J，Xu Y，Yang K，Xu C W，Wen G L. 2017. Optimization for cultivation parameters of Bacillus sp. A4 using response surface methodology[J]. South China Fisheries Science，13（5）： 85-93.]

劉惠知，孔利華，周映華，黃建軍. 2009. 益生菌枯草芽孢桿菌發酵培養基及條件的優化[J]. 飼料研究，（7）： 32-34. doi： 10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2009.07.012. [Liu H Z，Kong L H，Zhou Y H，Huang J J. 2009. Optimization of fermentation medium and conditions for probiotic Bacillus subtilis[J]. Feed Research，（7）： 32-34.]

劉孝竹，李卓佳，曹煜成，文國樑. 2009. 低鹽度養殖池塘常見浮游微藻的種類組成、數量及優勢種群變動[J]. 南方水產，5（1）： 9-16. doi：10.3969/j.issn.1673-2227.2009.01. 002. [Liu X Z，Li Z J，Cao Y C，Wen G L. 2009. Common species composition，quantity variation and dominant species of planktonic microalgae in low salinity culture ponds[J]. South China Fisheries Science，5（1）： 9-16.]

錢文靜，胡永紅，楊文革. 2018. 響應面法優化生物活菌劑解淀粉芽孢桿菌JT-84發酵工藝[J]. 河北農業科學，22（6）：65-72. doi：10.16318/j.cnki.hbnykx.2018.06.017. [Qian W J，Hu Y H，Yang W G. 2018. Fermentation process optimization of batericidal activity of Bacillus amyloliquefaciens JT-84 by response surface methodology[J]. Journal of Hebei Agricultural Science，22（6）： 65-72.]

單哲，李敬盼，孫鎮平，劉洪紅，王忠敏，孫偉. 2015. 解淀粉芽孢桿菌液體發酵動態變化規律的研究[J]. 飼料研究，（7）： 65-69. doi：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2015.07. 018. [Shan Z，Li J P，Sun Z P，Liu H H，Wang Z M，Sun W. 2015. Research on the dynamic change of Bacillus amylolyticus liquid fermentation[J]. Feed Research，（7）： 65-69.]

宋瑛瑛，黃麗，唐明. 2016. 不同碳源和氮源對4種深色有隔內生真菌生長的影響[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），44（3）： 181-187. doi：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016. 03.025. [Song Y Y，Huang L，Tang M. 2016. Effects of different carbon and nitrogen sources on growth of 4 dark septate endophytes[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），44（3）： 181-187.]

孫鎮平，劉洪紅，王忠敏，孫偉，單哲，李敬盼. 2014. 解淀粉芽孢桿菌固體培養條件優化[J]. 揚州大學學報（農業與生命科學版），35（1）： 27-30. doi：10.16872/j.cnki.1671-4652. 2014.01.009. [Sun Z P，Liu H H，Wang Z M，Sun W，Shan Z，Li J P. 2014. Study on optimal solid culture condition of Bacillus amyloliquefaciens[J]. Journal of Yang-zhou University（Agricultural and Life Science Edition），35（1）： 27-30.]

王星云，宋卡魏，張榮意. 2007. 枯草芽孢桿菌菌劑的開發應用[J]. 農業研究與應用，（2）： 32-35. doi：10.3969/j.issn. 2095-0764.2007.02.015. [Wang X Y，Song K W，Zhang R Y. 2007. Development and application of Bacillus subtilis[J]. Agricultural Research and Application，（2）： 32-35.]

吳鵬飛，張冬明，郝麗虹，漆智平. 2008. 解磷微生物研究現狀及展望[J]. 中國農業科技導報，10（3）： 40-46. doi：10. 3969/j.issn.1008-0864.2008.03.007. [Wu P F，Zhang D M，Hao L H，Qi Z P. 2008. Status quo and prospects of phospate-soluble microorgnisms[J]. Journal of Agricultural Science and Technology，10（3）： 40-46.]

夏立群，王蓓，夏洪麗，黃郁蔥，簡紀常，魯義善. 2013. 鰤魚諾卡氏菌培養條件及培養基的優化[J]. 南方水產科學，9（3）： 51-56. doi：10.3969/j.issn.2095-0780.2013.03.009. [Xia L Q，Wang B，Xia H L，Huang Y C，Jian J C，Lu Y S. 2013.Optimal culture conditions and medium of Nocardia seriolea[J]. South China Fisheries Science，9（3）： 51-56.]

許翠，熊秋，吳佳，高夢祥. 2015. 酵母膏對α溶血性鏈球菌發酵代謝甘露聚糖肽的影響[J]. 食品工業科技，36（5）： 185-188. doi：10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.030. [Xu C，Xiong Q，Wu J，Gao M X. 2015. Effect of yeast extract on Mannan peptide by Hemolytic streptococcus[J]. Science and Technology of Food Industry，36（5）： 185-188.]

楊鶯鶯，李卓佳，陳永青，楊鏗，文國樑，丁賢. 2005. 益生菌D-1液體發酵工藝的研究[J]. 南方水產，1（6）： 44-49. doi：10.3969/j.issn.2095-0780.2005.06.007. [Yang Y Y，Li Z J，Chen Y Q，Yang K，Wen G L，Ding X. 2005. Fermentation technology of probiotic strain D-1[J]. South China Fisheries Science，1（6）： 44-49.]

楊鶯鶯，楊鏗，梁曉華，陳永青. 2015. 解磷菌YC4對養殖環境條件的適應性及其溶磷效果[J]. 中國漁業質量與標準，5（4）： 23-28. [Yang Y Y，Yang K，Liang X H，Chen Y Q. 2015. Adaptability of phosphate solubilizing bacteria YC4 to aquaculture environment and its effect of phosphate solubilization[J]. Chinese Fishery Quality and Standards，5（4）： 23-28.]

趙能，原曉龍，陳劍，楊宇明，王娟，王毅. 2016. 不同碳氮源對牛樟芝菌絲體生長的影響[J]. 西部林業科學，45（4）： 7-12. doi：10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.04.002. [Zhao N，Yuan X L，Chen J，Yang Y M，Wang J，Wang Y. 2016. Effect of different carbon and nitrogen sources on mycelia growth of Antrodia cinnamomea[J]. Journal of West China Forestry Science，45（4）： 7-12.]

鄭雙鳳，譚武貴，豐來，羅志威，徐滔明，張冬雪，譚石勇. 2017. 枯草芽孢桿菌NTGB-178高產芽孢發酵工藝優化[J]. 南京農業大學學報，40（6）： 1031-1040. doi：10.7685/jnau.201702023. [Zheng S F，Tan W G，Feng L，Luo Z W，Xu T M，Zhang D X，Tan S Y. 2017. Optimization of sporulation fermentation process of Bacillus subtilis NTGB-178[J]. Journal of Nanjing Agricultural University，40（6）： 1031-1040.]

Amanullah，Khan A. 2015. Phosphorus and compost management influence Maize （Zea mays） productivity under semia-rid condition with and without phosphate solubilizing bacteria[J]. Frontiers in Plant Science，6：1083. doi：10. 3369/fpls.2015.01083.

Ameni B Z，Darine T，Imen A，Fathi B，Ricardo A，Ridha M. 2020. Inoculation with elite strains of phosphate-solubili-zing bacteria enhances the effectiveness of fertilization with rock phosphates[J]. Geomicrobiology Journal，37（1）： 22-30. doi：10.1080/01490451.2019.1658826.

Bakhshandeh E，Rahimian H，Pirdashti H，Nematzadeh G A. 2015. Evaluation of phosphate-solubilizing bacteria on the growth and grain yield of rice （Oryza sativa L.） cropped in northern Iran[J]. Journal of Applied Microbiology，119（5）： 1371-1382. doi：10.1111/jam.12938.

Behle R，Jackson M A. 2014. Effect of fermentation media on the production，efficacy，and storage stability of Metarhiziun brunneum microsclerotia formulated as a prototype granule[J]. Journal of Economic Entomology，107（2）： 582-590. doi：10.1603/EC13426.

Golterman H L. 1996. Fractionation of sediment phosphate with chelating compounds： A simplification，and compa-rison with methods[J]. Hydrobiologia，335（1）： 87-95. doi：10.1007/BF00013687.

Jana B B. 2007. Distribution pattern and role of phosphate solubilizing bacteria in the enhancement of fertilizer value of rock phosphate in aquaculture ponds： State-of-the-art[C]//First International Meeting on Microbial Phosphate Solubilization. Developments in Plant and Soil Sciences Book Series（DPSS，volume 102）： 229-238. doi：10.1007/978-1-4020-5765-6_34.

Li H X，Ding X Y，Chen C，Zheng X N，Han H，Li C N，Gong J Y，Xu T，Li Q X，Ding G C，Li J. 2019. Enrichment of phosphate solubilizing bacteria during late develop-mental stages of eggplant（Solanum melongena L.）[J]. Microbiology Ecology，95（3）： fiz023. doi：10.1093/femsec/fiz023.

Sahu S N，Jana B B. 2000. Enhancement of the fertilizer value of rock phosphate engineered through phosphate-solubilizing bacteria[J]. Ecological Engineering，15（1-2）： 27-39. doi：10.1016/S0925-8574（99）00013-0.

Tomblom E，Rydin E. 1998. Bacterial and phosphorus dyna-mics inprofundal Lake Erken sediments following the deposition of diatoms： A laboratory study[J]. Hydrobiologia，364（1）： 55-63. doi：10.1023/A：1003199505396.

（責任編輯 鄧慧靈）