基于高通量測序分析間作貓豆對甘蔗根際土壤微生物的影響

毛蓮英 李海碧 桂意云 張榮華 楊榮仲 周會 韋金菊 劉昔輝

摘要：【目的】探究甘蔗間作貓豆對甘蔗根際土壤微生物多樣性的影響，為改善甘蔗根際土壤微生物群落結構及促進甘蔗生長提供理論參考?！痉椒ā坎捎脝我蛩卦囼炘O計，分析單作甘蔗（CK）和甘蔗間作貓豆（T處理）2種種植方式對甘蔗根際土壤養分的影響，并采用Illumina HiSeq高通量測序技術，在門和屬水平上分析甘蔗根際土壤微生物群落結構，在種水平進行主成分（PCA）分析?！窘Y果】T處理的根際土壤中全氮、全鉀、水解性氮、有效磷和有機質含量均大于CK。T處理的根際土壤中細菌的豐富度和多樣性高于真菌的豐富度和多樣性;T處理的根際土壤中細菌豐富度高于CK，但差異不顯著（P>0.05，下同），其多樣性顯著高于CK（P<0.05，下同）;T處理的根際土壤中真菌的豐富度和多樣性均顯著高于CK。CK和T處理土壤樣品的主要優勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），其相對豐度均大于10.00%，優勢細菌屬分別為水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、游動四孢屬（Luedemannella）、乳桿菌屬（Acidothermus）和布氏桿菌屬（Bryobacte），但T處理根際土壤樣品中水恒桿菌屬、游動四孢屬和乳桿菌屬的相對豐度分別較CK下降2.47%、1.78%和0.68%，其他細菌屬分別增加0.10%～0.86%。CK和T處理根際土壤中優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota），分別為80.00%和92.00%，其次是擔子菌門（Basidiomycota），分別為8.00%和6.00%，排名前3的優勢真菌屬均為戴氏霉屬（Taifanglania）、毛殼屬（Chaetomium）和鐮刀菌屬（Fusarium）。CK和T處理的6份根際土壤樣品在種水平上的主成分（PCA）分析結果顯示，細菌群落PC1的變異為29.37%，PC2的變異為20.26%，二者的總貢獻率為49.63%;真菌群落PC1的變異為33.44%，PC2的變異為27.73%，二者的總貢獻率為56.17%。CK與T處理的細菌群落分別屬于不同象限，CK位于第1和第3象限，而T處理位于第2和第4象限?！窘Y論】甘蔗間作貓豆可改善甘蔗根際的土壤養分狀況，改變甘蔗根際微生物的群落結構，提高細菌和真菌的豐富度和多樣性，但未影響優勢菌門的排序。

關鍵詞： 甘蔗;貓豆;間作;根際;土壤微生物;高通量測序;群落結構

中圖分類號： S556.106.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）02-0332-09

Abstract：【Objective】The effects of Mucuna pruriens var. utilis intercropping with sugarcane on the microbial diversity in the rhizosphere of sugarcane were investigated，and a theoretical foundation was laid for improving the soil microbial community structure of M. pruriens intercropping with sugarcane and promoting the growth of sugarcane. 【Method】A single-factor design experiment was conducted to analyze the microbial community structure of sugarcane rhizosphere soil at the phylum and genus levels by Illumina HiSeq high-throughput sequencing technology under the two planting methods of sugarcane monoculture（CK） and sugarcane intercropping M. pruriens（T treatment），and principal component analysis （PCA） to determine the effect of intercropping M. pruriens on sugarcane rhizosphere soil nutrients. 【Result】The contents of total nitrogen，total potassium，hydrolyzable nitrogen，available phosphorus and organic matter in rhizosphere soil of T treatment were higher than those of CK treatment. The richness and diversity of bacteria in the rhizosphere soil of T treatment was higher than that of fungi. The bacterial richness of? bacteria in the rhizosphere soil of Ttreatment was higher than that of CK，but the difference was not significant（P>0.05， the same below）， its diversity was significantly higher than that of CK（P<0.05， the same below）. The abundance and diversity of bacteria in the rhizosphere soil under T treatment were significantly higher than that of CK.The dominant phylum of bacteria in CK and T treatments were Proteobacteria，Actinobacteria，Chloroflexi and Acidobacteria，and their relative abundances were more than 10.00%. The dominant bacteria genera were Mizugakiibacter，Luedemannella，Actinothermus and Bruyobacte，but the relative abundances of Mizugakiibacter，Luedemannella，Actinothermus decreased by 2.47%， 1.78% and 0.68%， other bacteria increased by 0.10%-0.86% compared to CK under T treatment.? The dominant fungal phyla in the rhizosphere soil of CK and T treatments was Ascomycota，80.00% and 92.00% respectively，followed by Basidiomycota，8.00% and 6.00%，the top three dominant fungi genus all belonged to the genus Taifanglania，Chaetomium and Fusarium. Principal component analysis（PCA） of six root soil samples treated with CK and T showed that the variation of bacterial community PC1 was 29.37%，the variation of PC2 was 20.26%，the total contribution rate of both was 49.63%; the variation of fungal community PC1 was 33.44%，the variation of PC2 was 27.73%，the total contribution rate of both was 56.17%. The bacterial communities of CK and T treatment belonged to different quadrants，respectively，CK was located in the 1st and 3rd quadrants，and T treatment was located in the 2nd and 4th quadrants. 【Conclusion】The results show that intercropping sugarcane with M. pruriens improves the soil nutrient status，changes the microbial community structure，and increases the richness and diversity of bacteria and fungi in sugarcane rhizosphere， but does not affect the sequence of dominant microflora.

Key words： sugarcane; Mucuna pruriens var. utilis; intercropping; rhizosphere; soil microbe; high-throughput sequencing; community structure

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31860350）; National Sugar Industry Technology System Project（CARS-170105）; Central Guides Local Project（Guike ZY20198005）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT006）

0 引言

【研究意義】甘蔗（Saccharum officinarum）為全球重要的糖類和能源作物，是種植行距較寬的作物，目前種植行距多為1.2 m，常與生長快速的作物間作或與生長期短的作物套種可有效改善土壤酶活性，提高土壤微生物數量和多樣性，充分提升養分利用效率及經濟效益（張愛加等，2013;彭東海等，2014;沈雪峰等，2014）。貓豆為一年生豆科黎豆屬草質藤本植物，多分支，根系較發達，葉蔓攀高，覆蓋面廣，有利于保持水土，其根部富含根瘤菌，可有效提高土地肥力（秦祖臻等，2012;韋道鞍，2013;李經成等，2016），適合與其他作物間種。土壤微生物多樣性不僅代表微生物群落的穩定性，同時還反映土壤的生態機制和土壤脅迫對微生物群落的影響，是導致微生物代謝方式和生理功能多樣化的直接原因（彭東海等，2014;張晟等，2019）。因此，探究甘蔗間作貓豆對甘蔗根際微生物多樣性的影響，對改善甘蔗根際土壤菌群結構及促進甘蔗生長具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】據國內外研究報道，甘蔗間作模式多種多樣，主要有甘蔗—蔬菜（如洋蔥、馬鈴薯等）（Bokhtiar et al.，2003）、甘蔗—豆科植物（大豆）（Kamruzzaman and Hasanuzzama，2007）和甘蔗—禾本科植物（玉米）（鄭亞強等，2018）等。研究發現，甘蔗間作大豆后能顯著增加其根際土壤中的真菌和放線菌數量，土壤微生物群落多樣性豐富，蔗田土壤得到有效改善（洪德星，2011;Li et al.，2013;彭東海等，2014），且甘蔗間作大豆后在甘蔗苗期和分蘗期蔗根的內生細菌多樣性均大于單作處理（楊建波，2014）;甘蔗間作玉米后甘蔗根際微生物的群落多樣性和土壤酶活性均高于單作甘蔗（鄭亞強等，2016，2018）;甘蔗與大豆和花生間作能提高根際土壤微生物多樣性和土壤酶活性（邢德峰和任南琪，2006;Vo?í?ková and Baldrian，2013）。上述研究主要利用傳統培養方法或變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術探討甘蔗與不同作物間作對其根際土壤微生物的影響，然而傳統方法培養的微生物無法全面準確地反映根際土壤微生物的多樣性特征（張洪霞等，2009），尤其是DGGE技術僅能分析有限的優勢微生物類群，存在高估物種豐富度及低估微生物群落大小和多樣性的可能，很難檢測出低豐度的土壤微生物類群（Tan et al.，2015）。近年來，高通量測序已成為定量和鑒別微生物群落演替研究的重要工具，尤其是二代高通量測序技術具有測序通量高、試驗過程簡化、速度快和準確率高等優點，能更真實地揭示原位環境中微生物群落的復雜性和多樣性（李慶崗和陶立，2012），已廣泛用于生態系統土壤微生物多樣性研究（Will et al.，2010;井趙斌等，2013）。張東艷等（2017）采用Illumina HiSeq高通量測序技術研究玄參與煙草間作后根際土壤細菌群落結構，結果發現，間作降低了煙草根際土壤細菌豐富度和多樣性，但提高了玄參根際土壤細菌多樣性?！颈狙芯壳腥朦c】目前鮮見有關高通量測序技術對甘蔗間作貓豆后甘蔗根際土壤微生物多樣性進行分析的文獻報道?！緮M解決的關鍵問題】利用Illumina HiSeq高通量測序技術分析甘蔗間作貓豆后甘蔗根際土壤微生物群落結構及多樣性，為改善甘蔗根際土壤菌群結構及促進甘蔗生長提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

試驗在廣西農業科學院甘蔗研究所隆安縣丁當基地進行，前茬作物為單作甘蔗。廣西隆安縣位于廣西西南部，屬南亞熱帶季風氣候。土壤基本理化性質：pH 4.9，有機質26.1 g/kg，水解性氮108 mg/kg，有效磷5.4 mg/kg，速效鉀213.0 mg/kg，全氮11.7 g/kg，全磷4.1 g/kg，全鉀22.2 g/kg。

1. 2 試驗材料

參試甘蔗品種為桂糖46號，貓豆為從斐濟引進品種。2×Taq MasterMix、RNase-Free water、瓊脂糖、TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;引物由南寧國拓生物科技有限公司合成。主要儀器設備：普通PCR儀（Biometra，德國）、Thermo Scientific NanoDrop 2000c微量分光光度計（上海奧陸生物科技有限公司）、DYY-7C核酸電泳儀（北京六一儀器廠）、GS-800凝膠掃描儀（Bio-Rad，美國）、Illumina HiSeq2500 PE250高通量測序儀（Illumina，美國）。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 試驗設計及樣品采集 設甘蔗單作和甘蔗間作貓豆2個處理，每處理設3次重復，共種植6個小區，每小區面積為100 m2。采用五點取樣法從各試驗小區采集深度0～20 cm的根際土壤樣品，將五點的土樣混勻，記作1份根際土壤樣品。單作甘蔗為對照（CK），3個生物學重復分別標記為CK1、CK2和CK3，甘蔗間作貓豆標記為T處理，3個生物學重復分別標記為T1、T2和T3。將6份土壤樣品低溫保存帶回實驗室，去除植物碎葉等雜物。每份土壤樣品再平均分成2份，分別用于土壤理化性質和土壤微生物測定。

1. 3. 2 根際土壤養分含量測定 土壤養分含量按照《土壤分析技術規范》進行測定。

1. 3. 3 基因組DNA提取及PCR擴增 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取土壤樣品的基因組DNA，并利用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。以稀釋后的基因組DNA為模板進行PCR擴增，所用的引物為細菌16S rDNA的V4區引物（515F和806R）和真菌ITS的ITS 1區引物（ITS5-1737F和ITS2-2043R）（李善家等，2020）。將PCR產物進行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并利用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1. 3. 4 文庫構建及測序數據處理 用建庫試劑盒構建文庫，基于Illumina HiSeq測序平臺進行測序。對原始數據進行拆分、截去引物序列，利用FLASH軟件對每個數據進行拼接（Mago? and Salzberg，2011）。經過嚴格過濾處理得到高質量的Tags數據（Clean tags）（Bokulich et al.，2012）。使用Qiime V1.7.0的Tags質控流程得到最終的有效數據（Effe-ctive tags）（Caporaso et al.，2010）。

1. 3. 5 OTU聚類和物種注釋 利用QIIME V1.7.0對所有樣品的Effective tags進行聚類分析，同時依據其算法原則，篩選出作為OTUs的代表序列，并進行物種注釋分析（黃萍等，2020）。參照龔賽（2017）的方法進行后續Alpha多樣性和Beta多樣性分析。

1. 4 統計分析

采用Qiime Version 1.7.0計算Unifrac距離，并構建非加權組平均法（UPGMA）聚類樹。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制PCA、PCoA和NMDS圖。

2 結果與分析

2. 1 單作甘蔗與甘蔗間作貓豆的根際土壤養分含量比較結果

由表1可知，T處理的根際土壤中全氮、全鉀、水解性氮、有效磷和有機質含量均高于CK的根際土壤，其中，有效磷和有機質含量分別比CK的根際土壤顯著增加86.7%和16.0%（P<0.05，下同），表明甘蔗間作貓豆有利于提高甘蔗根際土壤的全氮、全鉀、水解性氮、有效磷和有機質含量。

2. 2 單作甘蔗和甘蔗間作貓豆的甘蔗根際土壤微生物高通量測序結果

將在Illumina HiSeq測序平臺得到的測序數據進行拼接和過濾處理，得到Clean tags，再經嵌合體過濾后得到可用于后續分析的Effective tags，對所有樣品的Effective tags進行聚類分析，以97%的一致性（Identity）將其聚類成為OTUs。6份根際土壤樣品的細菌16S rDNA測序結果（表2）顯示，CK的平均Effe-ctive tags為156376個，聚類成3185個OTUs，T處理的平均Effective tags為186446個，聚類成3184個OTUs。6份根際土壤樣品的真菌ITS測序結果（表2）顯示，CK的平均Effective tags為194892個，聚類成751個OTUs，T處理的平均Effective tags為213566個，聚類成889個OTUs。說明甘蔗間作貓豆后根際土壤中細菌的不相似序列數量與單作甘蔗無顯著差異（P>0.05，下同），真菌的不相似序列數量顯著高于單作甘蔗。

稀釋曲線可反映樣品的取樣深度，用以評價測序量覆蓋所有類群的程度。從圖1和圖2可看出，土壤樣品的微生物稀釋曲線基本趨于平緩，但仍未達到飽和，說明取樣基本合理，微生物群落結構的置信度較高，能較真實地反映土壤微生物群落構成。

2. 3 單作甘蔗和甘蔗間作貓豆的甘蔗根際土壤微生物多樣性指數分析結果

土壤細菌和真菌群落多樣性指數測定結果如表3和表4所示。6個土壤樣品的覆蓋率指數均大于0.990，表明樣品中序列未被測到的概率較低，測序結果已覆蓋測試樣品中的絕大部分物種。CK和T處理的細菌平均ACE指數和Chao1指數均較大，且無顯著差異，說明CK和T處理的甘蔗根際土壤中細菌多樣性均非常豐富。與CK甘蔗根際土壤相比，T處理的甘蔗根際土壤中細菌和真菌的豐富度均有所增加。T處理的細菌和真菌平均Shannon指數顯著高于CK，說明甘蔗間作貓豆會增加土壤微生物均勻度?？傮w來看，CK和T處理的甘蔗根際土壤中，細菌的豐富度均高于真菌;T處理的細菌豐富度高于CK，但差異不顯著，T處理的細菌多樣性顯著高于CK;T處理的真菌豐富度和多樣性顯著高于CK。

2. 4 單作甘蔗和甘蔗間作貓豆的甘蔗根際土壤門水平的群落結構分析結果

由于土壤樣品中所檢測出的微生物種類繁多，許多種類含量極少，不能與含量多的物種表示在同一個圖中，故選擇排名前10名的細菌門、相對豐度大于0.001%的真菌門，以相對豐度為縱坐標，繪制柱形圖。由圖3可知，CK和T處理根際土壤的前10個細菌門總相對豐度分別占土壤細菌門總數的95.71%和96.27%;CK和T處理根際土壤中的主要優勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），其相對豐度均大于10.00%，這4個細菌門總相對豐度分別占土壤細菌門總數的81.36%和85.61%;其次為芽單胞細菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）和奇古菌門（Thaumarchaeota），這6個細菌門總相對豐度分別占土壤細菌門總數的14.35%和10.66%;與CK根際土壤相比，T處理根際土壤中排名前3的變形菌門、放線菌門和綠彎菌門，分別降低1.49%、1.95%和2.21%，其他細菌門分別增加0.17%～1.58%。

由圖4可知，CK和T處理根際土壤中優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota），分別占土壤真菌門總數的80.00%和92.00%，其次是擔子菌門（Basidiomycota），分別占土壤真菌門總數的8.55%和6.22%，以接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）和球囊菌門（Glomeromycota）相對豐度量較少;與CK土壤樣品相比，T處理根際土壤中優勢真菌門子囊菌門增加12.00%，擔子菌門下降2.33%。

2. 5 單作甘蔗和甘蔗間作貓豆的甘蔗根際土壤屬水平的群落結構分析結果

對根際土壤前10個優勢菌屬相對豐度進行分析，結果如圖5所示。CK和T處理根際土壤中的優勢細菌屬分別為水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、游動四孢屬（Luedemannella）、乳桿菌屬（Acidothermus）和布氏桿菌屬（Bryobacte）。但與CK根際土壤相比，T處理根際土壤樣品中水恒桿菌屬、游動四孢屬和乳桿菌屬的相對豐度分別下降2.47%、1.78%和0.68%，其他細菌屬分別增加0.10%～0.86%。

對根際土壤優勢真菌屬相對豐度進行分析，結果如圖6所示。CK和T處理根際土壤中排名前3的優勢真菌屬均為戴氏霉屬（Taifanglania）、毛殼屬（Chaetomium）和鐮刀菌屬（Fusarium）。且CK與T處理根際土壤中相對豐度相差較大（1.12%～2.05%）的真菌屬為小蘑菇屬（Micropsalliota）、鬼筆屬（Phallus）、黑團孢屬（Periconia）、圓孢霉屬（Staphylotrichum）和裸節菌屬（Talaromyces）。

2. 6 單作甘蔗和甘蔗間作貓豆的甘蔗根際土壤微生物群落的主成分分析結果

對CK和T處理的6份根際土壤樣品細菌群落進行種水平上的主成分（PCA）分析，結果如圖7所示。細菌群落PC1的變異為29.37%，PC2的變異為20.26%，二者的總貢獻率為49.63%。如圖8所示，真菌群落PC1的變異為33.44%，PC2的變異為22.73%，二者的總貢獻率為56.17%。CK與T處理的細菌群落分別屬于不同象限，CK位于第1和第3象限，而T處理位于第2和第4象限，表明甘蔗間作貓豆改變了根際土壤微生物群落結構。

3 討論

甘蔗間作大豆可提高甘蔗的株高和葉長，根際土壤中碳、氮和磷含量大于單作甘蔗（卜俊瑤等，2020）。間作大豆改變土壤的pH，使其接近于中性，更適于甘蔗生長，還會增加土壤中氮的含量（農寧娟，2015）。甘蔗間作花生后0～20 cm土壤中全氮、全鉀、有效磷、有機質和pH均大于單作甘蔗（唐秀梅等，2020）。宿根蔗與大豆間作可增加甘蔗有效莖數，提高甘蔗產量（覃劉東等，2019）。本研究結果也發現，甘蔗間作貓豆可有效提高甘蔗根際土壤中的全氮、全鉀、水解性氮、有效磷和有機質含量，與上述研究結果相似。

土壤微生物是植物—土壤生態系統的重要組成成分，其數量及多樣性對維持土壤生態系統的穩定具有重要作用，并在一定程度上體現土壤的肥力和酶活性（徐麗慧等，2017;丁麗等，2020）。其中，細菌占整個土壤微生物群落的70%～90%，真菌在土壤微生物群落中所占比例僅次于細菌（任奎瑜等，2020）。與從功能入手的傳統微生物研究方法相比，高通量測序能更全面準確地從遺傳物質上識別微生物的種屬。本研究對甘蔗根際土壤細菌16S rRNA基因V4區域和真菌ITS 1區域進行高通量測序，結果發現，甘蔗間作貓豆后甘蔗根際土壤的Shannon和ACE指數均較單作甘蔗高，且細菌的豐富度遠大于真菌的豐富度;在這2種種植模式下甘蔗根際土壤中細菌主要門類為變形菌門、放線菌門、綠彎菌門和酸桿菌門，真菌主要門類為子囊菌門和擔子菌門;細菌主要優勢菌屬為水恒桿菌屬、游動四孢屬、乳桿菌屬和布氏桿菌屬，真菌主要優勢菌屬為戴氏霉屬、毛殼屬和鐮刀菌屬。彭東海等（2014）研究表明，甘蔗間作大豆后甘蔗根際土壤固氮細菌的Shannon指數高于單作甘蔗的根際土壤，可提高固氮細菌的多樣性和某些固氮細菌的優勢度，但對群落物種的優勢度影響較小。本研究也發現，甘蔗間作貓豆后甘蔗根際土壤中細菌和真菌在門、屬水平上排名靠前的優勢菌群的相對豐度略微降低，而其余的優勢菌略微增加，說明甘蔗間作貓豆使根際土壤中的微生物發生趨向性改變，且使各菌群結構變得均勻。目前關于間作對作物根際土壤微生物影響變化的觀點不盡相同。Wang等（2012）研究發現，小麥間作豆科植物不影響小麥根際土壤微生物的群落結構;張曉崗等（2020）研究證明馬鈴薯間作玉米栽培后能有效改善真菌菌群結構，有害致病真菌菌屬消失或比例下降，隨之出現一些有益于作物生長的功能真菌;Wang等（2007）研究認為，在酸性土壤地上小麥間作蕓薹屬植物可改變小麥根際微生物群落結構，土壤細菌和放線菌的豐富度減少，真菌的豐富度增加。本研究中，甘蔗間作貓豆后甘蔗根際土壤中細菌和真菌的豐富度有所增加，且土壤微生物群落結構發生改變，與甘蔗間作玉米的研究結果（鄭亞強等，2016）相似。根際土壤微生物群落結構改變的具體原因尚待研究。

4 結論

甘蔗間作貓豆可改善甘蔗根際的土壤養分狀況，改變甘蔗根際微生物的群落結構，提高細菌和真菌的豐富度和多樣性，但未影響優勢菌門的排序。

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（責任編輯? 陳 燕）