葉酸水平與心腦血管疾病終點事件的關聯性及性別差異研究

楊志康， 木拉力別克·黑扎提， 王 林， 李 梅， 王中蓉， 熱依拉·阿不都熱依木，吳自豪， 潘鳳瑜， 洪 靜， 李南方

心腦血管疾病(cardio-cerebrovascular disease,CVD)是世界范圍內造成死亡的首要病因，據世界衛生組織報告[1]，全球每年約有30%的死亡事件與CVD相關，其中大部分出現在發展中國家。我國作為最大的發展中國家，承擔著較重的CVD防控負擔[2]。高血壓、糖尿病、抽煙、肥胖、體育運動等危險因素與CVD之間的關聯性已得到廣泛證實，而機體葉酸水平與CVD之間的關系近年來也受到研究者的關注。有研究[3-5]提出葉酸缺乏會增加CVD的發生風險，但研究結論尚不一致。與西方發達國家不同，我國未施行全民葉酸補充計劃，這使得我國約有40%的北方人口及6%的南方人口存在葉酸缺乏(<3 ng/ml)的情況，而其中又以新疆人群葉酸缺乏情況較為嚴重[6]。鑒此，本研究以新疆人群作為研究對象探討葉酸水平與CVD發生的關聯性，以期為該地區的CVD防控提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 本研究基于2014年1月至2014年12月我中心的一項課題項目基礎上開展，通過多級分層隨機抽樣的方法抽選研究對象[7]：將額敏縣分為農區、牧區和城區，并以每個地區的2個鎮及所選鎮的2個鄉作為調查點。納入標準：(1)年齡≥15歲；(2)在本地居住時間超過6個月的常駐居民；(3)知情同意參與本研究并能配合調查問卷、體格檢查及血液標本采集者。排除標準：(1)腎功能不全、惡性貧血、惡性腫瘤患者；(2)孕婦；(3)在過去1個月服用過抗驚厥藥物、抗結核藥物、避孕藥、多巴胺藥物及葉酸補充劑者；(4)既往有CVD病史。本研究共有1 926人完成了問卷調查、體格檢查及血液樣本采集，其中信息完整、葉酸檢測合格的1 807人，排除既往有CVD病史的16人，最終納入1 791名研究對象進行隨訪。

1.2基線數據采集 (1)人口學基本信息采集，由培訓合格的調查員進行面對面問卷調查，包括年齡、性別、民族、受教育水平及疾病史等。(2)體格檢查，人體測量學指標由調查員按照標準測量方法獲得，包括身高、體重、血壓、體質量指數(Body Mass Index,BMI)等。(3)血液指標檢測，采集研究對象清晨空腹靜脈血3 ml，并在30 min內進行血清分離(3 000 r/min，離心10 min)，儲存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。由新疆維吾爾自治區人民醫院檢驗科完成葉酸(儀器：Beckman-UniCel D×I 800)和同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)(儀器：DIRUI-CS-T300)的檢測。

1.3隨訪 隨訪開始于2016年1月，最近的一次隨訪結束于2019年12月，共1 687人完成了隨訪，失訪率約為5.8%。通過現場調查的方式實施隨訪，為了提高研究對象的主動參與性，隨訪與當地的年度全民體檢地點和時間一致。未能參加現場調查的隨訪對象則通過電話訪問、入戶調查、于當地縣醫院檢索住院信息等方式完成隨訪，同時向家屬確認研究對象的存活情況、死亡原因及死亡時間。同時還調查了研究對象的長期藥品使用情況。以葉酸水平三分位將研究人群共分為三組：<4.55 ng/ml組(組1，569例)、4.55～6.96 ng/ml組(組2，560例)和>6.96 ng/ml組(組3，558例)。

1.4相關指標定義 (1)CVD終點事件：包括首發的腦血管事件、心絞痛、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、需要住院治療的心衰、檢查發現的血管狹窄(腎動脈、上下肢動脈及頸動脈)及CVD相關死亡。研究對象需回答“疾病是否被區縣及以上級別醫院診斷過”“是否有支持診斷的檢查報告結果”。為了提升終點事件報告的質量，僅研究對象回答“是”的終點事件被用于分析。(2)抽煙：定義為過去累計吸煙量超過20包香煙，目前正在吸煙。(3)飲酒：定義為在調查的前30 d內的每周至少飲酒1次。

1.5統計學方法 應用SPSS25.0統計軟件進行單因素和多因素Cox回歸分析。應用網頁工具(http://www.dagitty.net)進行基于因果關系的有向無環圖(Directed Acyclic Graph,DAG)分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CVD終點事件的單因素Cox回歸分析結果 在隨訪過程中共有143人發生了CVD終點事件，其中腦卒中和心梗占72.7%(104/143)。單因素Cox回歸分析結果顯示，年齡、Hcy水平、文化水平、婚姻狀態、職業、抽煙、飲酒、合并高血壓、合并糖尿病與CVD終點事件的發生存在關聯(P<0.05)。見表1。

表1 CVD終點事件的單因素Cox回歸分析結果

續表1

2.2基于因果關系的DAG分析結果 通過開發者提供的網頁工具(http://www.dagitty.net)分析變量間的因果關系，獲得最小充分必要校正集：性別、年齡、BMI、腹型肥胖、民族、文化水平、婚姻狀態、職業、抽煙、飲酒、合并高血壓及Hcy水平。DAG見圖1。

圖1 DAG分析結果圖

2.3多因素Cox回歸分析結果 根據單因素Cox回歸分析結果，對年齡、Hcy、文化水平、婚姻狀態、職業、抽煙、飲酒、合并高血壓、合并糖尿病進行校正，多因素Cox回歸分析結果顯示，葉酸與CVD終點事件的發生無顯著關聯(P>0.05)。根據DAG分析結果，對性別、年齡、BMI、腹型肥胖、民族、文化水平、婚姻狀態、職業、抽煙、飲酒、合并高血壓、Hcy水平進行校正，多因素Cox回歸分析結果顯示，與組2比較，組1發生CVD終點事件的風險更高(P<0.05)。見表2。

表2 多因素Cox回歸分析結果

2.4以性別分層的多因素Cox回歸分析結果 對于男性，與組3相比，組1發生CVD終點事件的風險更高(HR=2.57，P=0.007)；其他組間比較風險差異無統計學意義(P>0.05)。對于女性，與組2相比，組1和組3發生CVD終點事件的風險均更高(HR=2.11，P=0.026；HR=1.84，P=0.039)。見表3。

表3 以性別分層的多因素Cox回歸分析結果

3 討論

3.1CVD是危害人類健康的主要病因，當學者們圍繞傳統危險因素進行激烈討論時，葉酸缺乏也被認為與先天性神經管缺陷的發生具有關聯[8]，而近年的研究也指出其可能增加了CVD的患病及相關死亡的風險，但是目前的研究結果并不一致。本研究結果提示，低葉酸水平增加了CVD終點事件的發生風險。一項涉及2.7萬人，平均隨訪時間為4.4年的中國人群隊列研究[9]結果顯示，葉酸缺乏組(<4 ng/ml)患冠心病的風險為非缺乏組的1.33倍。而本研究發現，與葉酸4.55～6.96 ng/ml組比較，<4.55 ng/ml組發生CVD終點事件的風險更高(HR=1.56)。

3.2血清葉酸濃度在不同性別間存在差異[10]。日本的一項關于葉酸水平與精神分裂癥的橫斷面調查[11]提出，有必要進行基于性別的葉酸水平與疾病的關聯性分析。但目前，關于葉酸水平與CVD終點事件的關聯性研究仍鮮有。本研究就此進行了補充，結果提示，不論性別情況，低葉酸水平均為促進CVD終點事件發生的危險因素；而對于女性人群，過高或過低的葉酸水平均促進了CVD終點事件的發生。在2017年，有學者發現較高的葉酸水平會升高冠心病的發生風險(OR=1.85，95%CI：1.56～2.20)[12]。而美國學者Nkemjika等[13]通過隊列研究發現，較高或較低的葉酸水平均可增加CVD死亡風險。而本研究結果提示，葉酸水平與CVD終點事件的關聯存在性別差異，這也部分解釋了前期關于葉酸水平與CVD發病及死亡關聯存在不一致的結論。有研究[14]認為可將葉酸作為谷物的添加成分預防CVD的發生，臨床上也常常將葉酸片等B族維生素制劑作為高Hcy患者的CVD二級預防藥物。本研究結果提示在進行這些干預前應充分考慮性別差異。

3.3葉酸不足可以通過影響血管內皮的功能、增加胰島素抵抗、干擾DNA的甲基化過程和誘導Hcy水平升高等途徑損傷心腦血管系統[15-16]，其中高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HHcy)作為葉酸缺乏的主要結果，被大量的研究認為是促發CVD終點事件的獨立危險因素[17]。而本研究在校正了Hcy水平后仍顯示葉酸水平與CVD終點事件存在顯著關聯，提示兩者可能存在獨立于Hcy的相關關系，這與Morrison等[18]的研究結果相似。對于高葉酸導致CVD終點事件發生風險升高的機制，既往有研究認為這與高葉酸濃度導致非結合葉酸水平的急劇上升，進而加快葉酸降解速度有關[19]。高濃度葉酸通過上調甲基化水平導致DNA和組織蛋白的表觀遺傳修飾異常，從而影響基因的表達，這種損傷對上皮細胞等快速增殖組織影響明顯。在血管粥樣硬化的病理機制中，甲基化異常促進了血管平滑肌細胞的增殖和遷移這一重要過程[20]。

3.4本研究采用自然人群隊列研究設計，能夠明確葉酸水平與CVD終點事件的因果關系，同時，我國目前尚未施行全民葉酸補充計劃，國民葉酸水平處于自然狀態，較少受到干擾。但是，本研究也存在一些不足之處，如隨訪時間仍較短，需延長隨訪時間以進一步明確結論。

綜上所述，低葉酸水平與發生CVD終點事件的風險增加有關，而對于女性，較高的葉酸水平也同樣會增加此類事件發生的風險。因此，在考慮通過補充葉酸預防CVD時應考慮性別差異的因素。