KLF5轉錄因子對預測乳癌肺轉移的臨床意義

劉鑫 徐靜 綦瑤 林高陽 王慧哲 鄒曉

[摘要] 目的 探討Kruppel樣因子5（KLF5）及其下游基因在乳癌組織中的表達，分析其與乳癌病理特點的相關性及在預測乳癌肺轉移中的臨床意義。

方法 應用免疫組織化學方法，檢測乳癌肺轉移乳癌組織（35例）、乳癌無肺轉移乳癌組織（35例）、乳腺良性腫瘤組織（20例）及乳癌肺轉移原發灶癌旁正常組織（20例）KLF5、腫瘤壞死因子-α誘導蛋白2（TNFAIP2）和β-連環蛋白（β-catenin）表達，分析各因子表達與乳癌肺轉移病人臨床病理特征間的關系，Kaplan-Meier生存分析模型分析各因子表達與乳癌病人5年無遠處轉移生存率（DFS）及總生存率（OS）的相關性，單因素卡方檢驗和多因素二元Logistic回歸模型分析KLF5、TNFAIP2和β-catenin對乳癌肺轉移風險的預測價值。

結果 乳癌肺轉移組KLF5（χ2=25.881，P<0.01）、TNFAIP2（χ2=23.669，P<0.01）和β-catenin（P=0.002）陽性表達明顯高于其他3組，乳癌肺轉移組KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達與組織學分級、脈管內癌栓有關（P=0.001～0.048）;與年齡、分子亞型、ER、PR、HER-2、Ki67及生存狀態無關（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，乳癌病人KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達與DFS（χ2=5.371～7.084，P<0.05）、OS（χ2=4.152～7.670，P<0.05）顯著相關。單因素和多因素分析表明，KLF5表達是乳癌發生肺轉移的獨立危險因素（HR=3.246，95%CI=1.197～12.046，P=0.034）。

結論 KLF5、TNFAIP2和β-catenin在乳癌肺轉移乳癌組織中高表達且KLF5可能為預測乳癌肺轉移風險的分子標志物。

[關鍵詞] 乳房腫瘤;腫瘤轉移;Kruppel樣轉錄因子類;生物標記，腫瘤

[中圖分類號] R73-37

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0339-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.121

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1618.003.html;2021-06-29 09：38：39

CLINICAL SIGNIFICANCE OF KRUPPEL-LIKE FACTOR 5 TRANSCRIPTION FACTOR IN PREDICTING LUNG METASTASIS OF BREAST CANCER

LIU Xin， XU Jing， QI Yao， LIN Gaoyang，? WANG Huizhe， ZOU Xiao

（Department of Breast Surgery， Qingdao University Affiliated Central Hospital， Qingdao 266042， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression of Kruppel-like factor 5 （KLF5） and its downstream genes in breast cancer tissue， as well as their association with the pathological features of breast cancer and their clinical significance in predicting lung metastasis of breast cancer.

Methods Immunohistochemistry was used to measure the expression of KLF5， TNF-α-induced protein 2 （TNFAIP2）， and β-catenin in breast cancer tissue with lung metastasis （35 cases）， breast cancer tissues without lung metastasis （35 cases）， benign breast tumor tissue （20 cases）， and adjacent breast tissue of breast cancer with primary lung metastasis （20 cases）， and the association of the expression of each factor with the clinicopathological features of patients with lung metastasis of breast cancer was analyzed. The Kaplan-Meier survival analysis model was used to investigate the correlation of the expression of each factor with 5-year distant metastasis-free survival （DFS） and overall survival （OS） of patients with breast cancer， and the univariate chi-square test and the multivariate binary logistic regression analysis were used to analyze the value of KLF5， TNFAIP2， and β-catenin in predicting the risk of lung metastasis of breast cancer.

Results Compared with the other three groups， the breast cancer+lung metastasis group had significantly higher positive expression rates of KLF5 （χ2=25.881，P<0.01）， TNFAIP2 （χ2=23.669，P<0.01）， and β-catenin （P=0.002）. In the breast cancer+lung metastasis group， the expression of KLF5， TNFAIP2， and β-catenin was associated with histological grade and intravascular tumor thrombus （P=0.001-0.048） and was not associated with age， molecular subtype， ER， PR， HER-2， Ki67， and survival status （P>0.05）. The Kaplan-Meier survival analysis showed that in breast cancer patients， the expression of KLF5， TNFAIP2， and β-catenin was significantly asso-

ciated with DFS （χ2=5.371-7.084，P<0.05） and OS （χ2=4.152-7.670，P<0.05）.

The univariate and multivariate analyses showed that KLF5 expression was an independent risk factor for lung metastasis of breast cancer （HR=3.246，95%CI=1.197-12.046，P=0.034）.

Conclusion KLF5， TNFAIP2， and β-catenin are highly expressed in breast cancer tissue with lung metastasis， and KLF5 can be used as a molecular marker for predicting the risk of lung metastasis of breast cancer.

[KEY WORDS]breast neoplasms; neoplasm metastasis; kruppel-like transcription factors; biomarkers， tumor

乳癌目前仍是全球女性中最常見的惡性腫瘤，發病率、死亡率持續上升，為僅次于肺癌的女性癌癥死亡的第二大原因[1-2]。乳癌綜合治療模式的出現使部分早期、局部晚期、局部復發病人被治愈，而一些病人在診斷時已出現遠處轉移，5年生存率僅約20%[3]。90%乳癌病人的死亡源于癌轉移。乳癌細胞優先侵及肺、骨、肝、腦等器官，其中肺轉移治療效果最差，中位生存期僅22個月，在死亡的轉移性乳癌病人中肺轉移占60%～70%[4-5]。研究乳癌肺轉移的機制，尋找更敏感高效的預測分子標志物和新的治療方法是該領域的核心問題。

Kruppel樣因子5（KLF5）是一種含有鋅指結構的轉錄因子，在腫瘤發生發展中調控大量基因的表達，在聲門上型喉癌淋巴結轉移、腎透明細胞癌以及前列腺癌等多種腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[6]。然而，目前關于KLF5及其下游基因表達對乳癌肺轉移風險預測作用的研究尚無。本研究通過免疫組織化學的方法檢測 KLF5、腫瘤壞死因子-α誘導蛋白2 （TNFAIP2）和β-連環蛋白（β-catenin）在不同乳房組織中的表達，分析各因子表達與乳癌肺轉移的關系?，F將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年1月—2016年1月，選擇青島大學附屬青島市中心醫院手術切除且臨床病理資料完整的乳房組織標本110例，其中乳癌肺轉移組（A組）35例，乳癌無肺轉移組（B組）35例，乳房良性腫瘤組（C組）20例，乳癌肺轉移癌旁組（D組）20例。研究納入乳房腫瘤病人均為女性，年齡24～70歲，平均（51.03±11.31）歲;截至2019年9月，隨訪時間27～93月，平均（49.94±20.18）月。組織學分級根據改良Scarff-Bloom-Richardson法分為1～3級。根據雌激素受體（ER）、孕激素受體 （PR）、人表皮生長因子2（HER-2）、增殖細胞相關核抗原（Ki67）等表達情況將乳癌分為Luminal A型、Luminal B1型、Luminal B2型、HER-2過表達型、三陰型（TNBC）[7]。35例乳癌肺轉移病人中，25例有淋巴結轉移;Luminal A型2例，Luminal B1型14例， Luminal B2型1例， HER-2過表達型11例，TNBC 7例。

1.2 入組標準和排除標準

入組標準：①臨床資料完整，包括一般情況、腫瘤分期（TNM分期，參考AJCC TNM分期標準（第8版））[8]、治療恢復情況、首發肺部轉移腫瘤的大?。ㄒ圆±韴蟾婺[瘤的最大直徑為準）、位置、數目等;②經穿刺或手術切除病理（WHO標準）確診為乳癌;③經PET-CT或肺部強化CT、纖維支氣管鏡活檢、穿刺活檢、手術后病理（WHO標準）檢測確診合并肺轉移。排除標準：①合并原發肺癌以及其他惡性腫瘤肺轉移的病人;②合并有其他嚴重危及生命的器質性病變、其他惡性腫瘤及轉移的病人;③病歷資料記錄不完整無法提取重要數據者。

1.3 KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達水平檢測

采用免疫組織化學SP法。石蠟標本4 μm切片，依次置于新鮮二甲苯、無水乙醇、體積分數0.95乙醇、體積分數0.75乙醇中進行脫蠟水化，EDTA抗原修復液（pH值8.0，北京中杉金橋生物技術有限公司）修復。所用一抗為KLF5（ab137676，Abcam，UK;稀釋度1∶200）、TNFAIP2（ab196659，Abcam，UK;稀釋度1∶200）、β-catenin（ab32572，Abcam，UK;稀釋度1∶250），切片加入一抗恒溫（37 ℃）孵育120 min，采用通用SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，SP-9000）檢測，DAB顯色液（北京索萊寶公司）顯色;蘇木精復染，封片，光學顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學結果判定

結果判讀由兩位病理專家（主任醫師）獨立進行，采用盲法評分。在光鏡下每張切片隨機選取10個高倍鏡視野（400倍），計數KLF5、TNFAIP2、β-catenin染色情況。KLF5陽性染色以細胞核為主，TNFAIP2陽性染色主要定位于細胞質和高爾基體[9]，β-catenin陽性染色位于細胞膜和細胞質[10]，鏡下表現為棕褐色（強陽）或淺黃色（弱陽）。根據染色細胞占比進行評分：0分，<10%的腫瘤細胞染色;1分，10%～40%的腫瘤細胞染色;2分，41%～70%的腫瘤細胞染色;3分，>70%的腫瘤細胞染色。根據染色強度評分：0分，陰性;1分，弱;2分，溫和;3分，強。根據染色強度與染色細胞占比評分乘積判定免疫反應結果：總分0，免疫反應陰性（N）;總分1～7分，低免疫反應性（L）;總分8～12分，高免疫反應性（H）。

1.5 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計數資料比較采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗;繪制Kap-lan-Meier生存曲線，log-rank法比較各組生存率差異;采用多因素二元Logistic回歸模型分析乳癌肺轉移的獨立危險因素，計算風險比（HR）和95%置信區間（CI）。P<0.05表示差異有顯著性。

2 結? 果

2.1 不同乳房組織KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達比較KLF5、TNFAIP2和β-catenin的免疫組織化學染色見圖1。乳癌肺轉移組、乳癌無肺轉移組、乳房良性腫瘤組以及乳癌肺轉移癌旁組織組KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達比較，差異均具有統計學意義（χ2=25.881、23.669，P<0.05;P=0.002）。見表1。

a1～a4為KLF5表達免疫組織化學染色：a1，乳癌肺轉移組;a2，乳癌無肺轉移組;a3，乳房良性腫瘤組;a4，乳癌肺轉移癌旁組。b1～b4為TNFAIP2表達免疫組織化學染色：b1，乳癌肺轉移組;b2，乳癌無肺轉移組;b3，乳房良性腫瘤組;b4，乳癌肺轉移癌旁組。c1～c4為β-catenin表達免疫組織化染色：c1，乳癌肺轉移組;c2，乳癌無肺轉移組;c3，乳房良性腫瘤組;c4，乳癌肺轉移癌旁組。SP法，400倍。

2.2 KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達與乳癌病人生存率關系

log-rank分析顯示，乳癌病人KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達與5年無遠處轉移生存率（DFS）（32.4% vs 69.7%，χ2=6.645，P<0.05;29.0% vs 66.7%，χ2=7.084，P<0.05;30.4% vs 59.6%，χ2=5.371，P<0.05）、總生存率（OS）（83.8% vs 97.0%，χ2=4.152，P<0.05;80.6% vs 97.4%，χ2=5.539，P<0.05;78.3% vs 95.7%，χ2=7.670，P<0.05）顯著相關。見圖2。

2.3 乳癌肺轉移組TNFAIP2、β-catenin和KLF5表達與臨床病理特征關系

乳癌肺轉移組KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達與其組織學分級、脈管內癌栓有關，TNFAIP2、β-catenin表達與淋巴結轉移有關（Fisher精確檢驗P=0.001～0.048），β-catenin表達還與腫瘤大小有關（Fisher精確檢驗P=0.048）;各因子表達均與年齡、分子亞型、ER、PR、HER-2、Ki67及生存狀態無關（P>0.05）。見表2。

2.4 乳癌病人臨床病理特征對肺轉移風險的影響

單因素卡方檢驗分析顯示，脈管內癌栓（OR=4.231，95%CI=1.550～11.546，P=0.004）、KLF5（OR=4.792，95%CI=1.741～13.188，P=0.002）、TNFAIP2（OR=9.785，95%CI=1.759～13.586，P=0.002）、β-catenin（OR=3.368，95%CI=1.164～9.744，P=0.022）表達和包塊大?。∣R=3.852，95%CI=1.401～10.590，P=0.008）是乳癌發生肺轉移的危險因素。多因素二元Logistic回歸模型分析顯示，KLF5是乳癌病人發生肺轉移的獨立預測因素（HR=3.246，95%CI=1.197～12.046，P=0.034）。二元Logistic回歸模型采用基于最大似然估計的向前逐步回歸法進行變量篩選，將無統計學意義的自變量脈管內癌栓、TNFAIP2表達、β-catenin表達和包塊大小剔除方程外，有意義的變量解釋為KLF5表達病人發生肺轉移的風險為KLF5不表達者的3.246倍。見表3。

2.5 乳癌肺轉移病人乳癌組織KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達之間的關系

本文35例乳癌肺轉移病人乳癌組織連續切片，同一組織進行KLF5、TNFAIP2、β-catenin檢測，結果均為高免疫反應性2例，均為低免疫反應性13例，免疫反應均陰性8例，免疫反應性不同12例。相關分析顯示，KLF5與TNFAIP2（r=0.443，P=0.008）、KLF5與β-catenin（r=0.501，P=0.002）、TNFAIP2與β-catenin（r=0.492，P=0.003）表達呈同向性相關。見表4～6。

3 討? 論

乳癌特異性肺轉移的發生與多種因素相關，即通過某種方式影響腫瘤細胞轉移前微環境從而促進或抑制乳癌發生肺部的定向轉移，其中包括基因、蛋白、免疫細胞及相關信號通路等。研究發現，一些基因和蛋白可作為預測肺轉移風險的生物標志物，如癌基因同源基因1、轉化生長因子-β等[11-12]。KLF5是涉及癌癥許多信號通路的重要調控因子，其表達經常出現異常，在某些腫瘤中發揮促癌或抑癌作用，是潛在的腫瘤標志物。有研究表明，KLF5與下游靶標形成的KLF5-ILK-Ecadherin信號通路通過參與聲門上型喉癌的上皮間質轉化過程促進淋巴結轉移，與局部復發顯著相關[5];KLF5的表達與乳癌發生發展有關，可通過泛素-蛋白酶體系統促進腫瘤細胞的侵襲轉移。此外，有研究發現β-catenin異位表達能夠促進乳癌淋巴結轉移，與癌細胞的高侵襲、高轉移相關[13]，而KLF5蛋白或mRNA與β-catenin在遠處轉移風險最高的TNBC中明顯共表達[14]。DEY等[15]研究也顯示，Wnt/β-catenin通路激活的TNBC，相比其他部位肺轉移風險更高。而KLF5對于保持Wnt信號通路的完整是必要的，其特異性缺失可降低通路中β-catenin表達[16]。TNFAIP2為腫瘤相關炎癥的主要遞質，在腫瘤微環境中發揮重要作用，過表達可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進食管鱗癌的增殖和轉移[10]，是KLF5的直接下游靶基因。KLF5可通過上調TNFAIP2轉錄，促進乳癌細胞增殖、侵襲和遷移[17]。但KLF5、TNFAIP2、β-catenin在乳癌肺轉移過程中的作用及具體機制仍不清楚。

本研究采用免疫組織化學法檢測了110例乳房組織標本KLF5、TNFAIP2和β-catenin的表達，結果顯示3個因子表達水平在乳癌肺轉移乳癌組織、乳癌無肺轉移乳癌組織、乳房良性腫瘤組織及乳癌肺轉移原發灶癌旁組織之間顯著不同，乳癌肺轉移乳癌組織中3個因子的表達明顯上調。對這些分子標志物表達水平與肺轉移病人的臨床病理學特征關系分析顯示，乳癌肺轉移組的KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達均與乳癌組織學分級、脈管內癌栓有關，TNFAIP2、β-catenin表達與淋巴結轉移有關，β-catenin表達與腫瘤大小有關;各因子表達均與年齡、分子亞型、ER、PR、HER-2、Ki67及生存狀態無關。本研究隨訪結果顯示，KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達與DFS、OS顯著相關，脈管內癌栓和KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達及包塊大小是乳癌發生肺轉移的危險因素，而KLF5表達是乳癌發生肺轉移的獨立危險因素。說明KLF5過表達與乳癌肺轉移風險增加有關，可作為預測乳癌肺轉移風險的分子標志物。

綜上所述，KLF5、TNFAIP2與β-catenin在乳癌肺轉移的乳癌組織中高表達且彼此相關，KLF5-TNFAIP2-β-catenin途徑與乳癌特異性肺轉移有關，KLF5通過調控相關蛋白在肺轉移過程中發揮重要作用。本文研究局限性在于樣本數量相對偏少，乳癌肺轉移與KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達相關性及具體機制有待大樣本研究和體外細胞實驗加以驗證。

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（本文編輯 黃建鄉）