基于右旋糖酐合成與降解的兩步法制備低聚異麥芽糖

易子玲，吳敬，陳晟*，王蕾*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

低聚異麥芽糖(isomalto-oligosacchrides, IMOs)是一類聚合度通常為2～10，含有1個或多個α-1,6糖苷鍵的寡聚葡萄糖。其主要功能成分是異麥芽糖、異麥芽三糖(isomaltotriose, IG3)和潘糖等[1-2]。IMOs甜度低、熱量低，具有低血糖指數特征；IMOs可被腸道益生菌如雙歧桿菌分解利用，產生短鏈脂肪酸，提高人體免疫力，有研究表明，IMOs產品中IG3的成分相比于異麥芽糖更有利于人體內雙歧桿菌生長，這說明了IG3為主要益生因子之一[3-5]；IMOs不被齲齒鏈球菌利用，可以有效預防齲齒。因此IMOs被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等行業。

目前，工業上主要使用以下2種方法制備IMOs。第1種方法以淀粉為原料經過淀粉酶、葡萄糖苷酶處理制備IMOs[6]：例如LEE等[7]將麥芽糖淀粉酶和α-葡萄糖轉移酶復配催化玉米糖漿，可產出67.4%的IMOs，其中，IG3及聚合度更高的IMOs占比為39.7%。第2種方法以蔗糖為原料經過右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase, DS)單獨制備IMOs或與右旋糖酐酶一同制備IMOs[8-12]：例如GOULAS等[12]使用DS和右旋糖酐酶以蔗糖為原料制備IMOs，產出聚合度為10～60的異麥芽寡糖(占比至多36%)。

KRALJ等[13]報道了1種4,6-α-葡聚糖轉移酶(4,6-α-glucanotransferase，4,6-α-GT)可將直鏈淀粉通過轉苷反應轉化成右旋糖酐，產物中α-1,6糖苷鍵比率高達90%[13-16]。但基于底物的結構，僅4,6-α-GTs不可能將非直鏈淀粉類的α-1,4糖苷鍵高效地轉化為α-1,6糖苷鍵連接的多聚糖[17]。據此我們提出了4,6-α-GTs和右旋糖酐酶制備IMOs的新策略，以麥芽糊精為底物，使用本實驗室篩選的來源于Lactobacillusfermentum的4,6-α-葡萄糖基轉移酶(4,6-α-glycosyltransferases, LfGT)合成右旋糖酐[18]，使用酵母將右旋糖酐中的葡萄糖消化后冷凍干燥制成粉末，再使用具有IG3產物特異性的來源于Brevibacteriumfuscum的異麥芽三糖右旋糖酐酶(isomaltotrio-dextranase, BfIMTD)降解右旋糖酐以制備IMOs的兩步法工藝。本研究在第1步合成反應中添加商品化普魯蘭酶和重組表達的異普魯蘭酶(isopullulanase, IPU)與LfGT復配對合成反應進行優化，以提高中間產物右旋糖酐的產量和有效鍵型(α-1,6糖苷鍵)比率，并對降解反應中BfIMTD降解右旋糖酐的工藝進行優化，以實現富含IG3的IMOs高效制備。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與質粒

EscherichiacoliJM109、E.coliBL21(DE3)和PichiapastorisKM71為本實驗室保藏；目的基因合成于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.1.2 酶與主要試劑

LfGT來源于本實驗室；商品化高溫淀粉酶、糖化酶及普魯蘭酶購于山東隆科特有限公司。

異麥芽糖、潘糖、G3等標準品，Sigma-Aldrich有限公司；商品化右旋糖酐20000，上海國藥集團化學試劑有限公司；麥芽糊精(DE2，DE4～6和DE5～7)，羅蓋特精細化工有限公司；酵母，安琪生物集團有限公司。所用培養基為大腸桿菌和酵母宿主常用培養基。主要儀器包括常用搖瓶發酵、酶反應及產物檢測所需儀器等。

1.2 重組菌的構建及發酵

根據研究需求，從NCBI數據庫中選擇B.fuscum來源的BfIMTD，及Aspergillusniger來源的IPU的氨基酸序列，由上海捷瑞生物工程有限公司對目的氨基酸序列進行表達宿主密碼子優化以及基因合成，選擇E.coliBL21(DE3)和pET-24a(+)作為BfIMTD的表達宿主和載體，選擇P.pastorisKM71和pPIC9K作為IPU的表達宿主和載體，使用大腸桿菌宿主和畢赤酵母宿主常用發酵方法分別對BfIMTD和IPU進行重組表達，使用SDS-PAGE方法對重組酶進行分析[19-20]。

1.3 重組酶的酶活測定

使用DNS法對BfIMTD和IPU進行酶活力測定[21]。

在本研究中，在pH 7.5和45 ℃的條件下使用10 g/L商品化右旋糖酐20000作為底物反應10 min測定BfIMTD酶活力。酶活力定義：上述條件下，將1 min 水解右旋糖酐生成1 μmol的葡萄糖所需酶量定義為右旋糖酐酶的1個單位的酶活力。

在pH 3.5和30 ℃的條件下使用50 g/L普魯蘭多糖反應30 min測定IPU酶活力。酶活力定義：上述條件下，將1 min水解普魯蘭多糖生成1 μmol的葡萄糖所需酶量定義為IPU的1個單位的酶活力。

1.4 低聚異麥芽糖的制備及檢測方法

1.4.1 合成右旋糖酐及中間處理的方法

將麥芽糊精溶于50 mmol/L磷酸/檸檬酸緩沖液中配制成250 g/L麥芽糊精溶液，隨后加入適量LfGT及緩沖液至底物麥芽糊精終質量濃度為200 g/L，同批次可能同時或分別加入適量普魯蘭酶、IPU，通過加酶組合優化此合成步驟，在37 ℃，200 r/min條件下反應24 h。

隨后加入高溫淀粉酶(95 ℃, 反應30 min)和糖化酶(60 ℃，反應30 min)對合成反應液中未反應的底物及產物中的末端α-1,4糖苷鍵短鏈部分進行處理，隨后煮沸滅酶。向反應液中加入50 g/L反應液的干酵母，在30 ℃條件下反應12 h消化葡萄糖。

將處理好的反應液置于-80 ℃下冷藏過夜，隨后置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥, 獲得樣品右旋糖酐粉末。

1.4.2 水解右旋糖酐制備IMOs的方法

將1.4.1所述樣品粉末溶于50 mmol/L磷酸/檸檬酸緩沖液中，加入適量右旋糖酐酶，于37 ℃條件下反應不同時長，煮沸滅酶離心后即可獲得IMOs反應液。

1.4.3 產物的HPLC檢測方法

使用安捷倫1260 HPLC色譜儀對右旋糖酐(DP≥3)進行檢測。檢測條件為：色譜柱Agilent Hi-Plex Ca (7.7 mm×300 mm, 8 μm)，柱溫80 ℃，流動相為純水，流速0.5 mL/min，進樣量為10 μL。將HPLC測得三糖及以上聚合度部分視為右旋糖酐，其產量按照測得產品峰面積占所有產品的比例計算。

使用安捷倫1260 HPLC色譜儀對寡糖分子(IG3、異麥芽糖和葡萄糖等)進行檢測。待測樣品經純乙腈等體積過夜沉淀后，取上清液檢測，檢測條件為：色譜柱Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱溫35 ℃，流動相為體積分數70%～75%的乙腈，流速0.8 mL/min，進樣量為10 μL。標準品(葡萄糖-麥芽七糖混合標樣G1～G7、異麥芽糖、IG3等)同樣品一同檢測，IMOs的產量按照外標法計算得相應濃度，并結合第1步反應占比，計算得IG3兩步法產率。

1.4.4 產物鍵型的核磁共振氫譜(1H-nuclear magnetic resonance spectra，1H-NMR)檢測方法

利用AVANCE III 400 MHz數字NMR核磁共振光譜儀(Bruker Biospin International AG)測定右旋糖酐的鍵型比例。稱取30～40 mg樣品溶于500 μL D2O (D, 99.9%)中，漩渦振蕩至徹底溶解后打入核磁管中進行測定，溫度為60 ℃。將三甲基甲硅烷基丙酸(0.3 g/L)溶解在樣品中作為內標。

2 結果與分析

2.1 合成步驟右旋糖酐的制備

本研究中使用到的底物麥芽糊精屬于淀粉不同程度的水解產物，其主鏈為α-1,4糖苷鍵連接，在鏈上的不同部位會有不同聚合度的支鏈，分支處以α-1,6糖苷鍵為主的糖苷鍵連接。圖1中呈現了麥芽糊精具有代表性的結構。合成步驟中使用的酶種類包括LfGT、普魯蘭酶及IPU。3種酶的主要作用分別為：(1)產生右旋糖酐:4,6-α-GTs作為合成右旋糖酐的主要酶，它能夠利用淀粉的直鏈部分生成含有α-1,6糖苷鍵連接的右旋糖酐部分，但與淀粉含有支鏈的部位不易發生反應;(2)提高右旋糖酐產量:普魯蘭酶是一類可以水解淀粉分支的脫支酶，可將最小單位的支鏈從主鏈上水解下來，使4,6-α-GTs可以最大程度地利用淀粉質底物;(3)提高產物中α-1,6糖苷鍵比例:IPU可以水解普魯蘭多糖中1個或連續α-1,6糖苷鍵后的α-1,4糖苷鍵，此處IPU水解麥芽糊精或LfGT產出右旋糖酐由α-1,6糖苷鍵連接支鏈后的α-1,4糖苷鍵，隨后LfGT利用得到的直鏈淀粉，最終獲得α-1,6糖苷鍵占比更高的產物。

綜上所述，本研究分別建立并優化了單酶(LfGT)，雙酶復配(LfGT和普魯蘭酶)以及三酶復配(LfGT、普魯蘭酶和IPU)3種生產右旋糖酐的反應體系，以獲得具有更高α-1,6糖苷鍵右旋糖酐反應體系(圖1)。

1-可與LfGT反應的底物直鏈區域；2-不可與LfGT反應的底物含支鏈的區域；3-可被普魯蘭酶水解的底物支鏈區域(α-1,6糖苷鍵)；4-不可被異普魯蘭酶水解的底物直鏈區域；5-可被異普魯蘭酶水解的底物上緊跟支鏈的α-1,4末端；6-可被異普魯蘭酶水解的LfGT產物上緊跟支鏈的α-1,4末端；a-LfGT和普魯蘭酶復配產物結構；b-LfGT,普魯蘭酶和異普魯蘭酶復配產物結構圖1 合成步驟底物和產物結構簡圖Fig.1 Structure of the substrate and product in the synthesis step

2.1.1 LfGT加酶量對右旋糖酐合成的影響

本實驗室篩選得到L.fermentum來源的LfGT，其最適溫度為37 ℃，最適pH為6.0。在LfGT的最適條件37 ℃和pH 6.0下，將200 g/L麥芽糊精(DE2)與不同加酶量的LfGT (300、400、500、800 U/g底物，以下簡稱U/g)反應24 h。反應結束后使用1.4.1所述方法處理反應液，以消除未被利用的底物和產物含有α-1,4糖苷鍵末端的部分，下述合成步驟后處理方法保持一致。使用1.4.3所述方法檢測有效成分的峰面積占比來確定LfGT加酶量對合成反應效率的影響。

如圖2-a所示，12.384 min和10.739 min出峰成分為本合成步驟產物右旋糖酐，16.206 min出峰為葡萄糖。如圖2-b所示，當LfGT加酶量為400 U/g時，右旋糖酐的產物占比最高，約為24.5%，此時葡萄糖占比為71.5%，未被LfGT利用的麥芽糊精經高溫淀粉酶和糖化酶中間處理水解為葡萄糖。產物由酵母消除葡萄糖后冷凍干燥成粉末后，稱取其30～40 mg粉末溶于500 μL D2O，使用0.3 g/L TMSP作為內標一同溶于樣品中進行1H-NMR檢測，如圖2-c所示，檢測得產物中α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵的比例為1∶3.15，α-1,6糖苷鍵比率為76%。加酶量為400～800 U/g，產物右旋糖酐減少，可能是LfGT存在副反應——水解反應，在右旋糖酐產量接近平衡時，增加LfGT的加酶量，其水解反應開始起作用，水解底物麥芽糊精或生成的產物右旋糖酐，因此提高加酶量反而使得右旋糖酐產量降低。

a-LfGT產物HPLC圖譜(G1：葡萄糖；G2：麥芽糖；G3：麥芽三糖；≥G4：麥芽四糖～麥芽七糖)；b-LfGT加酶量對右旋糖酐產物占比的影響；c-加酶量為400 U/g時產物1H-NMR圖譜圖2 單獨使用LfGT產物HPLC圖譜、其加酶量對右旋糖酐產物占比的影響及產物1H-NMR圖譜Fig.2 HPLC analysis of product prepared by LfGT, the effect of LfGT amount on dextran proportion and relavant 1H-NMR analysis

2.1.2 LfGT與普魯蘭酶復配對右旋糖酐合成的影響

在37 ℃和pH 6.0的條件下，依據2.1.1的探究結果使用400 U/g加酶量的LfGT進行復配優化，依照實驗室研究經驗使用40 U/g的普魯蘭酶進行復配。雙酶復配的HPLC產物圖譜如圖3-a所示。同時分別使用200 g/L DE2、DE4～6和DE5～7的麥芽糊精作為底物對右旋糖酐的產量進行探究，如圖3-b 所示。底物使用DE2麥芽糊精時，單獨使用LfGT催化反應的右旋糖酐產物占比為24.3%，雙酶復配的右旋糖酐產物占比增加了僅50%；底物使用DE4～6或DE5～7麥芽糊精時，單獨使用LfGT催化反應的右旋糖酐產物占比約45%，雙酶復配產出右旋糖酐占比增加了15%。雙酶復配時，DE2麥芽糊精的轉化程度更高。此外，利用1H-NMR檢測產物的鍵型比例，如圖3-c所示，在使用DE2的麥芽糊精時，雙酶復配產物的α-1,6糖苷鍵比率可達89.2%。各組實驗結果綜合表明，利用普魯蘭酶與LfGT復配，可以進一步提高產物中右旋糖酐產量。

a-雙酶復配產物HPLC圖譜；b-復配組合及底物對右旋糖酐產物占比的影響；c-使用DE2麥芽糊精的雙酶復配產物1H-NMR圖譜圖3 雙酶復配產物HPLC圖譜、不同復配組合與不同DE值麥芽糊精對右旋糖酐占比的影響及雙酶復配產物1H-NMR圖譜Fig.3 HPLC analysis of product prepared by two enzymes, the effect of enzyme cocktails and maltodextrins with varying DE on dextran proportion and relevant 1H-NMR analysis

2.1.3 LfGT、普魯蘭酶與異普魯蘭酶復配對右旋糖酐合成的影響

根據AKEBOSHI等[22]、SAKANO等[23]對來源于A.niger的IPU的研究，其最適pH為3.0～3.5，最適溫度為40 ℃。本研究依據相關發酵方法對IPU進行重組表達。重組表達的IPU酶活力可達691.5 U/mL，可用于制備IMOs兩步法工藝。在37 ℃和pH 6.0的條件下，在2.1.2所述雙酶復配的基礎上使用DE2的麥芽糊精，加入IPU一同反應24 h，三酶復配的HPLC產物圖譜如圖4-a所示。400 U/g的IPU與LfGT和普魯蘭酶復配時右旋糖酐產物占比可達66.3%，如圖4-b所示。利用1H-NMR檢測不同組合產物的鍵型比例，如圖4-c所示，三酶組合的鍵型比例為1∶142.3，α-1,6糖苷鍵的比率達到99.3%，這說明IPU的加入幾乎使所有可用的α-1,4糖苷鍵經LfGT轉糖基化為α-1,6糖苷鍵。α-1,6糖苷鍵占比更高的右旋糖酐對后續右旋糖酐酶發揮水解特性更加有效，從而直接影響IMOs的產率。

a-三酶復配產物HPLC圖譜；b-三酶復配不同IPU加酶量對右旋糖酐產物占比的影響；c-IPU加酶量為400 U/g時三酶復配產物的1H-NMR檢測圖譜圖4 三酶復配產物HPLC圖譜、不同IPU加酶量對右旋糖酐產物占比的影響及其1H-NMR檢測Fig.4 HPLC analysis of product prepared by three enzymes, the effect of IPU amount on dextran proportion and relevant 1H-NMR analysis

2.2 降解步驟IMOs的制備

2.2.1 BfIMTD加酶量對制備IMOs的影響

依據相關方法對BfIMTD進行重組表達，測得胞外上清液的酶活力為7.8 U/mL，說明BfIMTD在大腸桿菌中表達成功。根據MIZUNO等[24]對BfIMTD的研究表明，該重組BfIMTD最適溫度為45 ℃，最適pH為7.5。按照1.4.1所述方法使用酵母將產品中的葡萄糖消化，隨后冷凍干燥制成粉末。在40 ℃和pH 7.5的條件下，使用上述右旋糖酐(終質量濃度為100 g/L)與BfIMTD反應4 h探究BfIMTD加酶量對產出IMOs的影響。如圖5所示，BfIMTD展現其產物特異性，高效產出IG3，IG3的產率在加酶量為150 U/g時可以達到最高93.6 g/L，兩步法總的IG3轉化率為62.1%。

圖5 BfIMTD不同加酶量對IMOs產量的影響Fig.5 The effect of BfIMTD amount on IMOs production

2.2.2 反應時長對制備IMOs的影響

在40 ℃和pH 7.5的條件下，使用右旋糖酐溶液(終質量濃度為100 g/L)與150 U/g加酶量的BfIMTD反應。如圖6所示，從反應2 h開始BfIMTD產出84.6 g/L的IG3，隨后緩慢增加，在10 h時達到最高質量濃度98.3 g/L，此時兩步法IG3總的轉化率為65.2%，隨后產率保持平緩至12 h。外切酶BfIMTD特異性產出IG3，產品符合對IMOs益生性能的要求。

圖6 反應時長對BfIMTD產出IMOs的影響Fig.6 The effect of reaction time by BfIMTD on IMOs yield

3 結論與討論

以淀粉酶主導制備IMOs的傳統方法工藝復雜、產率低、有效成分含量低；以右旋糖酐蔗糖酶主導的制備IMOs方法成本高，且產品中含有無法被利用的葡萄糖且其產物右旋糖酐聚合度不可控。本研究開發了4,6-α-葡聚糖基轉移酶和異麥芽三糖右旋糖酐酶高效制備IMOs的兩步法工藝，第1步優化單酶、雙酶、三酶復配體系，以提高中間產物右旋糖酐的產量和α-1,6糖苷鍵比率，使用普魯蘭酶和LfGT復配時，可以得到產物占比為73.1%的右旋糖酐，其α-1,6 糖苷鍵比率為89.2%，使用IPU、普魯蘭酶與LfGT復配催化DE2麥芽糊精，可以得到產物占比為66.3%的右旋糖酐，此時其α-1,6糖苷鍵比率可達99.3%；第2步對異麥芽三糖右旋糖酐酶降解右旋糖酐產出IMOs進行優化，以制備IG3占比更高的IMOs產品，使用BfIMTD降解三酶復配產出的右旋糖酐可以產出98.3 g/L的IG3，此時兩步法IG3的產率為65.2%。本研究還可以在以下這些方面展開后續研究：

(1) 本研究的合成步驟后續可通過數據庫挖掘或自然篩選獲取能夠有效利用麥芽糖、麥芽三糖的4,6-α-GTs，進一步提升右旋糖酐產率，同時對4,6-α-GTs催化的鏈長范圍進行探究，以產出鏈長更可控的右旋糖酐或IMOs。

(2) 本研究的降解步驟選用的表達宿主是大腸桿菌，其表達量高、通用性好，但是IMOs主要用于食品領域，因此后續研究可選用食品安全菌枯草芽孢桿菌對所需右旋糖酐酶進行重組表達和制備研究，以滿足食品工業應用需求。