東莨菪堿長期給藥致小鼠學習記憶障礙模型及機制研究

劉淑青 顧豐華

【摘要】目的：考察東莨菪堿長期給藥后對小鼠學習記憶功能的影響，探究東莨菪堿長期給藥致小鼠學習記憶障礙模型的劑量效應關系及對神經再生和氧化損傷的作用。方法：ICR雄性小鼠，隨機分為空白對照組、14天造模組和14天持續造模組。造模組分別腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg，空白對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。通過Morris水迷宮實驗、跳臺實驗檢測小鼠學習記憶能力，BrdU+DCX染色檢測小鼠腦神經元增殖分化情況，考察腦內乙酰膽堿酯酶（AChE）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量變化。結果：東莨菪堿長期給藥后可延長小鼠找尋水迷宮平臺潛伏期，減少穿越平臺次數，降低目標象限停留時間；減少跳臺潛伏期，增加錯誤次數；可影響小鼠BrdU+DCX陽性細胞數；改變AChE、SOD活性及MDA含量；有劑量-效應關系。結論：東莨菪堿長期給藥后可造成一定程度小鼠學習記憶功能障礙，且長期給藥可致神經細胞損傷，其作用機制可能與神經細胞再生障礙和氧化損傷有關。

【關鍵詞】東莨菪堿；Morris水迷宮實驗；免疫熒光染色

中圖分類號：R-332

文獻標識碼：A

文章編號：2096-5249（2021）02-0001-06

Model and mechanism of scopolamine induced learning and memory impairment in mice

LIU Shu-qing1，2 GU Feng-hua1，2△

1.State Key Laboratory of &New Drug Pharmaceutical Process， Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， China State Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 200437， China

2. Shanghai Professional and Technical Service Center for Biological Material Druggability Evaluation， Shanghai 200437，China

【Abstract】Objective：To investigate the effects of scopolamine on learning and memory function of mice after long-term administration and explore the dose-effect relationship of long-term administration of scopolamine，as well as the effects on nerve regeneration and oxidative damage.Methods：Male ICR mice were randomly divided into a blank control group，a 14-day model group and a 14-day continuous model group. The model group was scopolamine by intraperitoneal injection at the doses of 1，2 and 4 mg/kg，and the blank control group was given the same volume of saline.Learning and memory ability of mice were investigated by Morris water maze experiment and diving platform experiment，and the proliferation and differentiation of brain neurons were detected by BrdU+DCX staining，and cholinesterase（AChE），superoxide dismutase（SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content of brain were investigated.Results：Continuous administration of scopolamine could prolong the incubation period of finding the water maze platform，reduce the number of crossing the platform，and reduce the residence time of the target quadrant.And reduce the diving platform incubation period，increase the number of errors.The number of BrdU+DCX positive cells in mice was affected.AChE，SOD activity and MDA content were changed.There is a dose-effect relationship.Conclusion：Scopolamine can cause learning and memory dysfunction and nerve cell damage in mice after long-term，the mechanism of which may be related to nerve cell regeneration disorder and oxidative damage.

【Key words】scopolamine；Morris water maze experiment；Immunofluorescence staining

東莨菪堿作為M膽堿受體阻斷藥，與多種亞型M受體有相似的親和力，能阻礙乙酰膽堿與腦內M受體的結合，主要作用于記憶的獲取階段，從而影響信息的傳遞，導致學習記憶功能受損[ 1 ]，與部分老年鼠的學習記憶損傷存在相同的作用機制[ 2 ]，可作為老年性癡呆癥造模方法之一。研究證明，東莨菪堿單次給藥作為學習記憶損傷模型，可造成功能性改變，此模型損傷可逆[ 1 ]，但對于長期給藥所造成的損傷尚不明確。段新等[3]發現，東莨菪堿2 mg/kg慢性給藥條件下，對大鼠記憶有一定損害，對神經元突觸可塑性有輕微影響。本研究擬連續14天給予不同劑量東莨菪堿，通過Morris水迷宮、跳臺等行為學實驗，考察東莨菪堿長期給藥后能否造成學習記憶損傷模型。并通過BrdU+DCX雙重免疫熒光染色及腦組織AChE、SOD、MDA等生化指標，研究東莨菪堿長期給藥是否影響腦組織神經元增殖分化，改變酶活性，造成氧化損傷，從而影響學習記憶功能，探索持續14天給藥條件下不同劑量東莨菪堿對小鼠學習記憶能力的影響及長期給藥對腦組織損傷程度，探究其作用機制，為后續研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康ICR雄性小鼠，體重18 g，SPF級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證編號：20170005025670，許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005。小鼠飼料是標準固體飼料，自由飲水。

1.1.2 試劑

東莨菪堿氫溴酸鹽（Aladdin Industrial Corporation，批號：H1507073），考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒 （批號：20181221）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase，AChE）測定試劑盒（批號：20191231）總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒（批號：20200806）、微量丙二醛（MDA）測試盒（批號：20200811），均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 儀器

Noldus動物軌跡識別系統，吉良軟件避暗記錄儀，YLS-3TB跳臺記錄儀，TL-2010S型組織勻漿器，Fresco21型臺式高速冷凍離心機，GHP-9080型隔水式電熱恒溫培養箱，Thermo全波長酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立

ICR小鼠適應性飼養7天， 隨機分為空白對照組、14天造模組（連續給予東莨菪堿腹腔注射14天，行為學試驗期間給予生理鹽水，腹腔注射30 min后進行行為學試驗）和14天持續造模組（連續給予東莨菪堿腹腔注射14天，行為學試驗期間給予東莨菪堿，腹腔注射30 min后進行行為學試驗[4]），如圖1。 14天造模組包括1 mg/kg組（以下簡稱14-1組）、2 mg/kg組（簡稱14-2組）、4 mg/kg組（簡稱14-4組）。14天持續造模組包括1 mg/kg組（簡稱14C-1組）、2 mg/kg組（簡稱14C-2組）、4 mg/kg組（簡稱14C-4組）。分為兩批試驗。（1）每組6只動物，14-1組、14-2組、14-4組、14C-1組、14C-2組、14C-4組分別腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg，空白對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，第11～14天腹腔注射BrdU 50 mg/kg。第15天開始Morris水迷宮實驗，試驗結束取腦進行BrdU+DCX雙重免疫熒光染色實驗。（2）每組10只動物，14-1組、14-2組、14-4組、14C-1組、14C-2組、14C-4組分別腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg，空白對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。第15天開始跳臺實驗，試驗結束取腦制備腦組織勻漿，測定腦組織蛋白含量、AchE、SOD活性和MDA含量。

1.2.2 Morris水迷宮實驗

第15天開始Morris水迷宮訓練。訓練方式：每次每只小鼠先放在位于第Ⅳ象限的平臺上熟悉15 s，再將小鼠于第Ⅳ象限面壁投入水中，使其尋找平臺，小鼠尋找到隱匿平臺后撈出擦干，此時間為潛伏期。以60 s為限，如果60 s仍找不到平臺，可引導其找到平臺，然后在平臺滯留20 s。休息10 min后，再依次將小鼠放入第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ象限游泳以尋找平臺，其余過程同上。每天訓練1次，連續5 d。記錄潛伏期，該潛伏期反映動物學習記憶能力。

第6天進行撤臺實驗。將位于第Ⅳ象限的平臺撤除，將小鼠從水池的第Ⅱ象限面向池壁放入水中，游泳尋找平臺1 min。Morris水迷宮Noldus統計軟件將記錄每只小鼠穿越平臺所在位置的次數，分別在4個象限的活動路程，以及在平臺中心區域及外圍區域的活動時間及路程等，并進行統計處理。

1.2.3 免疫組化染色

麻醉小鼠，經多聚甲醛心臟灌流后取腦，放入含適量多聚甲醛溶液的離心管中維持形態。制備石蠟包埋切片，BrdU+DCX免疫熒光染色，計數BrdU、DCX陽性細胞數。

1.2.4 跳臺試驗

YLS-3TB小鼠跳臺記錄儀由5室構成，每室120 mm×120 mm×180 mm，每室左上角放置一個3 cm×3 cm×3 cm絕緣跳臺座，底部有銅柵按0.5 cm間距排列鋪成，可以通36 V直流電。讓小鼠在箱內適應5 min后通電。24 h后重復進行，測其記憶保持能力。將上述刺激過的小鼠置于絕緣平臺上，隨即通電并開始計時，動物受到電擊后的正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激，多數動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺。從計時開始到小鼠第一次跳下平臺的時間，作為潛伏期，即小鼠的學習能力，潛伏期>300 s則按300 s記錄，同時記錄5 min內小鼠跳下平臺遭受電擊的次數（即錯誤次數），以此作為記憶能力的成績。

1.2.5 取材及腦組織勻漿制備

行為學檢測結束后，小鼠斷頭處死，取腦，用冷生理鹽水為勻漿介質，置EP管，勻漿器60 Hz 30 s研磨制成腦組織勻漿4 ℃條件下將腦組織勻漿4000 rpm離心5 min，取上清液測定AchE、SOD活性及MDA含量等生化指標。

2 結果

2.1 水迷宮實驗

（1）訓練期間不同組別小鼠尋找平臺潛伏期、目標象限停留時間、周圍區域停留時間結果見表1～3和圖2。 Control組隨訓練天數的增加，其尋找平臺潛伏期逐漸縮短，小鼠在目標象限的停留時間延長。東莨菪堿給藥14天后，其變化趨勢與Control組相似，隨訓練天數的增加，其尋找平臺潛伏期逐漸縮短，小鼠在目標象限的停留時間延長，但期間波動較大。

1.2.6 腦組織AChE、SOD活性和MDA含量測定

按照測定試劑盒說明書進行操作，測定腦組織AChE、SOD活性和MDA含量。

1.2.7 統計學方法

數據均以（x±s）表示，顯著性分析采用One way ANOVA檢驗樣本總體是否有差異，若有差異，則再以t檢驗檢驗各組與空白對照組之間的差異，以P<0.05或為具有統計學意義。（2）撤臺測試結果見表4和圖3。測試當天，給藥14天后，模型小鼠找尋目標平臺潛伏期較Control組有所升高，但無顯著性差異（P>0.05）；1 mg/kg組和2 mg/kg組穿越平臺次數接近，較Control組次數減少，無顯著性差異（P>0.05），4 mg/kg組穿越平臺次數顯著少于Control組（P<0.05）。

2.2 免疫組化染色結果

BrdU+/DCX+雙重免疫熒光染色結果顯示見表5和圖4、5。結果顯示，14天持續造模組BrdU+細胞數與對照組相比減少，有極顯著差異（P<0.01），1 mg/kg組和2 mg/kg組BrdU+細胞數接近，高于4 mg/kg組，隨東莨菪堿劑量增加，BrdU+細胞數減少；DCX+細胞數隨東莨菪堿劑量增加而減少，1 mg/kg組與對照組相比DCX+細胞數有所降低，但沒有顯著性差異（P>0.05），2 mg/kg組和4 mg/kg組與對照組相比減少，有顯著差異（P<0.05）；4 mg/kg組BrdU+/ DCX+與對照組相比降低，有極顯著差異（P<0.01）。14天造模組BrdU+細胞數與對照組相比減少，有極顯著差異（P<0.01），1 mg/kg組和2 mg/kg組BrdU+細胞數接近，高于4 mg/kg組，隨東莨菪堿劑量增加，BrdU+細胞數減少；DCX+細胞數隨東莨菪堿劑量增加而減少，與空白對照組相比有所降低，但沒有顯著差異（P>0.05）；4 mg/kg組BrdU+/DCX+與對照組相比降低，有顯著差異（P<0.05）。

隨東莨菪堿劑量增加，錯誤次數依次增加，與空白對照組相比，沒有顯著差異（P>0.05）。

2.3 跳臺試驗

不同組別小鼠跳臺試驗潛伏期和錯誤次數見表6和圖6。給藥14天后，1模型小鼠跳下站臺的潛伏期，隨東莨菪堿劑量增加，其潛伏期依次縮短，但與空白對照組相比，沒有顯著性差異（P>0.05）；跳臺錯誤次數隨莨菪堿劑量增加，錯誤次數依次增加，與空白對照組相比，沒有顯著差異（P>0.05）。

2.4 小鼠腦組織蛋白含量與乙酰膽堿酯酶活性

各組腦組織勻漿中總蛋白含量無顯著性差異（P>0.05）。14天持續造模組中，1 mg/kg組膽堿酯酶活性與照組相比有所上升，但沒有顯著性差異（P>0.05）；

2 mg/kg組和4 mg/kg組膽堿酯酶活性均值接近，顯著高于對照組（P<0.05）。14天造模組中，1 mg/kg組膽堿酯酶活性與對照組相比有所上升，但沒有顯著性差異（P>0.05）；2 mg/kg組和4 mg/kg組膽堿酯酶活性顯著高于對照組（P<0.05）。

2.5 小鼠腦組織SOD活性和MDA含量

結果顯示，14天持續造模組中，1 mg/kg組和2 mg/kg組小鼠的單位蛋白SOD活性較對照組降低，但沒有低于對照組（P<0.05）；1 mg/kg組和2 mg/kg組MDA含量與對照組相比增加，但沒有顯著差異（P>0.05），4 mg/kg組MDA含量明顯高于對照組（P<0.05）。14天造模組顯著差異（P>0.05），4 mg/kg組單位蛋白SOD活性明顯小鼠的單位蛋白SOD活性與對照組相比降低，但沒有顯著差異（P>0.05），且隨東莨菪堿劑量增加，其活性依次降低；MDA含量較空白對照組有所增加，但沒有顯著差異（P>0.05），且隨東莨菪堿劑量增加，其含量依次升高。

3 討論

Morris水迷宮試驗結果表明，腹腔注射東莨菪堿可影響模型組小鼠逃避潛伏期、目標象限停留時間等，期間訓練結果有較大波動。測試當天，14天造模組小鼠找尋平臺潛伏期增加，穿越平臺次數減少，與東莨菪堿劑量存在相關性，4 mg/kg組穿越平臺次數與空白對照組有顯著性差異，表明東莨菪堿長期給藥后可一定程度影響小鼠的學習記憶能力，其影響強度與劑量有關。訓練期間，14天造模組與空白對照組變化趨勢相近，基本無顯著性差異，14天持續造模組則有顯著性差異，推測長期給與東莨菪堿后，小鼠有一定學習記憶損傷，但最終通過訓練形成的記憶與正常小鼠幾乎無差異，與東莨菪堿重復5天[5]和21天[3]給藥造成的學習記憶行為改變相似，驗證了Duka[6]文獻中東莨菪堿干擾信息的獲取，但不影響空間參照記憶的保持。

同時跳臺實驗結果顯示，隨劑量增加，給予東莨菪堿14天后可縮短造模小鼠跳下平臺的潛伏期，增加錯誤次數，即東莨菪堿對模型小鼠學習記憶能力損傷有劑量關系，與高莉等[ 1 ]對東莨菪堿單次給藥研究結果相符，但跳臺結果未顯示出顯著性差異，表明這三種劑量下東莨菪給藥14天后對小鼠學習和被動回避記憶能力有一定損傷作用，但不能作為理想的學習記憶損傷模型。

基底前腦復合體膽堿能神經元丟失是老年性癡呆癥的病理改變特征之一，因而可影響腦內乙酰膽堿的合成、貯存、釋放、滅活及與受體相互作用等。本實驗通過測定腦內蛋白含量，AchE活性，發現長期給予東莨菪堿后，模型組小鼠的AChE活性升高。乙酰膽堿作為神經元中的主要的興奮性神經遞質，對于記憶的保留至關重要。本研究中AChE活性升高，推測可使乙酰膽堿降解增加，降低乙酰膽堿含量，影響小鼠記憶功能，且東莨菪堿2 mg/kg、4 mg/kg組活性相似，均高于1 mg/kg組，進一步證實東莨菪堿對小鼠記憶損傷存在劑量-效應關系。

研究發現，在老年癡呆癥患者腦內大量神經元持續性受損，主要發生在海馬CA1 區。同時神經元損傷與海馬神經再生不足加速了AD病程的發展[7-8]。BrdU標記新生神經元有絲分裂過程，DCX標記未成熟神經元，因此BrdU+/DCX+雙標能夠特異性顯示新生神經元的增殖過程[9-10]。結果顯示，長期給予東莨菪堿后，BrdU+細胞數顯著降低，對阻礙神經細胞增殖作用顯著，同時BrdU+/DCX+有所降低，尤其4 mg/kg組BrdU+/DCX+顯著降低，表明長期給予東莨菪堿可能阻礙神經再生過程，且有劑量-效應關系。

眾多對于東莨菪堿造模的AD藥物研究文獻中均考察了藥物對SOD和MDA的影響[ 1 1 ]。SOD是抗氧化酶，可清除腦內過量氧自由基，MDA是脂質過氧化降解產物，其含量與細胞損傷呈正相關。單次給與東莨菪堿，可使SOD活性降低，MDA含量增加。本研究發現，東莨菪堿長期給藥對SOD和 MDA影響較小，但仍存在SOD活性降低和MDA含量增加趨勢，且呈劑量關系。4 mg/kg持續造?？娠@著降低SOD活性，增加MDA含量，影響脂質過氧化，造成神經細胞損傷，從而引起記憶障礙。

4 結論

東莨菪堿長期給藥后可造成小鼠學習記憶行為損傷和神經細胞損傷，其作用機制可能與神經細胞再生障礙和氧化損傷有關。

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