生草栽培對紐荷爾臍橙根系生長土壤微生物群落的影響

管冠 郭等等 李倩磊 姚鋒先 劉桂東

摘要：贛南地區是我國臍橙主產區，臍橙產業已經成為贛南地區的支柱產業，然而傳統清耕果園土壤退化現象日益突出，嚴重制約了當地臍橙產業的發展。采用生草盆栽試驗，以裸露土壤為對照，比較各生草處理的pH值、有機質含量、堿解氮含量、速效磷含量、速效鉀含量及根系生長狀況、土壤微生物數量、土壤微生物多樣性。結果表明，相比裸露土壤，無分隔處理SC4和尼龍袋分隔處理SC3顯著提高了土壤有機質含量、臍橙根系生長發育、微生物數量、AWCD值和Shanon-Wiener、PD-Whole-tree指數，且尼龍袋分隔處理SC3中獨有的OTU數量顯著高于其他處理。生草栽培有利于紐荷爾臍橙根系生長、土壤理化性狀改善及臍橙產業的可持續發展。

關鍵詞：生草栽培;紐荷爾臍橙;根系;土壤微生物;贛南地區

中圖分類號：S666.406?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0220-06

收稿日期：2021-03-12

基金項目：江西省重點研發計劃重大項目（編號：20192ACB80009）;江西省教育廳科技項目（編號：GJJ180759）;江西省自然科學基金（編號：20202BABL215029）。

作者簡介：管 冠（1985—），男，湖北黃石人，博士，副教授，主要從事土壤生物學研究。E-mail：guanguan_1985@aliyun.com。

贛南地區年產百萬噸臍橙，是全國面積最大、產量最高的產區，在世界臍橙產業中也數一數二，被譽為“世界橙鄉”[1]。其中，紐荷爾臍橙種植面積最大[2]，贛南臍橙有肉質脆嫩、化渣，風味芳香，口感酸甜適中等特色，果實遠銷海內外。近年來，其種植規模大大增加，已經成為贛南地區經濟發展的支柱產業。贛南地域主要以山地和丘陵為主，土壤有機質含量低、酸度高，贛南地區的果農主要采用傳統的清耕栽培技術。由此，土壤肥力下降問題越來越嚴重，果園的品質和產量也日益下降[3]，這不僅影響果農的經濟情況，也嚴重制約我國臍橙產業的可持續發展。為了解決這一問題，政府引進生草栽培技術，并大力推廣。果園生草栽培就是在果園全園或果樹行間人工種草或者自然生草的栽培模式。它具有改善土壤結構、提高土壤肥力[4-6]、提高果園的品質和產量的優勢[7]。

植物根系直接影響植物地上部碳水化合物的合成和轉化。植物根系越發達、根表面積越大，則對土壤養分吸收能力越強。根系的生長發育受土壤理化性質及土壤養分含量的影響，同時，根系的生長狀況又會對土壤環境產生影響。土壤理化性質越優越、養分含量越高，越能促進植物根系的生長發育，進而促進植物的營養生長[7]。根際土壤微生物是土壤生態結構中最活躍的組成部分，它在腐殖質的形成、有機質及礦物質的分解、土壤養分的循環和轉化過程中發揮著重要作用[8]。根際微生物群落組成不僅反映生物活性水平，其代謝產物和植物根系分泌物還作用于土壤環境，影響土壤養分的吸收利用以及植物根系生態系統[9]的穩定性。因此，研究根際土壤微生物的影響因素，對于改善土壤環境、提高土壤肥力、促進根系生長和土壤的可持續利用具有重要意義[10]。大量研究表明，影響根際土壤微生物的因素主要有土壤環境、土壤微生物自身、植被多樣性、動物多樣性等[11-12]。而生草栽培模式有助于改善土壤物理性質，增加土壤養分含量與土壤微生物種類數量[13]，促進植物根系和果樹的生長。植物土壤-根系-微生物三者相互影響，相互促進。

臍橙果園土壤退化是長期性的持續過程，在筆者前期的田間試驗中發現，生草栽培模式能夠很好地提高土壤酶活性，有效地控制果園土壤的退化過程，但對于其中的機制研究還不夠深入。因此，探討生草栽培對臍橙根系生長和土壤微生物群落的影響具有重要意義。本研究以贛南臍橙園土壤為研究對象，設計盆栽試驗探討生草栽培對臍橙根系、土壤微生物群落的影響。研究結果有助于明確臍橙根系生長對生草栽培的響應機制，從理論上豐富臍橙根際環境的微生物動態變化過程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與盆栽試驗設計

選取長勢基本均一的枳砧紐荷爾為供試植株，購于贛州江口無病毒苗木繁育基地，設計盆栽試驗。試驗于2019年12月在贛南師范大學臍橙學院西側網棚進行，生草栽培草種選用田間常見的百喜草（Paspalum notatum Flugge），播種量為2 g/盆，以裸露土壤的清耕栽培模式為對照。試驗共設置5個處理：（1）裸露土壤，無植株種植，無百喜草覆蓋（CK）;（2）種植紐荷爾植株，無百喜草覆蓋（SC1）;（3）種植紐荷爾植株，覆蓋百喜草，塑料盆分隔（SC2）;（4）種植紐荷爾植株，覆蓋百喜草，尼龍袋分隔（SC3）;（5）種植紐荷爾植株，覆蓋百喜草，無分隔（SC4）。試驗采用完全隨機區組試驗設計，共設置6個小區，每小區包含5個處理，每處理包含3次重復。

塑料盆分隔（完全分隔）：將紐荷爾臍橙苗移栽于直徑40 cm、高35 cm的塑料花盆中，然后將其整體栽種在直徑50 cm、高45 cm的營養缽內（總裝土量為40 kg，下同）。在塑料盆和營養缽之間種植百喜草2 g（下同）。此分隔方式下，臍橙根系和草根完全隔離，草根本體及其根系分泌物均不可對臍橙根系產生影響。

尼龍袋分隔：將紐荷爾臍橙苗移栽于直徑 40 cm、高35 cm的300目尼龍袋中，然后將其整體栽種在直徑50 cm、高45 cm的營養缽內。在尼龍袋和營養缽之間種植百喜草。此分隔方式下，草根本體對臍橙根系沒有影響，但草根根系分泌物可對臍橙根系產生影響，且水、肥也可自由通過。

無分隔種植：將紐荷爾臍橙幼苗移栽于直徑 50 cm、高45 cm的營養缽內。在距離樹干15 cm外的周圍種植百喜草。此栽培情況下，臍橙根系和草根均可自由生長，二者的根系本體及根系分泌物均可互相作用。

1.2 土壤及植物根系樣品的采樣時間與采樣方法

在盆栽試驗布置完畢后，6個月后取樣1次、12個月后取樣1次，試驗持續1年。將土樣剔除雜物后，裝入自封袋內，并放入冰盒。帶回實驗室后分成2份，一份新鮮土樣過篩（2 mm）后4 ℃保存，用于微生物多樣性分析;另一份土樣經去雜風干過篩后4 ℃保存，用于土壤理化性質的測定。把臍橙根系從盆栽里小心取出，清水沖洗干凈，裝入牛皮紙信封后帶回實驗室待測。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤基本理化性狀分析 土壤基本理化性質的測定參照文獻[14]進行。土壤pH值的測定采用pH計法測定（水土比2 ∶1）;土壤有機質含量的測定采用H2SO4-K2CrO7高溫外熱-容量法;土壤堿解氮含量的測定采用堿解擴散法;土壤速效磷含量的測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法;土壤速效鉀含量的測定采用NH4OAc浸提、火焰光度法。

1.3.2 臍橙根系分析 主要測定指標包括根總長、根平均直徑、根總面積、根總體積、根直徑等級分布及根尖段長分布等根系形態信息。具體采用多功能根系掃描儀測定相應指標[15]。

1.3.3 土壤三大類群微生物數量測定 細菌、真菌、放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養基平板混菌法、孟加拉紅培養基平板混菌法、高氏1號培養基平板混菌法培養，并測定其數量[16]。

1.3.4 土壤微生物群落功能多樣性的測定 稱取10 g新鮮土樣與100 mL生理鹽水混勻后制備土壤懸液，置于三角瓶中，25 ℃、200 r/min 振蕩10 min（搖床），稀釋至10-3濃度梯度，用移液槍吸取150 μL接種于Biolog Eco微平板，25 ℃恒溫培養7 d，每隔24 h使用多功能酶標儀讀數（590 nm），通過計算獲取平均顏色變化率（average well colourdevelopment，AWCD）[17]。

1.3.5 土壤細菌群落結構分析 土壤細菌16S特異區段建庫測序：在試驗12個月后，選擇合格的根際土壤總DNA，使用16S小亞基核糖體片段的特異引物加接頭及barcode的融合引物對總DNA進行PCR擴增。PCR擴增產物通過試劑盒進行磁珠吸附回收，并使用LabChip GX（Caliper，美國）檢測回收片段的大小及濃度，委托北京諾禾致源科技股份有限公司對柑橘根際的16S小亞基核糖體特異片段進行高通量測序。測序引物序列為：534f，5′-CCAGCAGCCGCGGTA AT-3′;783r，5′-ACCMGGGTATCTA ATCCKG-3′。

1.4 數據統計分析

試驗測定數據采用Excel 2007 進行處理，采用SAS 10.0統計分析軟件進行方差分析、顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同生草栽培對土壤基本理化性質的影響

由表1可知，與土壤本底相比，除土壤速效磷、速效鉀外，生草栽培顯著提高了臍橙土壤pH值、有機質含量、堿解氮含量。試驗開始6個月后，與CK相比，臍橙土壤pH值、速效磷含量下降，SC4處理土壤有機質含量最高，顯著高于SC2、SC1、CK、SC3處理，其增幅分別為38.86%、38.52%、34.12%、21.66%。試驗12個月后，與試驗6個月相比，各生草處理組土壤pH值、堿解氮、速效鉀含量均下降，SC3、SC4處理土壤速效磷含量上升，其中SC4處理的土壤有機質含量顯著高于SC1、CK、SC2處理，其幅度分別為50.12%、49.76%、49.03%，SC3處理的土壤有機質含量與SC4沒有顯著差異。試驗結果表明，生草栽培有利于改善土壤環境。

2.2 生草栽培對紐荷爾臍橙根系生長的影響

由表2可知，隨盆栽種植時間的推移，除根平均直徑外，臍橙根總長、根表面積、根體積、根尖數均顯著增加。試驗開始6個月后，與幼苗根相比，SC4、SC3、SC2、SC1處理臍橙根總長、根表面積、根體積、根尖數均顯著增加，其中SC4、SC3處理增加最顯著。試驗12個月后，與試驗6個月相比，除臍橙根平均直徑明顯下降外，臍橙根總長、根表面積、根體積、根尖數均明顯增加，其中SC4、SC3處理增加最明顯。試驗結果表明，生草栽培可以促進臍橙根系的生長發育。

2.3 生草栽培對紐荷爾臍橙土壤微生物數量的影響

由表3可知，生草栽培下，臍橙土壤微生物中細菌數量最高，放線菌數量最穩定。試驗開始6個月后，SC2處理細菌數量最多，顯著高于CK、SC1處理，其幅度分別為80.00%、28.57%;SC4、SC3處理細菌數量分別為3.3×105、3.2×105 CFU/g，且與SC2處理差異不顯著。試驗12 個月后，各生草處理土壤微生物數量與6個月時趨勢類似，SC3處理細菌數量最多，顯著高于CK、SC1、SC4處理，其幅度分別為76.19%、42.31%、19.35%，SC2與SC3處理差異不顯著。試驗結果表明，生草栽培下土壤微生物數量增加，且細菌數量增加最顯著。

2.4 生草栽培對紐荷爾臍橙盆栽土壤微生物功能多樣性的影響

由表4可知，試驗開始6個月后，經過完全培養120 h后SC3處理的AWCD值最高，顯著高于CK、SC1、SC2處理，其幅度分別為76.67%、29.58%、9.05%。試驗12個月后，土壤樣品經過完全培養120 h后，各處理的AWCD值與6個月時趨勢類似，SC3處理的AWCD值最高，其次是SC4處理，分別為0.743和0.717。另外，隨著培養時間的推移，各生草處理（SC1、SC2、SC3、SC4）土壤樣品的AWCD值呈上升趨勢（表4）。結果表明，生草栽培有利于提高AWCD值。

2.5 生草栽培對紐荷爾臍橙盆栽土壤根際微生物群落結構的影響

本試驗采用Shanon-Wiener、ACE及PD-Whole-tree指數等表征土壤細菌的群落多樣性，所有處理的測序深度（goods-coverage）均在0.98以上（表5）。高通量測序結果表明，SC4處理的Shanon-Wiener指數最高（9.74），顯著高于CK、SC1處理及SC2處理，其幅度在9.56%～15.13%間;SC3處理的Shanon-Wiener指數為9.73，與SC4處理差異不顯著。PD-Whole-tree指數是基于系統發生樹來計算的多樣性指數，與Shanon-Wiener指數類似，SC4及SC3處理的PD-Whole-tree指數較高，分別為224、231。但在本試驗中各處理的ACE值則沒有出現顯著差異。

韋恩圖（Venn圖）可用于統計多個樣本中所共有和獨有的OTU數目，可以直觀地表現環境樣本的OTU數目及組成的相似性及重疊情況（圖1）。在本試驗中，CK、SC1、SC2、SC3及SC4的OTU數量分別為5 358、5 058、5 461、5 145及5 255，其中所有處理共有的OTU數量為2 768，分別占5組處理OTU總數的51.7%、54.7%、50.7%、53.8%及52.7%。值得注意的是，SC3處理中發現了605種獨有的OTU，占該處理總OTU數量比例的11.8%，顯著高于其他處理（CK、SC1、SC2、SC4）獨有的OTU數量比例（7.6%、6.4%、6.0%、6.9%）。

3 討論與結論

目前，果園生草栽培技術仍未被我國廣大果農接受，一般認為，果園生草會影響果樹的正常生長，降低果實的產量和品質[18]。其實不然，大量研究表明，生草栽培極大地改善土壤結構、提高土壤營養。段敏杰等研究表明，與清耕相比，枇杷園種植黑麥草3年后，果園土壤結構得到改善，土壤肥力顯著提高，其中在0～20 cm土層，土壤有機質含量增加了22.4%[19]。土壤有機質不僅是土壤中各種營養元素（N、P等）的來源，還是土壤微生物生命活動的能源[12]?；舴f等研究也表明，果園行間種植白三葉、黑麥草、紫花苜蓿、鴨毛草等均能提高土壤有機質含量[20-22]。本試驗結果表明，與裸露土壤相比，試驗12個月后生草栽培下臍橙土壤pH值上升，土壤有機質、堿解氮含量顯著增加，且無分隔處理SC4的有機質含量最高，尼龍袋分隔處理SC3與SC4差異不顯著。這說明生草栽培可以提高土壤肥力，且草根本體及其分泌物均作用于臍橙土壤。堿解氮和速效鉀含量均有所下降，說明百喜草在生長過程中消耗了大量的土壤養分，因此，需要對果園及時進行追肥，以免影響果樹的生長發育。

一般認為，植物根系越發達、根表面積越大，則對土壤養分吸收能力越強。宋佳承等研究表明，間作生草顯著提高了油橄欖根系活力和根系活躍吸收面積，且間作百喜草最佳[23]?；葜衩返妊芯勘砻?，葡萄園行間生草促進了葡萄根系生長，提高了土壤肥力，加強了葡萄根系對土壤養分的吸收[21]。這與本研究結果相似，生草栽培下，臍橙根總長、根表面積、根體積、根尖數等均顯著增加，其中無分隔生草SC4和尼龍袋分隔生草SC3增加最顯著，說明生草栽培能夠促進臍橙根系的生長、提高根系活力。

果園土壤中微生物數量越多，越有助于土壤有機質的分解以及果樹對土壤養分的吸收[13]，因此，研究土壤微生物的影響因素，對提高微生物數量、促進果樹生長發育具有重要意義[24]。王倩等研究表明，生草栽培可顯著提高微生物數量，且細菌數量最多[25]。這與本研究結果一致，生草栽培下，與裸露土壤CK相比，各生草處理微生物數量均顯著增加，其中塑料盆分隔SC2處理細菌數最多，與無分隔處理SC4和尼龍袋分隔處理SC3差異不顯著。土壤微生物功能多樣性越高，土壤微生物對碳源的利用能力越強，土壤微生物的代謝活性越高。有研究表明，生草栽培顯著提高了梨園土壤微生物對碳源的利用程度，增強了土壤微生物代謝活性[26]。本試驗結果表明，經過完全培養120 h后的尼龍袋分隔處理SC3的AWCD值最高，其次是無分隔處理SC4的AWCD值，顯著高于裸露土壤CK、無百喜草種植SC1、塑料盆分隔處理SC2，說明生草栽培后，臍橙土壤微生物的代謝活性顯著增強，且主要受草根根系分泌物的影響。土壤微生物種群越豐富、數量越高，根系生態環境越活躍、越穩定[27]。另外，在本研究中采用無分隔處理SC4的Shanon-Wiener指數最高（9.74），顯著高于CK、SC1及SC2處理，采用尼龍袋分隔處理SC3的Shanon-Wiener指數與SC4處理沒有顯著差異，PD-Whole-tree指數與Shanon-Wiener指數類似。說明生草栽培能夠顯著提高臍橙土壤微生物群落多樣性，且在尼龍袋分隔處理SC3中發現了605種獨有的OTU，占該處理總OTU數量比例的12.0%，顯著高于其他處理（CK、SC1、SC2、SC4）獨有的OTU數量比例。綜上，這很大程度上是由于生草栽培改善了臍橙土壤微生物的生態環境，而百喜草的凋落物及其根系分泌物會給土壤微生物提供大量的營養物質，使得土壤微生物數量、組分和功能發生變化，進一步優化土壤微生物群落結構的多樣性。

研究生草栽培對紐荷爾臍橙根系生長及土壤微生物群落影響的試驗結果表明，生草栽培顯著提高了臍橙土壤有機質含量，改善了土壤理化性狀，促進了臍橙根系生長發育。同時，也有利于臍橙土壤微生物數量特別是細菌數量的增加，并優化了土壤微生物群落結構的多樣性，提升了土壤微生物功能多樣性?？茖W的生草栽培模式有利于臍橙土壤的可持續利用能力的維持。

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