應縣紫皮大蒜SOD的雙水相萃取工藝的優化研究

劉麗珍 甄莉娜 劉文英

摘? ? 要：為了探究大蒜中超氧化物歧化酶的最佳提取條件及提取率，本試驗以應縣紫皮大蒜為材料，采用雙水相萃取法結合正交試驗，討論PEG分子質量、PEG濃度、硫酸銨濃度對大蒜中SOD提取率的影響。試驗結果為：PEG分子量為4000，PEG濃度為25%，硫酸銨濃度為30%時，雙水相體系的SOD提取率達到最高為46.9%，影響順序為PEG分子質量的影響最大，硫酸銨濃度次之，PEG濃度最小，3個因素對提取大蒜SOD影響均不顯著。該試驗結果為大蒜SOD的進一步分離純化及在工業化生產、食藥品研究領域提供理論基礎。

關鍵詞：應縣紫皮大蒜;SOD;雙水相萃取;正交試驗;工藝優化

中圖分類號：S633.4? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.002

Optimization of Aqueous Two-phase Extraction for SOD in Yingxian Purple Garlic

LIU Lizhen1，2， ZHEN Lina1，2， LIU Wenying1，2

（1.College of Life Science，Shanxi Datong University，Datong， Shanxi 037009， China; 2.Applied Biotechnology Institute， Shanxi Datong University， Datong， Shanxi 037009， China）

Abstract： In order to explore the optimal extraction conditions and extraction yield of superoxide dismutase in garlic， this experiment utilized Yingxian purple garlic as the material and studied the effects of different PEG relative molecular masses， PEG mass fractions， and ammonium sulfate mass fractions on the extraction rate of SOD by using a two-phase extraction method combined with an orthogonal test. These results indicated when? ?the PEG molecular mass of 4000 and concentrations of PEG and ammonium sulfate were 25% and 30% ，respectively， the maximum extraction yield of SOD was 46.9% in the double aqueous phases system. The molecular mass of PEG was the most important factor， followed by ammonium sulfate concentration， and PEG concentration exerted the least influence.These three factors had no significant impact on the extraction of SOD from garlic. These experimental results provided a theoretical basis for further separation and purification of garlic SOD， industrial production，and food and drug research.

Key words： Yingxian purple garlic; SOD; aqueous two-phase; orthogonal test; process optimization

大蒜屬百合科蔥屬植物，《本草綱目》記錄，大蒜祛風濕除風邪、治吐血和角弓反張、通五臟及大小便、納肛中、散癰腫及霍亂[1-2]。McCord等[3]于1969年在動物血細胞中發現了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD），是廣泛存在于生物體內的金屬酶，催化O2-自由基歧化，具有消除氧自由基、抗生命氧化衰老、抗輻射抗腫瘤、維持機體代謝平衡和改善機體免疫力等作用，在農業、食藥品及化妝品等領域前景廣闊[4-5]。目前我國主要從動物的血液和內臟、微生物發酵和植物中提取SOD。動物提取成本高、提取工藝及得到的成分復雜且不易常溫保存;而植物中大蒜來源及含量極為豐富、生產成本低、工藝簡單，安全性強且含量高[6-7]。值得一提的是，大蒜中的SOD含量及活性是其它植物的數倍，100 g大蒜中SOD含量高達17.6 mg，是人體SOD的重要來源之一[8]。

目前，提取純化SOD的方法有雙水相萃取法、超聲波破碎法、熱變性法、有機溶劑分級沉淀法、硫酸銨分級鹽析法以及膜分離技術法[9-10]。相較于其他方法，雙水相技術設備簡單，條件適中，回收率高，分相時間短，無殘留無毒，能耗低，分離過程更快更經濟，提取率高，可連續化操作[11-12]。

應縣本地產紫皮大蒜作為富硒農產品，被譽為“天然抗生素”。本研究以紫皮大蒜為原料，利用雙水相體系萃取法結合正交試驗法，優化了SOD提取工藝并檢測其含量和提取率，并旨在為大蒜SOD的進一步分離純化及在工業化生產以及食藥品研究領域提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紫皮大蒜（山西省農科院高寒作物研究所提供），牛超氧化物歧化酶對照品、PEG400、PEG600、PEG1 000、PEG4 000、PEG6 000、（NH4）2SO4、Na2HPO4、NaH2PO4以及考馬斯亮藍G-250等為分析純，均購于試劑公司。

1.2 主要儀器

H1850R型高速冷凍離心機，由湖南湘儀儀器有限公司生產;XFB-200型粉碎機，由吉首中誠制藥機械廠生產;JA5003A型電子天平，由上海精科天美儀器有限公司生產;UV-1200型紫外可見分光光度計，由上海美普達公司生產;SK-1型渦旋混勻器，由江蘇科析有限公司生產;PH-3C型酸度計，由上海儀電科學有限公司生產。

1.3 試驗方法

1.3.1 大蒜的選取 選用瓣肉白、無蟲害、無霉變、無破損的大蒜500 g，去皮去蒂后用無菌水洗凈晾干，粉碎后轉至潔凈研缽中磨碎成泥狀。

1.3.2 粗提液的提取 將1.3.1 的蒜泥分5份，按1∶2加pH7.8的磷酸緩沖液（0.05 mol·L-1）研磨，待SOD完全溶解后5 000 rpm離心10 min，去掉不溶性雜質取上清，緩沖液繼續浸泡雜質，反復3次合并提取液，5層紗布過濾得到粗提液。

1.3.3 建立雙水相體系 以1.3.2 粗提液為原料，于15 mL離心管中加入不同分子質量PEG，分別和（NH4）2SO4搖勻，3 500 rpm離心10 min，4 ℃靜置2 h待分層，測定上、下相中SOD的濃度。

1.3.4 大蒜SOD含量的測定

（1）制作標準曲線

精確稱取牛SOD對照品10 mg（0.1 mg·mL-1），稀釋成50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5 mg·mL-1等6個不同梯度及對應的空白對照，595 nm 處測定吸光值，重復3次，標準曲線的橫縱坐標分別為標準品濃度（P，m·V-1）和其吸光度，回歸方程為Y=41.574X+0.236 9，R2=0.997 5。

（2）考馬斯亮藍法測定SOD的含量

SOD的含量采用考馬斯亮藍測定法[13]。取干凈的15 mL離心管15支，樣品管3支，標準管和空白管各1支，做3個重復。依次對應加0.1 mL樣品液、0.1mL標準液、0.1 mL生理鹽水和 5 mL考馬斯亮藍，混合完全后測其吸光度，重復3次。計算方法如下：

式中， Vs為雙水相體系中上相的體積，mL;VX為雙水相體系中下相的體積，mL;CS為雙水相體系上相SOD的濃度，mg·mL-1;CX為雙水相體系下相SOD的濃度，mg·mL-1。

1.3.5 單因素試驗

（1）PEG分子質量對大蒜SOD提取率的影響

準確稱取蒜泥50 g，選取濃度為20%的PEG和25%的（NH4）2SO4組成體系溶液，設定PEG的分子質量為200，400，600，1 000，4 000，6 000。觀察不同PEG分子質量對大蒜SOD提取率的影響。

（2）PEG濃度對大蒜SOD提取率的影響

準確稱取蒜泥50 g，選取PEG4 000和25%的（NH4）2SO4組成體系溶液，設定PEG濃度為10%，15%，20%，25%，30%，35%。觀察不同濃度PEG對大蒜SOD提取率的影響。

（3）（NH4）2SO4濃度對大蒜SOD提取率的影響

準確稱取蒜泥50 g，選取分子質量為4 000，濃度為20%的PEG，設定（NH4）2SO4濃度為5%，10%，15%，20%，25%，30%組成體系溶液。觀察不同質量分數的 （NH4）2SO4對大蒜SOD提取率的影響。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 PEG分子質量對大蒜SOD提取率的影響 由圖1可知，大蒜SOD的提取率隨著PEG相對分子質量的不斷增大而升高，PEG分子質量為4 000時，大蒜SOD的提取率最大為42.3%，之后PEG分子質量繼續加大，大蒜SOD的提取率反而下降?？赡苁蔷酆衔锓肿恿康脑黾哟龠M了酶在兩相間的傳遞，當分子量增加到一定程度時，由于高聚物分子體積排斥作用的結果[14]，反而阻礙其傳遞，導致提取率下降。因此在進行正交試驗時，分別選取PEG分子質量為1 000，4 000，6 000做3個水平。

2.1.2 PEG濃度對大蒜SOD提取率的影響 由圖2可知，大蒜SOD的提取率隨著PEG4 000濃度的不斷加大而提高，濃度為20%時提取率為最大值43.9%，之后繼續加大PEG濃度，SOD的萃取率反而下降?？赡苁荘EG質量分數較低時，下相的鹽析作用占主導，隨著PEG濃度的繼續增加，SOD主要分配在富含PEG的上相中，導致SOD的提取率不斷上升[14]，濃度上升到一定程度時，提取率開始下降。因此在做正交試驗時，選取PEG4 000的濃度分別為15%，20%，25%進行優化。

2.1.3 （NH4）2SO4濃度對大蒜SOD提取率的影響 由圖3可知，隨著（NH4）2SO4濃度的增加，大蒜SOD的提取率在不斷上升，濃度為25%時，提取率達到最大值38.1%，之后繼續加大（NH4）2SO4濃度，SOD的提取率反而下降?？赡艿脑蚴请S著（NH4）2SO4濃度的增大，對水分子的爭奪致下相體積增大，上相PEG的濃度相對增加，SOD的萃取率也相應增加[15]，當（NH4）2SO4質量分數增加到一定程度時，提取率開始下降。因此在做正交試驗時，選?。∟H4）2SO4的質量分數為20%，25%，30%進行優化。

2.2 正交試驗結果

結合單因素試驗結果，以PEG分子質量、PEG質量分數和（NH4）2SO4質量分數為考察因素，以大蒜SOD提取率為指標，選擇3因素3水平做正交試驗及驗證性試驗，結果如表1所示。

由表2可知，提取大蒜SOD的最佳組合為A2B3C3，即PEG分子量為 4 000，PEG濃度為25%，（NH4）2SO4濃度為30%時，大蒜SOD的提取率最大。由極差值R得出，雙水相法萃取大蒜SOD的影響順序為A >C >B，即PEG分子質量的影響最大，（NH4）2SO4濃度次之，PEG濃度最小。最優組合經驗證，得出的提取率為46.9%。

由表 3可以得出，雙水相法提取大蒜SOD的 3個因素對SOD的提取率影響不顯著。

3 結論與討論

SOD作為生物體的首要清除劑，反應生物體的抵抗能力[16]，天然植物大蒜中SOD的含量較為豐富，廣泛應用于食藥品、農醫等領域[17]。本試驗運用雙水相萃取法提取應縣紫皮大蒜中的SOD，根據正交試驗及方差分析結果得出的最佳條件：PEG分子量為4 000，PEG質量分數為25%，（NH4）2SO4濃度為30%時，SOD的提取率最高，達46.9%。影響順序為PEG分子質量的影響最大，（NH4）2SO4濃度次之，PEG濃度最小，3個因素對提取大蒜SOD影響均不顯著。這與張麗華等[14]的研究一致，可能是由于超氧化物歧化酶在兩相中擴散及兩相間傳遞的阻力隨著高聚物分子量的增大而變大，體積排斥作用的加大阻礙酶進入富含PEG的相中而轉向另一相。而高聚物分子量越小，提取液在兩相間的分配系數越大，越易分配到富含該聚合物的相中[15]。

謝芳等[15]的研究結果表明，PEG質量分數較低時，下相的鹽析作用占主導，使SOD主要分配在富含PEG的上相。隨著雙水相體系中上相PEG濃度的增加，表面的張力加大，脂溶性成分的溶出，加劇了溶質的傳遞及擴散阻力，抑制了SOD進入上相而導致SOD萃取減少。（NH4）2SO4質量分數的增大對水分子的爭奪致下相體積增大，上相PEG的濃度相對增加，SOD的萃取率也相應增加。（NH4）2SO4濃度太高或太低時，此雙水相萃取系統均不能成相。太低時， PEG和（NH4）2SO4出現鹽溶現象，SOD易分配到下相;太高時，出現鹽析現象，SOD易分配到上相[15，18]?？煽康脑囼灲Y果，可以大規模地開發、生產大蒜 SOD 的附加產品，增加大蒜的綜合利用價值，提高大蒜的附加值和社會經濟效益，為大蒜SOD的分離純化等進一步研究提供理論依據。

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