大學生尿液鄰苯二甲酸酯水平與睡眠時型的關聯

聞星，徐洪呂，伍曉艷，，陶舒曼，楊婭娟，盛杰，詹凱，齊云霞，劉雯雯，鄒立巍，謝陽，李婷婷，陶芳標，

1.安徽醫科大學 a.公共衛生學院兒少衛生與婦幼保健學系 b.出生人口健康教育部重點實驗室 c.人口健康與優生安徽省重點實驗室 d.國家衛生健康委配子及生殖道異常研究重點實驗室，安徽 合肥 230032

2.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所安徽省畜禽產品安全工程重點實驗室，安徽 合肥 230032

晝夜節律紊亂是一種內源性生物鐘與環境光、暗循環失調的狀態［1］，常見的表現形式為睡眠紊亂，多項研究顯示晝夜節律紊亂與兒童青少年的身心健康密切相關，如肥胖、心血管疾病、代謝功能異常、內分泌失調、抑郁等［2-3］。睡眠時型是評價晝夜節律的一種方法［4］。鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一種環境內分泌干擾物，作為增塑劑廣泛應用于個人護理產品、家居擺設、食品藥品等包裝材料中［5］，人群研究發現PAEs 暴露與睡眠紊亂如失眠、睡眠中斷有關［6］，動物研究發現環境內分泌干擾物可引起動物晝夜活動模式改變，降低活動水平［7］。目前關于PAEs暴露與人群晝夜節律的研究較少。晝夜偏好在青春期啟動時開始向“夜晚型”轉變，在青春期結束時達到頂峰［8］。本研究擬以處于青春期晚期的大學生為研究對象，分析大學生尿液PAEs 代謝物與睡眠時型之間的關聯。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究在2019年10—11月對中國江西省上饒市1 所綜合類學校和安徽省合肥市1 所醫科類院校的學生進行了橫斷面調查，采用隨機整群抽樣的方法，以專業為抽樣單位，抽取1 152 名調查對象進行問卷調查和采集尿樣?；厥諉柧? 151 份，排除4 份無效問卷后，最終納入有效問卷1 147 份，有效回收率為99.7%。收集晨尿樣本721 份。納入問卷信息完整和有尿液樣本的713 人進行分析。在調查前所有參與者均簽署了知情同意書。本研究獲得安徽醫科大學生物醫學倫理委員會的批準（批號：20200965）。

1.2 方法

1.2.1 問卷調查研究對象分批次集中在教室中，通過手機掃描指定的二維碼獲取自編的大學生健康相關行為電子問卷，在調查人員說明填寫要求后填寫問卷，填寫時間為20～30 min。調查內容包括一般人口學特征（年齡、性別、專業、父母文化程度等）、家庭經濟狀況（與周圍同學相比，自評家庭經濟狀況）、最近一個月內吸煙和飲酒情況（有或無）、最近一個月內影響睡眠的因素（如吃夜宵、喝咖啡、喝茶等）的發生頻率、體力活動水平（使用國際體力活動問卷［9］評估）。

1.2.2 睡眠時型評估采用清晨型與夜晚型量表（Morning and Evening Questionnaire-5，MEQ-5）調查研究對象的睡眠時型［10］。MEQ-5 由5 個條目所構成，總分范圍為4～25 分，其中4～11 分為夜晚型、12～17 分為中間型、18～25分為清晨型［10］。清晨型指早睡早起，并且起床后保持精力充沛；相反，夜晚型指晚睡晚起，在起床后一段時間感覺疲倦，而在晚上發揮最佳狀態；中間型介于兩者之間；與清晨型相比，夜晚型的晝夜節律延遲2～12 h［11-12］。研究發現，MEQ-5 在不同年齡人群中均具有良好的效度和信度［13-14］。本研究中，該量表的Cronbach’sα系數為0.74。

1.2.3 尿樣收集與檢測將已經編號的試管和聚丙烯尿杯在采集尿樣前1 d 分發給研究對象，次日清晨由調查人員前往學生宿舍回收裝有晨尿的試管。晨尿經離心后用聚丙烯凍存管分裝上清液，置于-80℃冷凍柜冷凍保存。檢測時取冷凍儲存的尿液，在室溫下解凍，采用固相萃取法［15］前處理尿液中6 種PAEs 代謝物：鄰苯二甲酸單甲酯（monomethyl phthalate，MMP）、鄰苯二甲酸單乙酯（monoethyl phthalate，MEP）、鄰苯二甲酸-單-（2-乙基-5-羥己基）酯［mono（2-ethyl-5-hydroxyhexyl）phthalate，MEHHP］、鄰 苯二甲酸單丁酯（monobutyl phthalate，MBP）、鄰苯二甲酸-單-（2-乙基-5-氧己基）酯［mono（2-ethyl-5-oxohexyl）phthalate，MEOHP］和鄰苯二甲酸單（2-乙基己）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP）。使用高效液相色譜串聯質譜法同時測量6 種PAEs 代謝物的濃度［16］，采用手持式折射計（ATAGO，日本）測量尿比重［17］。

1.3 質量控制

按照相同的標準統一培訓調查員。大學生按照專業分別集中到教室，通過現場掃描二維碼填寫線上問卷，有問題及時解答；線上問卷設置一個學號只能填寫一次；大學生獨立填寫問卷，不能互相討論。調查人員通過問卷系統后臺核對問卷信息的完整性和填寫質量。

在采樣、離心、分裝、運輸以及檢測等各個環節嚴格遵循操作規范，避免環境污染。選用聚丙烯材質的尿杯采集樣品，首先是因為聚丙烯尿杯中PAEs 含量較低；其次，尿中的酶沒有水解PAEs 的能力，不影響PAEs 代謝物的檢測；最后，用質譜級水重復采樣過程，跟尿樣一同采用尿管采集、離心和儲存，上機檢測未檢出目標代謝物。在實驗室中每一個步驟盡量由同一個人完成，減少實驗誤差。實驗使用的玻璃制品清洗干凈防止交叉污染。每天做質控樣品檢測反映實驗的精密度，其日內、日間變異系數分別為1.9%～9.0%和1.3%～6.8%。在前處理過程中采用前加標回收率來評價實驗的準確度，40、60、80 μg·L-1的前加標回收率為90.7%～114.9%。不同PAEs 代謝物的檢出限（limit of detection，LOD）以儀器3 倍信噪比估算，LOD 為0.046～1.194 μg·L-1［18］。PAEs 代謝物水平低于LOD 時，分析計算時以LOD/2 表示。采用尿比重來校正個體尿液PAEs 代謝物濃度［19］，對校正后的濃度進行log10轉換。

1.4 統計學分析

用EpiData 3.1 軟件建立數據庫，SPSS 23.0 軟件進行數據分析。對6 種PAEs 代謝物濃度的分布進行描述性統計。非正態分布的數據用中位數和四分位數間距表示。采用卡方檢驗比較不同人口學特征研究對象之間的睡眠時型差異。根據三分位數，將PAEs 代謝物濃度分為低（＜P33.3）、中（P33.3～P66.7）和高（≥P66.7）水平組。將睡眠時型作為應變量，PAEs 代謝物濃度作為自變量，學校、家庭居住地、獨生子女、父母文化程度、吸煙、飲酒、睡眠影響因素以及體力活動等混雜因素為分類變量，使用廣義線性回歸分析PAEs 代謝物與睡眠時型之間的關聯，并按性別進行分層分析，同時做趨勢性檢驗。其中睡眠時型的類型作為有序分類變量、PAEs 代謝物濃度作為連續性變量和分類變量分別納入分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大學生睡眠時型的分布特征

大學生夜晚型、中間型、清晨型睡眠時型的檢出率分別8.0%、68.0%和24.0%。不同性別、專業、家庭居住地、獨生子女以及體力活動水平分組大學生的睡眠時型分布差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同人口學特征的大學生睡眠時型分布［n（%）］Table 1 Distribution of chronotypes among college students with different demographic characteristics [n (%)]

2.2 大學生尿液PAEs 代謝物檢出情況

大學生尿液中MMP、MEP、MEHHP、MBP、MEOHP、MEHP 的檢出率分別為97.5%、97.9%、98.6%、98.6%、98.7%和80.5%，尿比重調整后質量濃度中位數分別為16.02、24.61、15.33、263.25、12.19、2.94 μg·L-1。見表2。

表2 大學生尿液PAEs代謝物質量濃度分布Table 2 Distribution of urinary phthalate metabolite concentrations among college students

2.3 大學生PAEs 代謝物與睡眠時型的關聯

廣義線性回歸模型性別分層分析結果顯示，女大學生PAEs 代謝物濃度與睡眠時型存在關聯，男性中未發現此關聯。在控制混雜變量后，女性MMP 與睡眠時型呈負向關聯（OR=0.55，95%CI：0.33～0.89），MEHHP 與睡眠時型呈負向關聯（OR=0.24，95%CI：0.06～0.93）。將PAEs代謝物濃度作為分類變量進行分析發現，與低水平組MMP比較，女性高水平組MMP與睡眠時型呈負向關聯（OR=0.51，95%CI：0.28～0.92），且MMP趨勢性分析結果有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 大學生PAEs代謝物與睡眠時型關聯的廣義線性回歸模型分析Table 3 Relationships between phthalate metabolites and chronotypes among college students by generalized linear model

續表3

3 討論

本研究中大學生6 種PAEs 代謝物在尿液中的檢出率為80.5%～98.7%，表明研究對象普遍暴露于PAEs。國內外研究結果顯示的PAEs 代謝物濃度并不一致，可能與檢測方法或納入人群不同有關，但多數研究結果均提示MBP、MEP 的暴露水平較高［20-22］。PAEs 與塑料制品的結合不穩定，容易遷移到環境中，從而導致人體的暴露［23］。

美國國家健康和營養檢查調查（National Health and Nutrition Examination Surveys，NHANES）發現，PAEs代謝物與成年人夜間醒來有關，且多種內分泌干擾物與睡眠紊亂有關［24］。其內在機制目前尚不明確，有研究認為內分泌干擾物能夠與雌激素受體結合，引起肥胖相關問題，間接導致睡眠紊亂［25］。睡眠紊亂是晝夜節律紊亂的一種常見表現形式，本研究用睡眠時型來評價晝夜節律，發現大學生清晨型的檢出率（24.0%）高于夜晚型（8.0%）。然而在另一項美國大學生研究中，夜晚型的比例（28.6%）高于清晨型（12.7%）［26］。Haraden 等［27］針對美國兒童青少年的研究發現，清晨型與夜晚型的檢出率接近，分別為10%和11%。睡眠時型的差異可能與研究地區、人群有關。本研究發現MMP 與女性夜晚型睡眠時型有關，未發現任何PAEs代謝物與男性睡眠時型相關。夜晚型作息與多種不良心理和身體健康結果有關［28-29］。

睡眠時型的影響因素很多。最近研究關注到內分泌干擾物與晝夜節律的關聯，提示內分泌干擾物可能擾亂晝夜節律，引起晝夜活動模式改變［7，30］。有研究表明女童比男童更早進入青春期，青春期結束也更早［31］。在青春期啟動時，睡眠相位由兒童時期早睡早起逐漸向晚睡晚起轉變［8］。同時，大量研究發現PAEs暴露與女童青春發動時相提前有關［32-33］，促使女童較早進入青春期。晝夜活動模式的相位、振幅和周期由雌激素和雄激素調節［34］，PAEs 可能通過類雌激素作用調控晝夜節律［35］，或者通過刺激下丘腦促性腺激素釋放，調節青春期發生發展，從而間接調控晝夜節律［36］，促使女童較早向夜晚型睡眠時型轉變。晝夜節律的產生與轉錄-翻譯反饋循環有關，此循環受到一系列基因或蛋白質調控，包括鐘基因（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）、腦和肌肉芳香烴受體核轉運樣蛋白1 基因（brain and muscle ARNTlike 1，Bmal1）、隱色素基因（cryptochrome，Cry）和周期基因（period，Per）［37］。動物研究結果發現，PAEs 代謝物可直接上調雌鼠子代下丘腦視交叉上核的Clock、Per1基因的表達，從而調控雌鼠晝夜節律［38］。在斑馬魚研究中發現，暴露于內分泌干擾物雙酚A 和雌二醇后，斑馬魚晝夜節律均發生改變，雌二醇暴露后還觀察到斑馬魚活動模式發生改變［30］。

本研究檢測了大學生尿液中多種PAEs 代謝物，結果具有良好的準確度和精確度；并且，本研究首次報告了大學生PAEs 暴露與睡眠時型的關聯。然而，研究也存在局限性：首先，本研究只采集了單個時點的尿液樣本，因為PAEs 生物半衰期短，幾乎在24 h 內完全代謝［39］，所以不能代表每日接觸PAEs 的平均水平；其次，本研究采用自填問卷的方式評價睡眠時型，可能無法避免報告偏倚；此外，睡眠時型的影響因素很多，雖然本研究將一些可能影響睡眠時型的因素納入分析，但不能排除還有其他混雜因素未納入研究而可能造成偏倚；本研究為橫斷面研究，未來需要開展縱向研究來驗證PAEs 暴露對睡眠時型的影響以及性別差異，并且還需開展實驗研究了解其生物學機制。

綜上，大學生普遍暴露于多種PAEs，MMP 暴露與女大學生夜晚型睡眠時型有關。