黃樟素型沉水樟莖段組織培養研究黃樟素型沉水樟莖段組織培養研究

肖祖飛，魏 希，張北紅，王顏波，李 鳳，姜 睿，彭 藝，金志農

(南昌工程學院，江西省樟樹繁育與開發利用工程研究中心 江西南昌 330099)

沉水樟 (Cinnamomummicranthum)為樟科樟屬常綠喬木，主要分布在浙江、江西、湖南、臺灣、廣西等省份[1]。沉水樟干形通直、高大雄偉、枝葉繁茂，是優良的造林和綠化樹種。沉水樟木材紋理細致，具有芳香，是船舶、高檔家具等的原材料。沉水樟枝葉富含精油，枝葉精油主成分為黃樟素的為黃樟素型沉水樟(Cinnamomummicranthumct. safrole)，是重要的醫藥原料。由于長期對沉水樟資源的人為破壞，目前沉水樟處于瀕危狀態，為國家三級重點保護植物[2-3]。沉水樟的繁殖可采用種子繁殖、扦插和組織培養[4-6]。有研究表明，沉水樟雌雄花發育成熟期不一致，因而結實率很低、難以采集到種子，且種子空殼率高，種子繁殖困難[2]。扦插繁殖又因資源少，較難獲得穗條，且扦插成活率低，生根難等因素，制約沉水樟苗木的繁殖。組織培養具有操作簡單、繁殖速度快、不受季節影響、可周年生產、脫毒、保持木本優良性狀等優點，是苗木快繁的重要方式。目前，關于沉水樟的組織培養研究較少，翟曉巧等[7]以沉水樟幼嫩莖段為材料，篩選了IBA與BA、IAA與BA、NAA與BA對莖段芽誘導的影響；羅坤水等[6]對沉水樟莖段的初代、繼代和生根培養基進行篩選；陳碧華等[8]在翟曉巧、羅坤水等研究基礎上對沉水樟莖段的初代、繼代、生根培養基進行改良，同時研究了組培苗的移栽技術，為沉水樟的組織培養奠定了基礎。本文以黃樟素型沉水樟一年生半木質化枝條為材料，研究外植體的采集時間、消毒時間和生長調節劑對黃樟素型沉水樟莖段組織培養的影響，以期為黃樟素型沉水樟的苗木快繁提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為黃樟素型沉水樟2年生扦插苗一年生半木質化枝條，剪切成帶1～2個芽的莖段(1.5～3 cm)，用自來水沖洗2 h，置于超凈工作臺，用體積分數75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3～5次，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的采集時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養的影響

分別在2020年5月、7月和9月份，利用上述處理好的外植體，用質量濃度0.1%的升汞(HgCl2)消毒6 min，接種在MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA培養基上，每瓶1個莖段，30瓶，3次生物重復。接種30 d，統計外植體的污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.2 消毒時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養的影響

2020年5月中旬，利用上述處理好的外植體，用質量濃度0.1%HgCl2消毒，消毒處理時間分別為3、5、7和9 min，之后接種在MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA培養基上，每瓶1個莖段，30瓶，3次生物重復。接種30 d，統計莖段的污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.3 生長調節劑對黃樟素型沉水樟莖段萌芽誘導培養的影響

2020年5月中旬，利用上述處理好的外植體，用質量濃度0.1%的HgCl2消毒6 min，分別接種到不同誘導培養基：(1)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.2 mg/L 6-BA，(2)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.4 mg/L 6-BA，(3)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.8 mg/L 6-BA，(4)MS + 0.15 mg/L IBA + 1.6 mg/L 6-BA，(5)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.30 mg/L IBA，(6)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.45 mg/L IBA，(7)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.60 mg/L IBA。每個處理30瓶，每瓶1個莖段。接種30 d，統計莖段的萌芽率。

1.2.4 生長調節劑對黃樟素型沉水樟組培苗增殖培養的影響

將株高3～5 cm的無菌苗修剪成約1.5 cm長的莖段(至少帶有一葉一芽)，分別接種到不同增殖培養基：(1)MS + 0.10 mg/L IBA + 0.25 mg/L 6-BA，(2)MS + 0.10 mg/L IBA + 0.50 mg/L 6-BA，(3)MS + 0.10 mg/L IBA + 1.00 mg/L 6-BA，(4)MS + 0.10 mg/L IBA + 2.00 mg/L 6-BA，(5)MS + 1.00 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L IBA，(6)MS + 1.00 mg/L IBA + 0.20 mg/L 6-BA，(7)MS + 1.00 mg/L IBA + 0.40 mg/L 6-BA。每個處理20瓶，每瓶6～7個莖段。繼代培養30 d，統計增殖芽數、株高、莖粗。

1.2.5 生長調節劑對黃樟素型沉水樟組培苗生根培養研究

挑選株高3～5 cm的無菌苗接種于生根培養基：(1)1/2 MS + 0.5 mg/L IBA，(2)1/2 MS + 1.0 mg/L IBA，(3)1/2 MS + 1.5 mg/L IBA，(4)1/2 MS + 2.0 mg/L IBA，(5)1/2 MS + 0.5 mg/L NAA，(6)1/2 MS + 1.0 mg/L NAA，(7)1/2 MS + 1.5 mg/L NAA，(8)1/2 MS + 2.0 mg/L NAA。每瓶接種7～10株，組培苗生根培養25 d后統計生根率、根數、根長和根粗。

1.2.6 黃樟素型沉水樟生根苗的煉苗和移栽技術研究

生根培養11～15 d，將組培生根苗移至透光率25%～30%、溫度25～30 ℃的大棚內煉苗7～10 d，將組培苗移出瓶外，用自來水清洗干凈生根苗根部培養基，待移栽。移栽前將生根苗用質量濃度0.5%多菌靈消毒10～15 min，以紅壤土和草木灰(體積比5∶1)為基質，之后移入裝滿基質的無紡布袋中央，保持基質濕潤，移栽兩個月后統計移栽成活率。

1.2.7 組培苗培養條件

培養基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉7.0 g/L，生根培養添加2 g/L活性炭，pH5.8。組培苗培養條件為光照3000～5000 lx、白質光、光照時間12 h/d、溫度(25 ± 2)℃。

1.3 數據統計與方法

株高、根長用米尺測量、根粗用游標卡尺測定。采用Excel2010軟件進行數據的錄入、整理和方差分析。

2 結果與分析

2.1 外植體的采集時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養的影響

由表1可知，外植體的污染率和褐化率隨采集時間的推后而顯著升高，萌芽率隨采集時間的推后顯著降低。5月份采集外植體進行組織培養，外植體的萌芽率最高，為51.80%，而污染率和褐化率最低，分別為18.95%和9.62%。與5月份比較，9月份采集外植體進行組織培養，外植體的污染率和褐化率分別提高了42.72%和10.55%，萌芽率降低了36.54%。

表1 外植體采集時間對黃樟素型沉水樟莖段培養的影響 %

2.2 消毒時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養的影響

由表2可知，外植體的污染率隨HgCl2的消毒時間的增加而降低，褐化率隨消毒時間的增加而逐漸升高，萌芽率隨消毒時間的增加而先升后降。消毒3 min，外植體的污染率達到62.81%，顯著高于消毒5、7、9 min，外植體的污染率最低的是消毒9 min。消毒9 min，外植體的褐化率達到58.15%，顯著高于消毒7、5、3 min；消毒3 min和5 min，外植體的褐化率低，分別為10.82%和15.33%。消毒5 min，外植體的萌芽率最高，為52.59%，顯著高于消毒3、7、9 min。因此，5月份采集黃樟素型沉水樟一年生半木質化枝條，用質量濃度0.1%HgCl2消毒，消毒最佳時間是5 min。

表2 消毒時間對黃樟素型沉水樟莖段培養的影響

2.3 生長調節劑對黃樟素型沉水樟莖段萌芽誘導培養的影響

由表3可知，IBA濃度為0.15 mg/L時，莖段的萌芽率隨著6-BA濃度的增加呈先增后降的趨勢。當6-BA濃度為0.8 mg/L時，莖段的萌芽率達到最高，為66.67%，莖段的萌芽率最低的是0.15 mg/L IBA處理，僅為16.67%。當6-BA濃度為0.8 mg/L時，莖段的萌芽率隨著IBA濃度的升高而逐漸降低。0.15 mg/L IBA處理，莖段的萌芽率最高。因此，黃樟素型沉水樟莖段萌芽的最適培養基為MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA。

表3 生長調節劑配比對黃樟素型沉水樟莖段萌芽誘導培養的影響

2.4 生長調節劑對黃樟素型沉水樟組培苗增殖培養的影響

由表4可知，當IBA濃度為0.10 mg/L時，組培苗的增殖系數隨6-BA濃度的增加而先增后降。6-BA濃度為1.00 mg/L時，增殖系數最大，為3.94，與2.00 mg/L 6-BA處理差異不顯著，顯著高于0.50 mg/L和0.25 mg/L 6-BA處理。當6-BA濃度為1.00 mg/L時，組培苗的增殖系數隨IBA濃度的增加而先增后降，IBA濃度為0.10 mg/L，增殖系數最大。IBA有利于組培苗株高的生長，組培苗的株高隨著IBA濃度的增加而逐漸增大。組培苗的莖粗受6-BA和IBA影響不明顯，各處理組培苗的莖粗差異不顯著。因此，黃樟素型沉水樟組培苗最適增殖培養基為MS + 1.00 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L IBA。

表4 生長調節劑配比對黃樟素型沉水樟組培苗增殖培養的影響

2.5 黃樟素型沉水樟組培苗生根研究

2.5.1 黃樟素型沉水樟組培苗生根過程基部形態變化

組培苗生根培養1～5 d，基部形態變化不明顯；生根培養7 d時，少部分組培苗基部膨大、切口愈合，有少量愈傷組織出現；生根培養9 d時，大部分組培苗基部膨大、切口愈合，部分組培苗基部有凸起點；生根培養11 d時，組培苗基部出現不定根(圖1)。

注：a、b、c、d、e、f圖分別為生根培養1、3、5、7、9和11 d。圖1 1.0 mg/L IBA誘導黃樟素型沉水樟組培苗生根過程

2.5.2 生長調節劑對黃樟素型沉水樟組培苗生根的影響

由表5可知，生根率隨IBA濃度的增加而先升后降。1.0 mg/L IBA處理時，組培苗的生根率最高，為79.33%，其次是1.5 mg/L IBA處理，二者之間差異不顯著，組培苗的生根率最低的是0.5 mg/L IBA處理。1.0 mg/L IBA處理時，組培苗的根數也最多，顯著高于其它處理，組培苗的根數最少的是0.5 mg/L IBA處理。1.5 mg/L IBA處理，組培苗的根長最大，其次是1.0 mg/L IBA處理，組培苗的根長最小的是0.5 mg/L IBA處理。IBA濃度對組培苗的根粗影響不明顯，各處理間組培苗的根粗差異不顯著。

表5 IBA對黃樟素型沉水樟組培苗生根的影響

由表6可知，NAA對黃樟素型沉水樟組培苗生根也有顯著的促進作用，生根率隨NAA濃度的增加而先升后降。1.5 mg/L NAA處理時，組培苗的生根率最高，為81.60%，顯著高于0.5mg/L和 1.0 mg/L NAA處理，稍高于2.0 mg/L NAA處理。根數的變化趨勢與生根率相似，1.5 mg/L和2.0 mg/L NAA處理，組培苗的根數分別為3.17和3.06，二者差異不顯著，顯著高于0.5 mg/L和1.0 mg/L NAA處理。2.0 mg/L NAA處理，組培苗的根長最大，為5.42 cm，其次1.5 mg/L NAA處理，二者差異不顯著，顯著高于0.5 mg/L和1.0 mg/L NAA處理。NAA對組培苗的根粗影響不明顯，各處理間組培苗的根粗差異不顯著。綜合組培苗的生根率、根數、根長和根粗指標，黃樟素型沉水樟組培苗生根最適培養基為1/2 MS + 1.5 mg/L NAA。

表6 NAA對黃樟素型沉水樟組培苗生根的影響

2.6 黃樟素型沉水樟生根苗的移栽和苗期管理

組培苗生根培養11～15 d，移至溫室大棚，控制棚內溫度25～30 ℃、透光率20%～35%，煉苗7～10 d。將生根苗移出瓶外，清洗干凈生根苗根部的培養基。移栽前用質量濃度0.5%多菌靈消毒10～15 min，之后將生根苗移入裝有基質的無紡布袋，移栽后20 d 內保持空氣濕度90%以上，基質保持濕潤，見干即澆，每次要澆透，移栽成活率可達90%(圖2)。之后依據苗木長勢施用水肥，待苗木木質化，株高20～30 cm，可將苗木移入大田定植。

圖2 黃樟素型沉水樟組培移栽苗

3 討論與結論

3.1 外植體的采集時間和消毒時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養的影響

不同時間采集外植體，外植體的生理狀態、組織幼嫩程度、內部營養物質等差異較大，影響外植體的成活率。有研究表明，5月份采集猴樟一年生半木質化枝條進行莖段組織培養，莖段的萌芽率顯著高于7月份和9月份[9]，也有研究表明，2～3月份采集接種材料，外植體的污染率低，無菌活體獲得率高[10]。本研究表明，與7月和9月份相比較，5月份更適合采集黃樟素型沉水樟莖段進行組織培養。究其原因可能是因為5月份新抽枝條處于半木質化狀態，組織幼嫩、生長旺盛、內部營養物質豐富、新陳代謝旺盛、表面病菌少，因而外植體成活率高。

外植體消毒常用試劑有升汞、次氯酸鈉、酒精等，其中升汞消毒效果最好，一般使用質量濃度為0.1%。外植體的消毒時間因不同植物、采集時間、采集部位等而異。消毒時間太短，外植體消毒不徹底，污染率高；消毒時間過長，容易殺死外植體細胞，導致褐化率提高，成活率降低。有研究表明，質量濃度0.1%的升汞消毒7 min，香樟莖段的污染率較低，回綠時間較短，萌芽率高[11]。以體積分數10%的84消毒液處理油樟莖段15 min或體積分數15%的84消毒液處理油樟莖段10 min，油樟莖段的污染率小于15%，成活率大于70%[12]。本研究表明，5月份采集黃樟素型沉水樟半木質帶芽莖段，用質量濃度0.1%的HgCl2消毒5 min，莖段的污染率和褐化率較低，萌芽率最高，這可能是因為半木質化枝條本身帶病菌少、容易消毒，半木質化枝條組織幼嫩、細胞分裂能力強，容易成活。

3.2 植物生長調節劑對黃樟素型沉水樟莖段組織培養的影響

植物生長調節劑在植物組織培養過程發揮重要作用。有研究表明，細胞分裂素和生長素二者的濃度配比適當的情況下才能在樟樹莖段腋芽誘導、叢生芽的增殖、生根時獲得較好效果[13-14]。本研究表明，6-BA、IBA、6-BA/IBA在黃樟素型沉水樟莖段的萌芽、組培苗的增值和生根過程中起重要作用。在IBA濃度不變情況下，黃樟素型沉水樟莖段的萌芽率隨6-BA濃度的增加而先增后降；在6-BA濃度不變情況下，黃樟素型沉水樟莖段的萌芽率隨IBA濃度的增加而降低。黃樟素型沉水樟莖段的萌芽率隨6-BA/IBA的比值的升高而先升后降。6-BA和IBA的比值為1.33時，莖段的萌芽率僅為16.67%；6-BA和IBA的比值為5.33時，莖段的萌芽率達到最大，為66.67%，之后萌芽率降低。6-BA、IBA、6-BA/IBA對黃樟素型沉水樟組培苗的增殖影響與莖段萌芽率相似。6-BA和IBA的比值為10時，增殖系數最大，達到3.94。IBA和NAA對黃樟素型沉水樟組培苗的生根有顯著促進作用，且NAA對組培苗的生根效果優于IBA。組培苗生根培養11d，基部出現不定根，生根適宜培養基為1/2 MS + 1.5 mg/L NAA，生根率為81.60%。

3.3 黃樟素型沉水樟組培生根苗移栽和煉苗研究

組培苗的移栽成活率直接關系到組培技術是否成功。組培苗從培養室到外界，溫度、濕度、光照等發生較大變化，需在有條件設施的地方煉苗一段時間才能移栽。有研究表明，黃樟組培苗煉苗3～5 d，采用泥炭土和珍珠巖混合基質，適當遮光覆膜，黃樟組培苗移栽成活率高達85%[15]。沉水樟生根組培苗瓶內煉苗20～30 d，莖干成深綠色，可移栽到瓶外，采用1/3 椰糠 + 2/3 泥炭土作基質，移栽后25 d內注意控制溫度和濕度，組培苗移栽成活率可達80%以上[6]。本研究表明，黃樟素型沉水樟組培苗生根培養11 ～15 d，將組培生根苗移至透光率25%～30%、溫度25～30 ℃的大棚內煉苗7～10 d，可將生根組培苗移栽到瓶外，移栽20 d內保持濕度90%以上，移栽成活率可達90%。待苗木莖木質化，株高15～20 cm，可將苗木移入大田定植。