外泌體在類風濕關節炎發病機制和診療中的作用

董鑫鵬，翟耘浩，陳廣潔

(上海交通大學醫學院 上海市免疫學研究所，上海 200025)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統性自身免疫性疾病，其主要特征有持續性滑膜炎、全身性炎癥以及出現自身抗體(特別是RF和瓜氨酸化肽)[1]?？梢愿鶕欠翊嬖诳构习彼峄鞍卓贵w(anti-citrullinated protein antibody，ACPA)將RA分為2個亞型，其中ACPA陽性亞群比ACPA陰性亞群具有更強的臨床表型[2]。不受控制的活動性RA將會導致關節損傷，甚至殘疾，還有可能引發心血管疾病和其它合并癥，嚴重影響患者的生活質量。

外泌體是直徑40～100 nm的膜性囊泡，由磷脂雙分子層包裹，是細胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)中的一個重要亞群，可以通過攜帶多種生物大分子對受體細胞的各項生物學特性及生理狀態進行調節[3]。早期由于人們對外泌體功能知之甚少，認為外泌體是細胞外排廢棄物的一種形式，隨著近年來諸多外泌體相關研究的展開，外泌體的免疫調節功能也逐步被證實[4-5]。目前多項研究揭示外泌體在諸多生理病理過程中發揮重要的作用，并對RA發病過程中的免疫反應具有一定的調節作用，對RA患者中的自身免疫反應產生對應的激活或抑制效果，因此，外泌體或可成為新型RA療法的突破性靶點，進一步評估其潛在價值將對臨床上RA的實驗性治療具有較大的意義。

1 外泌體

1.1 外泌體的定義、分布和成分外泌體是一種可由多種細胞分泌的脂質雙層膜結構的小囊泡，通常被認為是由胞內的多泡體與細胞膜融合釋放到細胞外而產生的，可來源于體內任何細胞，外泌體廣泛分布于血液、唾液、母乳、關節滑膜液等不同體液中。外泌體的脂雙層富含膽固醇、鞘磷脂和神經酰胺，將內部與外界隔離開，可顯著保護內容物免于酶解。外泌體的主要成分蛋白質來源于細胞非特異性蛋白分子和特異性蛋白分子兩類。前者為與來源細胞無關的共有蛋白，包括四跨膜蛋白超家族、熱休克蛋白、參與胞內信號轉導的蛋白、細胞溶質蛋白和外泌體酶等；后者為與來源細胞密切相關的一類特殊蛋白，可作為外泌體來源的鑒定指標，如成年心肌細胞來源的外泌體含肌節蛋白，APC來源的外泌體含MHC和共刺激信號蛋白CD86等[3-5]。外泌體內還含有豐富的RNA，如mRNA和包括miRNA、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在內的非編碼RNA等[5]，其通過各種RNA在不同細胞間的傳播來實現對靶細胞基因表達的調控。

1.2 外泌體的產生、作用機制和生物學功能

目前認為，外泌體是由胞內核體與高爾基體作用形成的多泡體(multivesicular body，MVB)通過質膜出芽釋放或與膜泡融合釋放而形成?，F已發現蛋白激酶D1/2通路在調控MVB的成熟和外泌體的釋放過程中發揮關鍵作用，同時介導了二?；视图っ甫翆VB分泌的調控[6]。外泌體在被釋放后與內環境中的可溶性因子結合，以旁分泌或內分泌的方式被定向運輸至靶細胞。外泌體通過直接被靶細胞內吞攝取或靶細胞表面受體介導的胞內信號轉導2種方式作用于靶細胞。但外泌體作用于靶細胞的具體機制還不明確，有研究認為，外泌體的攝取依賴于膽固醇和酪氨酸激酶活性，通過不依賴網格蛋白的內吞作用和大型胞飲作用進入靶細胞[7]。外泌體攜帶的物質在自身免疫過程中可以成為自身抗原的來源，還能夠作為介導病原體在細胞間轉移或造成組織損傷的相關載體。

2 外泌體對RA發生、發展的影響

2.1 外泌體攜帶的蛋白質介導RA發病大量存在于RA患者外泌體中的瓜氨酸化蛋白主要來源于由肽酰精氨酸脫亞氨家族酶催化的精氨酸的脫氨基作用，產物瓜氨酸化蛋白可作為抗原觸發自身免疫反應，形成大量沉積于滑膜空間內的免疫復合物(immune complex，IC)，進而刺激肥大細胞、中性粒細胞等產生多種炎性因子，使RA病情進一步惡化[8]；而巨噬細胞通過外泌體釋放的核DNA結合蛋白，也可作為自身抗原參與RA的發病過程[9]。RA患者體內的滑膜液和成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)分泌的外泌體中都被證實含有DNA結合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1，Id1)。Id1可通過激活胞內Jnk信號通路加速炎癥位置新血管的生成[10]，促進FLS增殖，以及抑制免疫細胞IL-6和IL-8的分泌等多方面聯合作用于RA的發病[11]。Morgan等[12]在RA患者體內血漿、滑膜液和FLS上清液中都分離出了帶有CD13的外泌體，隨后CD13被證實可大幅增強關節內FLS的增殖和遷移能力，最終使FLS病理性增生；此外，CD13還可募集T細胞進入炎癥組織，分泌多種炎性因子促進FLS增殖，使RA患者病情惡化。研究表明，FLS分泌的外泌體攜帶的膜型TNF-α可以激活PKB/AKT和NF-κB信號通路，促進FLS分泌破壞細胞外骨和軟骨基質的基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP-1)以及阻斷胞內細胞凋亡通路來抑制T細胞的正常凋亡[13-14]。

2.2 外泌體相關RNA介導RA發病外泌體內的RNA所負責的基因調控功能主要依靠miRNA，其中的miR-155和miR-146a是近年來研究的熱點。相比正常人，ACPA陽性的RA患者的外周血樣本中IgD-CD27-的記憶B細胞內的miR-155表達水平顯著升高，其結合轉錄因子PU.1促進BCR發生交聯，進而促進抗體生成，形成大量IC[15]；miR-155還會增強單核細胞招募外來免疫細胞，同時通過抑制滑膜組織內單核-巨噬細胞CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2，CCR2)的表達來使其滯留于滑膜組織內，加重局部炎癥[16]。RA患者體內FLS中miR-155的表達明顯上調，與滑膜空間內形成的慢性炎癥狀態密切相關；相同環境在IL-1β、TNF-α刺激下，表達上調的miR-146對IL-6、IL-8、IL-1受體相關激酶及腫瘤壞死因子受體相關因子6對應基因的表達產生抑制作用[17]。

miR-let-7b包含在巨噬細胞或FLS的EV中，滑膜細胞的死亡也可釋放大量miR-let-7b。miR-let-7b可通過結合幼稚單核細胞表面的TLR7來誘導其分化為M1型巨噬細胞，從而促進TNF、IL-6等促炎因子的釋放，導致RA患者病情惡化。Kim等[18]測得RA滑膜液中miR-let-7b的表達水平遠高于骨關節炎滑膜液、RA患者血漿和正常人血漿，充分說明miR-let-7b是造成關節炎癥加重的關鍵因素。

除上述3種miRNA，其他的miRNA也會對RA發病產生作用。由TNF誘導的miR-211-3p表達上調可通過抑制Wnt信號通路中的Dkk2(Dickkopf2)來抑制成骨細胞的分化與鈣化，影響磨損區域的骨修復[19]。miR-17則可以靶向結合轉化生長因子βⅡ類受體(transforming growth factor β receptor Ⅱ，TGFBR Ⅱ)來抑制Treg的分化，削弱自身免疫的負調節作用[20]。miR-124a、miR-19a在調節滑膜細胞增殖和炎性因子的釋放過程中也有一定作用。

Song等[21]發現，除miRNA外，名為Hotair的反轉錄lncRNA大量存在于RA患者的血清外泌體和外周血單核細胞中，其過量表達可誘導活化后的巨噬細胞遷移至炎癥區域；Hotair還會通過活化MMP-2、MMP-13來加速骨和軟骨基質的溶解，破壞溶骨成骨平衡，對關節造成不可逆的病理損傷。

2.3 不同細胞來源的外泌體對RA發病的影響已經證實，細胞來源的外泌體可參與RA發病，但對于其所含的具體成分仍知之甚少，此部分將外泌體按照不同細胞來源進行分類以進一步描述其作用。

RA患者T細胞及單核細胞來源的外泌體可以刺激FLS分泌MMP-1、MMP-3、IL-6、IL-8、單核細胞趨化因子(monocyte chemotactic protein，MCP)-1、MCP-2等[22]；B細胞來源的外泌體主要負責自身抗原的遞呈，其中由B細胞分化而來的淋巴母細胞則可以分泌帶有MHC-Ⅱ和FasL的外泌體誘導CD4+T細胞凋亡，負調節病理性自身免疫反應[23]；CD4+CD25+Foxp3+Treg來源的外泌體可以通過攜帶的miRNA沉默Th1的相關基因來削弱由Th1介導的自身免疫[24]；CD8+CD25+Foxp3+Treg來源的外泌體則能夠抑制自身殺傷性T細胞，延緩RA發病和病情進一步惡化[25]；成熟DC分泌的外泌體可利用MHC分子和共刺激分子等向T細胞呈遞抗原，觸發自身免疫反應[26]；未成熟DC來源的外泌體低表達共刺激分子，但通過自身高表達TGF-β、CD95L等免疫抑制性配體來抑制自身免疫反應[27]；FLS來源的外泌體攜帶的TNF-α可以活化NF-κB信號通路，強化T細胞的抗凋亡能力，加強T細胞介導的炎癥反應[28]；血小板來源的外泌體也參與RA的炎癥發生過程，與RA活動度密切相關[29]。

3 外泌體在RA臨床診療上的應用

3.1 外泌體在RA臨床診斷上的應用RA患者滑膜液和血清中的外泌體含有一系列與RA發病相關的蛋白，這類蛋白一半以上含有瓜氨酸殘基。這些瓜氨酸化蛋白主要以纖維蛋白原和波形蛋白等形式存在。在RA患者血清樣本中提取的外泌體內檢測到淀粉樣蛋白A(amyloid A，AA)和淋巴管內皮透明質酸受體1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor1，LYVE-1)與CRP之間存在顯著正相關[30]，提示前兩者可能參與RA發病。

與正常人相比，RA患者血清中的外泌體含有7種表達水平明顯上調的lncRNA，分別是Hotair、LUST、anti-NOS2A、MEG9、SNHG4、TUG1及NEAT1；同時，另有6種相同來源的lncRNA表達水平明顯下調，分別是Malat1、SNHG1、mascRNA、PR antisense transcripts、PRINS及HOXA3as[21]。除lncRNA外，包括miR-155、miR-146、miR-let-7b在內的多種miRNA在RA患者與正常人體內也呈現差異表達。

基于外泌體攜帶的蛋白及RNA成分在RA患者體內的異常表達，其可作為生物學標志物提示RA發病。傳統的RA診斷主要根據滑膜液中的炎性標志物、抗類風濕性因子抗體以及抗CCP抗體等，但研究逐漸證實外泌體相關的多種成分也可以作為典型的RA診斷標志物應用于臨床。這類“新型”RA診斷標志物主要有瓜氨酸化蛋白、AA蛋白、LYVE-1蛋白、包括Hotair在內的多種lncRNA、miR-let-7b、miR-221-3p等，可以相對準確地反應疾病狀態。無論是作為RA生物標志物進行診斷，還是作為標志物對患者的預后進行評估，外泌體相關成分都具有極大的臨床潛在價值。

3.2 外泌體在RA臨床實驗性治療上的展望目前為止，所有關于外泌體療法的研究都還只停留在動物實驗階段，這類療法的臨床應用尚未在人體開展。本文對利用外泌體實驗性治療RA動物模型的可能機制進行了歸納(表1)。

表1 外泌體治療RA動物模型(CIA小鼠)的可能機制

此外，還有文獻提到腫瘤細胞來源的外泌體可以對腫瘤微環境中T細胞的增殖、活化起抑制作用，減弱相關免疫應答，并且可以增強抗腫瘤疫苗的作用[31]；而DC來源的外泌體則可以作為抗腫瘤疫苗和生物工程外泌體用于體外和臨床前動物研究[32]。這些研究都表明，外泌體在各類疾病微環境中都有著關鍵性的調節作用，其作為一種重要的信息傳遞介質能夠對疾病的進程產生多方面的影響。因此，利用外泌體的這一特性將其應用于臨床前相關研究是一個有效的切入手段。

總體來說，外泌體療法是一種具有廣闊臨床應用前景的新式療法。外泌體來源廣泛，在體內半衰期長，脂溶性高，能夠跨越包括血腦屏障在內的生物屏障，并且不會引起免疫排斥，其內容物還可以免于酶的降解，有著較好的穩定性，能直接靶向作用于局部特定細胞。但目前外泌體療法尚不成熟，自體外泌體的提取純化、高特異性回收等多方面效果仍不理想。

4 結語

目前來看，外泌體在RA發病中的研究主要集中在外泌體的產生及其作用機制、外泌體相關物質在RA中的生物學功能和外泌體在RA診治中的潛在價值三方面。大量實驗證明，外泌體在RA發病及診治的過程中有其獨特的優越性，是現代醫學在RA診療方面的嶄新突破口。外泌體作為標志物對RA的早期診斷起到的警示作用將極大地改善患者的預后。但由于RA發病機制復雜多變、外泌體提純量化技術不夠完善、外泌體作用的具體機制尚不明朗，將外泌體廣泛地應用于臨床仍然需要進一步的研究。