橡膠樹炭疽病生防內生菌的分離鑒定及抑菌作用研究

李嵐嵐，戴利銘，蔣桂芝，劉一賢，施玉萍，蔡志英

摘? 要：目前化學農藥的缺點日益突顯，研發環保的生防菌劑是當前綠色安全的一種方法，篩選具有抑制橡膠樹炭疽病的生防菌株，為研發新型生防菌劑儲備資源。本文采用組織培養法分離純化橡膠樹內生菌，平板對峙篩選拮抗菌株;通過菌株培養特征、生理生化、根據16S rRNA和gyrA基因序列構建系統發育樹確定其分類地位;采用平板對峙法研究內生菌株的抗菌持久性、穩定性、廣譜性;采用牛津杯法研究拮抗內生菌對殺菌劑的敏感性。從橡膠樹健康的根組織中分離得到4株對橡膠樹炭疽病具有抑制作用的細菌（Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4），系統發育樹分析結果顯示這4株細菌與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）親緣關系很近，且培養性狀和生理生化特征也與解淀粉芽孢桿菌相似。這4株內生菌的抗菌持久性強，抗菌穩定性好;對尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）DFMP1E和MLZZP3、小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）MF375898均有較強的抑菌能力，對茄類鐮刀菌（Fusarium solani）XJ160901的抑制作用較弱;對多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環唑4種殺菌劑均不敏感，有望開發為生防菌劑。

關鍵詞：橡膠樹炭疽病;解淀粉芽孢桿菌;生防內生菌;分離鑒定

中圖分類號：S763.7;S794.1? ? ? 文獻標識碼：A

Isolation， Identification and Bacteriostasis Study of Endophytic Bacteria to Control Colletotrichum Leaf Disease on Rubber Tree

LI Lanlan， DAI Liming， JIANG Guizhi， LIU Yixian， SHI Yuping， CAI Zhiying*

Yunnan Institute of Tropical Crops， Jinghong， Yunnan 666100， China

Abstract： At present， the disadvantages of chemical pesticides are prominent and the development of environmental friendly biocontrol agent is needed. The screening of biocontrol strains with inhibition of rubber anthracnose can reserve resources for the development of new biocontrol agents. The endophyte bacteria of rubber trees were isolated and purified by tissue culture， and growth plate-confrontation was used to screen antagonistic strains. Strain Bac RZS3D4-1， Bac RZS3D4-2， Bac RZS3D4-3， Bac RZS3D4-4 were identified based on morphological， physiological， biochemical characteristics and the phylogenetic tree was constructed with 16S rRNA and gyrA gene sequence. The growth plate-confrontation was used to study the antimicrobial persistence， stability and broad spectrum of endophytic bacteria. The Oxford cup method was used to study the sensitivity of antagonistic endophytic bacteria to fungicides. Four strains of bacteria （Bac RZS3D4-1， Bac RZS3D4-2， Bac RZS3D4-3， Bac RZS3D4-4） were isolated from the healthy root tissues of rubber trees. Phylogenetic tree analysis showed that the four strains were closely related to Bacillus amyloliquefaciens， and the culture traits and physiological and biochemical characteristics were similar to those of B. amyloliquefaciens. The results showed the strains had strong antibacterial persistence and good antibacterial stability， strong antibacterial activity against Colletotrichum acutatum （DFMP1E and Mlzzp3） and Pestalotiopsis microspora （MF375898）， and weak inhibitory effect on Fusarium solani （XJ160901）. They were not sensitive to carbendazim， isocarb， chlorothalonil and difenoconazole， so it is expected to be developed as a biocontrol agent.

Keywords： Colletotrichum leaf disease on rubber tree; Bacillus amyloliquefaciens; biocontrol endophytic microorganism; isolated identification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.028

炭疽病是橡膠樹上的重要病害，嚴重發生時會導致橡膠樹葉片落光，膠乳產量下降[1]。橡膠樹炭疽病在世界各國植膠區均有發生，廣泛分布于南美洲、非洲中部、亞洲南部和東南部等地[2]。主要是由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）引起的，近年來在國內外廣泛流行，發病趨勢日益嚴重，導致橡膠產業損失逐年增加[3-5]。橡膠樹炭疽病危害膠苗、大田幼樹和開割膠樹，侵染嫩葉、葉柄、嫩梢和果實等多個部位，引起嫩葉脫落、嫩梢回枯和果實腐爛等，嚴重時引起膠樹重復落葉和嫩梢回枯，導致開割時間推遲[2-4]。橡膠樹炭疽病在西雙版納地區膠苗苗圃中每年均有發生，1963—1964年，景洪農場的實生苗和芽接苗上就發生了此病，造成嚴重落葉、嫩梢回枯，之后每年該病在橡膠苗圃均有不同程度的發生[3-8]。

目前，橡膠樹炭疽病的防治主要以化學藥劑結合農業防治措施為主。農業防治措施包括改善苗圃陰濕環境、合理施肥，提高膠苗抗病能力;開割膠林，清理枯枝落葉及林間雜草，修剪枝葉，改善膠林通風和光照條件等。通過改善膠樹生長環境，提高膠樹的抗病能力[1， 9-10]。農業防治措施難以大面積推廣，且只能在短期內局部控制病情的蔓延。選用以多菌靈為代表的苯并咪唑類農藥和以咪鮮胺為代表的麥角甾醇類生物合成制劑及其復配劑作為化學防治的主要藥劑[5， 10-13]。然而如果不科學使用化學農藥，或是長期大量使用單一化學農藥進行病害防治，容易造成防效下降及抗藥性等問題，并且大量使用化學農藥也會對土壤和水資源造成嚴重污染，對當地生態環境造成破壞[14-15]。目前，已報道的防治炭疽病的生防菌種類較多，以芽孢桿菌和放線菌研究最為廣泛，芽孢桿菌中又以枯草芽孢桿菌為主，已經在病害防治上得到廣泛應用，多應用于蔬菜瓜果及糧食作物病害的防治[16-19]。梁艷瓊等[20]發現枯草芽孢桿菌Czk1產生的揮發性物質對橡膠樹根病病菌和橡膠樹炭疽病菌具有一定的抑制效果，樊蘭艷[19]發現枯草芽孢桿菌Czk1產生的脂肽類粗提物對橡膠樹炭疽病有抑制作用;劉一賢等[21]發現桑樹鏈霉菌對橡膠樹褐根病、白根病等具有抑制作用。

隨著人們環保意識的逐漸增強和生產需求的不斷發展，化學農藥的缺點日益突顯，尋求高效、環保且行之有效的防治方法勢在必行[14-15]。因此對橡膠樹炭疽病生防菌的開發利用顯得尤為重要，植物內生菌是生防菌的重要來源，所以研究橡膠樹內生菌具有重要意義。本研究從橡膠樹組織中篩選具有生防作用的內生菌，并對篩選出的菌株進行形態學、生理生化和分子生物學鑒定;同時研究拮抗菌對尖孢炭疽菌的抗菌持久性、穩定性、抑菌譜和對殺菌劑的敏感性，為研發新型生防菌劑儲備資源。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試樣品? 從云南省紅河（河口、金平）、景洪等植膠區采集橡膠樹莖干、根等組織（選取成年老橡膠樹），使用打孔器在樹干和根上鉆孔獲取組織樣品，裝入自封袋，填寫標簽，封好袋子，帶回實驗室分離。

1.1.2? 培養基? Luria-Bertani培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar）、高氏一號培養基、營養瓊脂培養基（nutrient agar）、NYD培養基、BPY培養基、PGY培養基、TGE培養基[22-24]。

1.1.3? 主要試劑? 細菌基因組提取試劑盒（Bacteria Genomic Kit）：北京康為世紀生物科技有限公司;PCR引物：北京六合華大基因科技有限公司合成;葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、瓊脂等分析純試劑：生工生物工程（上海）股份有限公司;50%多菌靈可濕性粉劑：江蘇藍豐生物化工股份有限公司，75%百菌清可濕性粉劑：先正達（蘇州）作物保護有限公司，50%異菌脲可濕性粉劑：蘇州富美實植物保護劑有限公司，10%苯醚甲環唑水分散粒劑：先正達南通作物保護有限公司。

1.1.4? 供試菌株? 尖孢炭疽病菌株（C. acutatum）：菌株編號DFMP1E和MLZZP3，膠孢炭疽病菌（C. gloeosporioides）：菌株編號NPS1a-2，棒孢霉落葉病菌（Corynespora cassiicola）：菌株編號JCMP7A，橡膠樹褐根病菌（Phellinus noxius）：菌株編號JPNC4，小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）：菌株編號MF375898，橡膠疫霉（Phytophthora heveae）：菌株編號OJ20180523，五隔大無性孢麗赤殼菌（Calonectria pentaseptata）：菌株編號OJ20180629，茄類鐮刀菌（Fusarium solani）：菌株編號XJ160901，以上靶標病原菌均由本實驗室分離保存。

1.2? 方法

1.2.1? 內生菌的分離與純化? 將從植膠區采集的健康橡膠樹組織洗凈，用0.1%升汞溶液和75%酒精表面消毒，用滅菌水反復沖洗，吸干表面水份，去掉植物組織最外層，切成小塊，分別放入LB、PDA和高氏1號平板培養基中培養，以最后一次清洗植物組織的滅菌水作為對照[25-28]。將平板放入28 ℃培養箱培養，1～2 d后取出LB平板，挑取單菌落劃線接種到新的LB平板，并編號;4～5 d后取出PDA和高氏1號平板，挑取單菌落分別接種到相應的培養基上，并編號。純化后分別于斜面4 ℃保存、甘油管–80 ℃保存[29]。

1.2.2? 拮抗內生菌初篩和復篩? 以尖孢炭疽菌株MLZZP3和膠孢炭疽菌株NPS1a-2作為指示菌，采用平板對峙培養法進行初篩，觀察有無抑菌帶，篩選出具有拮抗作用的內生細菌[30-31]。

對初篩得到的有拮抗作用的內生細菌進行復篩，采用平板對峙法，以只接病原菌作為對照，培養7 d后，計算指示菌抑菌率。抑制率=（對照組菌落生長直徑–處理組菌落生長直徑）/（對照組菌落生長直徑–接種菌塊直徑）×100%[15， 30-32]

1.2.3? 拮抗內生菌的鑒定? 菌落形態特征：將拮抗內生菌Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4分別接種在LB、NA、PDA、NYD、BPY、PGY、TGE等培養基上，28 ℃恒溫培養1 d，觀察4株內生菌的菌落形態。參考《常見細菌系統鑒定手冊》[33]和《伯杰細菌鑒定手冊》[34]的方法，對拮抗菌進行革蘭氏染色，并在光學顯微鏡下觀察染色結果和菌株形態。

生理生化指標：參考《常見細菌系統鑒定手冊》[33]和《伯杰細菌鑒定手冊》[34]的方法，對拮抗菌的M.R試驗、V-P試驗、接觸酶試驗、淀粉水解、硝酸鹽還原、脂酶試驗、明膠水解、反硝化、檸檬酸鹽利用等生理生化指標進行測定。

系統發育學特征：提取菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的基因組總DNA，采用16S rRNA基因的通用引物對提取的基因組DNA分別進行PCR擴增，同時采用引物gyrA-F（5-CAGTCAGGAAA TGCGTACGTCCTT-3）和gyrA-R（5-CAAGGTA ATGCTCCAGGCATTGCT-3）對gyrA基因進行擴增[35-37]。

1.2.4? 拮抗內生菌的抗菌持久性研究? 以尖孢炭疽菌株DFMP1E為指示菌，采用平板對峙法，以只接種指示菌作為對照，28 ℃恒溫培養，培養5、10、15、20、25、30 d后，測量指示菌菌落直徑，計算指示菌的抑菌率[38-39]。

1.2.5? 拮抗內生菌的抗菌穩定性研究? 以尖孢炭疽菌株DFMP1E為指示菌，采用平板對峙法，將拮抗菌在培養基上連續轉接多代，以不同代的拮抗菌作為處理，以只接種指示菌的處理作為對照，28 ℃恒溫培養7 d后，計算指示菌的抑菌率[40-41]。

1.2.6? 拮抗內生菌抗菌譜研究? 以菌株編號為DFMP1E、MLZZP3、NPS1a-2、JCMP7A、JPNC4、MF375898、OJ20180523、OJ20180629、XJ160901的9個病原菌作為指示菌，采用平板對峙法，計算指示菌的抑菌率，評價拮抗菌的抗菌廣譜性[38， 42-43]。

1.2.7? 拮抗內生菌對殺菌劑的敏感性? 牛津杯法測4株拮抗內生細菌對多菌靈（1388.9 mg/kg）、異菌脲（694.4 mg/kg）、百菌清（2777.8 mg/kg）、苯醚甲環唑（200 mg/kg）的敏感性，每個處理重復3次，以加無菌水的處理作為對照，28 ℃恒溫培養1～2 d后，觀察是否產生抑菌圈[44-45]。

2? 結果與分析

2.1? 內生菌的分離與純化

從云南省植膠區紅河（河口、金平）、景洪等地采集橡膠樹根、莖干組織樣品共25份，分離得到156株菌，其中64株真菌，92株細菌。

2.2? 拮抗內生菌的初篩和復篩

通過平板對峙法對分離得到的156株內生菌進行初篩和復篩，篩選得到4株對炭疽病菌有較好抑制作用的細菌菌株（圖1），分別編號為：Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4。結果顯示4株菌對供試病原真菌都具有抑制作用，對尖孢炭疽病菌MLZZP3（C. acutatum）的抑菌率分別為74.80%、62.59%、75.47%、74.35%，對膠孢炭疽病菌NPS1a-2（C. gloeosporioides）的抑菌率分別為59.52%、47.48%、61.87%、60.78%。

2.3? 拮抗內生菌的鑒定

2.3.1? 菌落形態特征? 拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4在LB、NA、PDA、NYD、BPY、PGY、TGE 7種供試培養基中均能良好生長，但在不同的培養基上菌落形態有差異（表1）。4株菌革蘭氏染色均為陽性，菌體呈桿狀，兩端鈍圓。

2.3.2? 生理生化特征? 菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的生理生化特征如表2所示，4株菌的甲基紅試驗均為陰性，V-P試驗均為陽性，均能產生過氧化氫酶、淀粉水解酶，均能使硝酸鹽還原、明膠水解，均不產生脂酶，均能夠利用檸檬酸鹽，反硝化反應均為陽性。

2.3.3? 系統發育學特征? 用16S rRNA基因通用引物對4株拮抗菌株進行序列擴增并測序，得到1400 bp左右的序列，將序列提交到GenBank，獲得登錄號分別為MT747964、MT747965、MT747966、MT747967，經BLAST比對，選取覆蓋度和相似性較高且有效發表的菌株進行16SrRNA基因序列的系統發育分析，通過構建系統發育樹發現，從聚類結果可以看出4株拮抗菌株與芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）聚在同一個分支上。16S rRNA基因序列比對結果顯示4株菌株均屬于芽孢桿菌。

gyrA基因序列提交到GenBank，獲得登錄號分別為MW041644、MW041643、MW041642、MW041641。菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的gyrA基因序列與解淀粉芽孢桿菌L-1、X-L、TN0501、10A18的gyrA基因序列同源性較高，與解淀粉芽孢桿菌L-1、X-L、TN0501、10A18屬同一分支（圖2）。

綜合拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4- 2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的菌落形態特征、革蘭氏染色、生理生化指標與16S rRNA基因序列和gyrA基因序列系統發育樹分析，將拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

2.4? 拮抗內生菌的抗菌持久性研究

培養30 d，對照組病原菌菌落直徑從5 mm增長到86.10 mm，接種拮抗菌株Bac RZS3D4-1的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長到27.06 mm，接種Bac RZS3D4-2的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長到35.34 mm，接種Bac RZS3D4-3的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長到24.91 mm，接種Bac RZS3D4-4的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長到27.43 mm。以上數據表明，培養30 d后接種拮抗菌株的處理病原菌菌落的增長速度明顯小于對照組，表明4株拮抗菌株均能持久抑制病原菌的生長。

拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4不同培養時間對病原菌的抑制率見表3，隨著培養時間的延長，抑菌率呈先升后降的趨勢，而且前期增長趨勢明顯，后期下降趨勢不明顯，后期抑制率無顯著性差異，表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對病原菌的抑制作用較持久。

2.5? 拮抗內生菌的抗菌穩定性研究

拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的不同世代對尖孢炭疽病菌DFMP1E均有較高的抑制作用。4株拮抗菌株從第1代到第10代對尖孢炭疽病菌DFMP1E的抑制率有一定波動，分別為：菌株Bac RZS3D4-1的抑制率為（69.24%±0.03%）～（72.95%± 0.09%），菌株Bac RZS3D4-2抑制率為（56.69%± 0.58%）～（60.63%±0.21%），Bac RZS3D4-3的抑制率為（68.81%±0.23%）～（71.64%±0.33%），Bac RZS3D4-4的抑制率為（68.94%±0.60%）～（70.43%± 0.02%）。雖然抑制率有所波動，但波動范圍較小，表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對尖孢炭疽病菌DFMP1E的拮抗作用比較穩定。

2.6? 拮抗內生菌抗菌譜研究

拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對9種供試病原真菌均有抑制作用（表4），表明4株拮抗菌株的抗菌譜較廣，且菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的抑菌能力較菌株Bac RZS3D4-2強。4株拮抗菌株對尖孢炭疽病菌DFMP1E、MLZZP3和小孢擬盤多毛孢MF375898三種病原菌的抑菌能力較強，對茄類鐮刀菌XJ160901的抑制作用最弱。

2.7? 拮抗內生菌對殺菌劑的敏感性

通過拮抗菌對殺菌劑的敏感性試驗，處理組和對照組的拮抗菌都正常生長，沒有產生抑菌圈，表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對供試的多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環唑在生產上使用的最高濃度不敏感。

3? 討論

本研究采用菌落形態學、生理生化指標和分子生物學鑒定相結合的方法對分離得到的內生菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4- 3、Bac RZS3D4-4進行鑒定，結果表明4株菌株的菌落形態和生理生化指標與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）基本一致，且對4株菌的16S?rRNA基因序列和gyrA基因序列擴增測序并構建系統發育樹，16S rRNA基因序列比對結果僅顯示4株菌株屬于芽孢桿菌，無法確定其分類地位;通過gyrA基因序列構建系統發育樹，發現4株菌株與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）的相似度極高，綜上所述初步鑒定菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）[35-37， 46-49]。

4株拮抗菌株對尖孢炭疽病菌DFMP1E（C. acutatum）的抑制作用呈現先升后降的趨勢，而且前期增長趨勢明顯，后期下降趨勢不明顯。前期處理組因拮抗菌的抑制作用，指示菌的生長速度較對照組慢，所以抑制率逐漸增加，且增幅明顯。后期由于培養皿、培養基營養等因素的限制，抑菌率有微弱下降，但是下降趨勢不明顯，4株拮抗菌株對尖孢炭疽病菌DFMP1E的抑菌持久性較好。

4株拮抗菌株的不同世代對尖孢炭疽病菌DFMP1E均有較高的抑制作用，且抗菌穩定性較好。4株拮抗菌株對9種供試病原真菌均有不同程度的抑制作用，抗菌譜較廣，菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的抑制能力較菌株Bac RZS3D4-2強。4株拮抗菌株對常用的4種殺菌劑（多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環唑）不敏感。

菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4相較于土壤分離等其他來源的菌株具有一定優勢：（1）來源于植物組織內，與宿主長期進化，已經適應了宿主的內環境，能夠迅速在植物體內定殖，并且穩定生存;（2）屬于解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌具備快速在植物體內穩定高效地定殖，占據病原菌的生態位點，達到抑制植物病原菌的侵入和定殖的能力[50-58]，能夠長期穩定的達到抑制病害發生發展的作用;（3）4株菌株對殺菌劑不敏感，在開展生防菌劑的研發時，可以考慮與某些殺菌劑混配。前期殺菌劑快速殺滅植物病原菌以控制病害的發生發展，但化學藥劑有效期較短，后期拮抗菌能夠在植物體內定殖，長期穩定地抑制病害的發生發展;并且拮抗菌定殖后，使用該菌不敏感的殺菌劑對定殖的拮抗菌也沒有影響。

目前，雖然生防菌劑在生產上已經得到廣泛應用，多用于蔬菜、瓜果、糧食作物類，而對于高大林木如橡膠樹等的生防菌劑的研發多停留在實驗室階段，因環境、宿主、防效緩慢，防治時效短等因素使生防菌劑的田間應用受到局限[16-19]。本研究主要是以離體實驗為主，為以后的大田試驗提供數據參考，后期將逐步把研究重點放在發酵菌液大田試驗應用和生防菌株在植物體內的定殖等方面。

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責任編輯：謝龍蓮