Hsa_circ_0008957靶MiRNA預測及其表達載體構建

李仙仙 魯艷芹,2,* 韓金祥,2,*

1.山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)生物醫學科學學院 (山東 濟南 250014)

2.山東第一醫科大學第一附屬醫院內分泌科 (山東 濟南 250062)

CircRNA即環狀RNA分子，是通過共價鍵連接的環形構造的不具有5’末端磷酸基和3’末端poly(A)羥基的非編碼RNA分子[1]。根據形成方式不同，circRNAs可分為內含子circRNAs、外顯子circRNAs和內含子-外顯子circRNAs(ElciRNA)，大多數的circRNAs來自蛋白質編碼基因的外顯子[2]。作為環狀RNA，可以有效地防止被RNA酶和核酸外切酶降解掉，比線性RNA的穩定性要強。它會在血漿和外泌體中穩定并廣泛存在，所以circRNAs常作為疾病的生物標記物。CircRNA在不同物種間在進化上具有高度保守性[3]；在動物不同時期、不同組織的表達水平不同，具有表達的時序性與特異性。

circRNA分子能與miRNA中的應答元件(miRNA response element，MRE)結合，作為競爭性內源RNA(competing endogenousRNA，ceRNA)與miRNA結合，中起到miRNA海綿的作用，進而降除miRNA對其目標基因的抑制作用，提高目標基因的表達水平[4]。

CircRNAs可以調控基因的轉錄，ElciRNA可以與RNA聚合酶結合，影響其轉錄活性[5]。如果circRNAs序列中含有其母本基因的起始密碼子，可能會影響其轉錄本的翻譯，可編碼蛋白[6]。近年來，circRNAs在腫瘤疾病[7]、心腦血管疾病[8-9]、神經系統疾病[10]以及骨相關疾病[11]等諸多病理狀態時表達異常，并且其表達水平與疾病的發生階段有緊密聯系[12]，可作為評估病情的潛在指標。

COL1A2是Ⅰ型膠原蛋白的結構基因之一，Ⅰ型膠原蛋白是動物體內分布最廣、含量最豐富的的蛋白質，起到支撐、保護機體的功能，其主要分布在真皮、肌腱、骨和牙本質等[13]。另外它還在腫瘤間質成纖維細胞[14]及血管細胞[15]中表達。COL1A2基因多個獨立突變會引起骨骼和心血管缺陷，如成骨不全和Ehlers-Danlos綜合征[16]。但它的突變與腫瘤的發生機理仍不清楚，只是在某些腫瘤細胞中COL1A2表達上調或者下調，如結直腸癌，肝癌[17]，且COL1A2被鑒定為與轉移潛力高度相關的17個基因之一[18]，COL1A2基因在某些轉移性腫瘤中上調。

Circ RNAs 作為當下的研究熱點，本研究通過對COL1A2基因circRNA進行預測，對hsa-col1a2-circ-0008957基因進行克隆，構建表達載體，該circRNA尚未報道，研究意義較大，可為后續細胞水平機制方面的研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料Trizol試劑購自Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自OMEGA_bio_tek有限公司；PCR試劑、反轉錄試劑盒、Taq酶、內切酶(KpnI和BamHI)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；Clon ExpressⅡ One Step Cloning Kit試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Yeast Extract和TRYPTone均購自OXOID公司；氯化鈉試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；Agar Powder購自索萊寶科技有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞、pCD 2.1質粒均由山東省罕少見病重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 Hsa_COL1A2_circ_0008957序列的獲取及引物的設計及合成。采用circbase網站，查詢以COL1A2為母本基因的circRNA，挑選出hsa_col1a2_circ_0008957，并獲得其基因序列，利用載體的酶切位點通過軟件CE Design V1.04設計基因特異性擴增引物，用于目的基因的PCR擴增，引物序列如下表1(黑體序列為同源臂，小寫序列為酶切位點，下劃線序列為正/反向環化介導序列)，引物均由華大基因有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取293T細胞總RNA，檢測核酸濃度及純度，選取合格的RNA用于cDNA合成。第一步去除基因組DNA；Random Primer(6mer)1μL，dNTP Mix(10nm)1μL，模板RNA 2μg，RNase-free ddH2O補足10μL，65℃5min，4℃ 2min；第二步逆轉錄反應：在第一步反應產物中加入5xPrimer Script Buffer 4μL，RNase Inhibitor0.5μL，Primer Script Reverse Transcriptase 1μL，RNase-free ddH2O 4.5μL，按下列反應程序合成第一條鏈cDNA：30℃10min；42℃60min；70℃15min[19]。產物置于-80℃保存。

1.2.3 PCR擴增Hsa_COL1A2_circ_0008957 以cDNA為模板PCR 擴增Hsa_COL1A2_circ_0008957，PCR 反應體系20 μL：2xGCBuffer 10 μL，dNTP Mixture(2.5nm)1.6μL，TaKaRa Taq 0.1μL，模板cDNA(1000ng)，上下游引物各1μL，RNase-free ddH2O補足20μL。PCR反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性15s，50℃退火20s，72℃延伸30s，共35個循環。72℃延伸5min，4℃結束反應。

1.2.4 pCD2.1-hCOL1A2-circ-0008957重組載體構建及檢測 PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離，將目的DNA片段進行切膠回收純化。pCD2.1載體用限制性內切酶KpnⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，37℃酶切4h，電泳并回收酶切產物，與目的片段進行同源重組。將重組產物轉化進入大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含氨芐青霉素(Amp+)的LB固體培養基上涂布，置于37℃培養箱倒置培養12～16h。挑取單菌落克隆，在含氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養基中繼續培養，并將菌液進行菌液PCR鑒定，挑取鑒定正確的的單克隆菌液利用質粒提取試劑盒提取質粒，并最終進一步酶切驗證，將鑒定正確的質粒送去華大基因進行Sanger測序，將測序正確的質粒進行擴大培養，并用75%甘油保存在-80℃冰箱。

1.2.5 Hsa-COL1A2-circ-0008957生物信息學預測 應用circBANK(http://www.circbank.cn/)軟件和Circular RNA Interactome 軟件(https://circinteractome.nia.nih.gov/)對hsa-COL1A2-circ-0008957進行生物信息學分析。

2 結果

2.1 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體的驗證用限制性內切酶將pCD2.1原載體雙酶切后，獲得100bp左右的片段，與預期相符(圖1A)；PCR擴增結果顯示，擴增條帶大小約372bp，與預期相符(圖1B)；將純化的目的基因與線性載體pCD2.1進行連接后，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定,出現了與預期相符的目的條帶，大小為372bp(圖1C)；提取質粒后對其進行雙酶切驗證，重組片段也出現了372bp的目的條帶(圖1D)。

圖1 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體的驗證

2.2 重組載體pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957 Sanger測 將陽性重組質粒進行測序，測序結果在NCBI上進行BLAST比對分析，與預期結果完全一致，表明成功構建pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體(圖2)。

圖2 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957 Sanger測序結果

2.3 Hsa-COL1A2-circ0008957生物信息學預測應用軟件分析，其在circBANK中的ID為hsa_circCOL1A2_116，開放閱讀框長度(ORF-SIZE)為171bp；存在IRES(internal ribosome entry site)序列，可通過此啟動翻譯行使編碼蛋白的功能，這與其他普通線性RNA是不同的；網站中提供的coding_prob卻為0.0019(范圍為0-1)，分數較低，表明其編碼潛力較低，其功能還待進一步研究，在網站中檢索到該circRNA位于其母本基因COL1A2的mRNA的外顯子中，且被發現存在于成骨細胞、皮下前脂肪細胞、膝關節軟骨細胞、平滑肌細胞中。Circular RNA Interactome 軟件預測到hCOL1A2-circ-0008957相互結合的miRNA有17種，其中與成骨分化和骨質疏松相關的miRNA有5種，該circRNA與5種miRNA的結合位點如圖3。

圖3 circRNA與靶向MiRNA的結合位點

3 討論

CircRNA較其他線性RNA研究開始較晚，隨著circRNA研究的深入開展，越來越多的circRNA被發現。CircRNA多在腫瘤中報道，有少量關于骨相關疾病的報道。本研究中，hsa-COL1A2-circ-0008957在之前從未報道，該circRNA無編碼蛋白的功能，猜測它靶向miRNA分子海綿進而調節成骨分化。通過circinteractome數據庫得出17種靶向miRNA分析，其中hsa-miR-1305、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-421、hsa-miR-548c-3p和hsa-miR-628-3p五種miRNA與骨質疏松，成骨分化相關；hsa-miR-618、hsa-miR-561、hsa-miR-1233、hsa-miR-1305、hsamiR-558、hsa-miR-577、hsa-miR-518a-5p、hsamiR-527、hsa-miR-1200和hsa-miR-1183與腫瘤疾病相關；hsa-miR-561可作為腫瘤的生物靶標，hsa-miR-1200也可作為妊娠糖尿病的靶標；hsa-miR-1225-3p、hsamiR-1183和hsa-miR-197與自身免疫系統疾病相關。COL1A2作為該circRNA的母本基因，它與骨骼發育有關，為后續研究其在成骨分化中的作用奠定基礎。