電針刺激“天樞”-“足三里”對肝臟缺血再灌注損傷大鼠腸道菌群和內毒素的影響

呂針黎， 魏 來,2， 譚思由，李 蓓，楊 浩，孔高茵,2

(1.湖南省人民醫院/湖南師范大學附屬第一醫院，長沙 410005；2.湖南省圍術期加速康復麻醉臨床醫學研究中心，長沙 410005)

肝葉切除和肝移植等肝臟外科手術常采取阻斷入肝血流等方式控制出血，而由此操作造成的肝臟血流暫時性阻斷及隨后的血流再灌注通常引起肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion, HIRI)[1-2]。肝門阻斷后門脈回流受阻可導致腸道循環淤血和代謝產物蓄積,阻斷解除時肝臟內的毒性物質可經血液流至腸道導致腸道雙重損害，導致腸道屏障功能受損、腸道菌群失調、細菌和內毒素移位到體循環誘發菌血癥[3]。HIRI 引發的腸道損傷等一些列反應可誘導大量相關炎性介質和細胞因子產生釋放，促使機體發生全身炎癥反應綜合征。因此,腸道也被稱為多器官功能衰竭(Multiple-organ-failure syndrome,MOFS)的“motor”[4]。有研究表明，缺血再灌注損傷導致的多種術后并發癥，如感染，會顯著增加術后死亡率[5-6]，而肝移植術后早期并發癥以感染為主, 且在術后早期死亡的病例中，感染約占64%[7]，這可能與肝臟血流阻斷再灌注導致腸粘膜損害引起的細菌/內毒素移位有關[8]?，F已有實驗證實電針預處理對腦、心臟等重要臟器的缺血再灌注具有保護作用[9-10]。同時，亦有研究證明針刺“天樞”“足三里”等穴位具有調節腸道菌群組成的作用[11-12]。而現有研究中，缺乏探究此二穴對HIRI 所致的腸道損傷作用的相關研究。故而本研究擬通過電針預處理“天樞”及“足三里”穴，觀察其對HIRI 大鼠腸道菌群組成及內毒素變化的影響，旨在豐富穴位刺激改善HIRI 相關腸道功能損害的理論機制、為臨床實踐提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF 級雄性SD 大鼠32 只，體質量200±20g(購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(湘)2015-0013，)，飼養于湖南師范大學附屬第一醫院動物房內，正常進食飲水，適應性生存7d。按隨機數字表分為假手術組、模型組、天樞-足三里穴組及非經非穴組，每組各8 只。術前禁食6～8 h，不禁飲。

1.2 主要儀器和試劑 儀器及設備：SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針療儀(蘇州醫療用品廠有限公司)，不銹鋼毫針(華佗牌，蘇州醫療用品有限公司)，AnymicroDSSTM 圖像采集系統，德國LEICARM2245 型石蠟切片機，2.5L厭氧產氣包(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)；試劑：蘇木素-伊紅(HE)染色液(北京普利萊基因技術有限公司)，ALT、AST、D-乳酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，內毒素檢測試劑盒(酶聯生物)，大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌選擇性培養基(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)；藥品：麻醉劑采用濃度為10%的水合氯醛溶液(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.3 HIRI 模型制備及取材方法 對于模型組、天樞-足三里組及非經非穴組大鼠，采用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定大鼠、備皮、消毒，于劍突下沿正中線做一約3cm 長切口，參照Filos 等[14]方法建模，即暴露第一肝門，并使用無創血管夾夾閉阻斷入肝血流30min；隨后松開血管夾，腹腔滴入0.5ml 生理鹽水后縫合腹部切口；4h 后肝臟再灌注完成。模型構建成功后，可觀察到肝臟組織呈花斑和蒼白條索樣紋路改變，腸壁呈深紫色并出現廣泛水腫。隨即經腹主動脈取血3～5mL 于采血管中，4℃直立靜置30min 后于4℃、3000 r/min 離心20 min，取上清液-20℃冰箱保存備用；迅速切取末端回腸6cm 于10%中性福爾馬林溶液中固定；無菌操作下取腸內容物0.1g，置于裝有玻璃珠的無菌搖菌管中，加入0.9mL 0.9%生理鹽水，200r/min 震蕩10min，使腸內容物均質化，此即為第一稀釋度10-1，備用。假手術組僅行剖腹、第一肝門暴露30min 后縫合，4h 后取材。

1.4 電針干預方法 天樞-足三里穴在建模前按照《實驗針灸學》，取大鼠雙側“天樞”穴及“足三里”穴，消毒后使用0.33 mm× 13mm 的無菌針灸針直刺入相應穴位，左右各一針，針刺深度約為3mm，其中同側“天樞”和“足三里”分別連接電針儀的正負極，并采用疏密波，頻率2/100Hz，強度以能見到大鼠肌肉輕微顫動為宜，干預時間為30min。

非經非穴組在“天樞”及“足三里”外側旁開5mm的非經非穴區，分別用針灸針直刺約3mm，其中同側兩針分別連接電針儀正負極。干預參數及干預時間同天樞-足三里組。

1.5 培養基配制方法 分別嚴格按照培養基配制說明書配制EMB 大腸桿菌培養基、Pfizer 腸球菌培養基、MRS 乳酸桿菌培養基以及莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS 雙歧桿菌培養基。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 血清學方法測定血清中谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT) 和谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平 取各組干預結束后已離心的大鼠血清，嚴格按ALT 及AST 檢測試劑盒說明書步驟操作。

1.6.2 形態學觀察 取各組于10%中性福爾馬林溶液中固定的腸道組織，HE 染色后光鏡下觀察各組腸道組織病理形態，以Chiu’s 法評價腸黏膜損傷程度：0 分，正常絨毛；1 分，絨毛頂端下間隙增寬；2 分，絨毛頂端上皮脫落、破潰；3 分，絨毛頂端破壞擴展到基底部；4 分，上皮完全脫落；5 分，固有層崩潰，出現潰瘍及出血點。

1.6.3 ELISA 法測定血清D-乳酸(D-lactate,DLac)、內毒素(endotoxin,ET)水平 嚴格按照D-乳酸及內毒素檢測試劑盒說明書步驟操作。

1.6.4 細菌培養及菌落計數 取10-1腸內容物稀釋液進行10 倍倍比稀釋，經預實驗后，分別取稀釋度為10-5、10-6、10-6、10-4標本200uL，分別滴加于EMB 大腸桿菌培養基、腸球菌培養基、MRS 乳酸桿菌培養基、 改良MRS 雙歧桿菌培養基上,每一組標本分別滴加至兩個培養基。然后用無菌“L”型棒分角度旋轉涂抹平板，使菌液均勻的涂布在整個平皿表面。大腸桿菌(EMB)和腸球菌(EC)屬置于37℃溫箱中培養24 小時；雙歧桿菌(BS)和乳桿菌屬(LBS)置于厭氧袋中，37℃培養48小時?；罹嫈担河嫈到Y果以log 菌落形成單位/g(CFU/g) 表示。公式：CFU/g=每一稀釋度菌落數×稀釋倍數/滴種體積(mL)。

1.7 統計學分析 以SPSS 21.0 統計軟件對結果進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD 檢驗進行兩兩比較，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下各組大鼠腸道組織病理改變及病理損傷評分 假手術組示大致正常絨毛；模型組腸粘膜損傷明顯，絨毛破損脫落嚴重，可見上皮層與固有層分離，伴有毛細血管擴張充血；天樞-足三里組可見上皮下間隙擴張，可見毛細血管充血，偶見絨毛破損；非經非穴組可見上皮下間隙增大、毛細血管充血，絨毛破損。見圖1。Chiu’s 法評分結果顯示：模型組高于假手術組(P<0.01)， 天樞-足三里組低于模型組及非經非穴組(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠腸道組織Chiu’s法評分比較(分)

圖1 各組大鼠腸道組織光鏡下病理學改變(HE, ×100)

2.2 各組大鼠血清中ALT 和AST 水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠ALT、AST 含量顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，天樞-足三里組ALT、AST 含量均降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清ALT和AST含量比較(卡門氏單位)

2.3 各組大鼠血清中D-乳酸及內毒素水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠內毒素、D-乳酸含量顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，天樞-足三里組內毒素、D-乳酸含量均降低(P<0.01)；且天樞-足三里組內毒素含量低于非經非穴組(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠血清中D-乳酸及內毒素水平比較

2.4 各組大鼠腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌菌落數量比較 與假手術組相比，模型組大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數量降低(P<0.01)，大腸桿菌菌落數量增加(P<0.01)；與模型組相比，天樞-足三里組大鼠腸道菌群中雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數量增加(P<0.01)，大腸桿菌菌落數數量降低(P<0.01)，但腸球菌各組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌菌落數比較(logCFU/g)

3 討論

有研究[13]指出，當發生肝臟缺血再灌注時，術后肝功能衰竭似乎是肝切除術后最嚴重的并發癥之一，但造成術后肝功能衰竭的諸多因素也可能是造成腸道屏障損害的原因。而HIRI 造成腸粘膜損害進而導致腸道屏障受損的原因又可包括門脈高壓、活性氧(ROS)的釋放、炎癥反應、細胞凋亡或者細胞壞死等[3]。已有報道證實HIRI 不僅對肝臟造成損傷，還會由于再灌注后的氧化應激以及炎癥反應引起其他遠隔器官如肺、腎、腸道、胰腺、腎上腺和心臟等器官的損傷，從而造成MODS。Filos 團隊[14]及 Lemaire 團隊[15]分別通過對大鼠及豬進行構建肝臟缺血再灌注模型，觀察到細菌和內毒素的移位增加，以及腸道屏障的早期破壞。同時由于門脈阻斷導致腸道水腫，腫脹的腸壁又致腹內壓過高進而可能加劇腸道灌注的不足以及腸道屏障的損害[16-17]。且腸道蠕動功能的下降也會導致腸道細菌的過負荷，這也會反過來對腸粘膜造成損害[18]。在本試驗中，通過對大鼠進行30min 的肝門阻斷，可明顯觀察到腸壁由淡粉色變為深紫色并表現出廣泛水腫。本實驗結果也顯示出模型組與假手術組相比，血清中內毒素水平更高，并且菌群數量變化明顯。

在腸道微生物中，乳酸桿菌和雙歧桿菌在維持腸道粘膜的定植抗性以及保護腸道屏障方面發揮了重要的作用[19-20]。而任何引起腸道微生態紊亂的因素都可能使腸道優勢繁殖的細菌如大腸桿菌、腸球菌等突破受損的腸道粘膜屏障而移位。Hui-Chun Xing[21]等通過對肝臟缺血再灌注大鼠的回腸內容物進行培養，發現I/R 組乳酸桿菌及雙歧桿菌菌落數少于未經過I/R 的空白組大鼠，腸桿菌菌落數多于空白組大鼠，同時I/R 組內毒素水平也明顯高于空白組。同時通過添加外來益生菌乳酸桿菌及雙歧桿菌菌株，發現益生菌組大鼠的肝臟、腸道病理改變以及內毒素水平均得到改善及降低。而D-乳酸是胃腸道固有細菌的產物,哺乳類動物既不產生D 乳酸,也不能或僅能緩慢代謝D-乳酸,因此循環血中D-乳酸濃度的增加實際上反映了腸黏膜通透性增加。因此，本實驗通過對大鼠回腸內容物進行選擇性細菌培養和血清D-乳酸水平測定，發現模型組大鼠回腸內容物中乳酸桿菌及雙歧桿菌菌落數少于假手術組，腸桿菌菌落數高于假手術組，血清D-乳酸水平顯著高于假手術組，也說明HIRI 使腸道粘膜受損。

現代研究表明穴位刺激(Acupoint Stimulation,AS)通過對神經、內分泌、免疫等系統的調控，減輕組織氧化應激損傷、降低炎癥因子的產生、調節機體免疫功能[22]，從而對多個器官和系統產生保護作用。而電針(Electric Acupuncture，EA)作為AS 的常用方法之一,在刺激強度、刺激頻率等方面更具量化與標準化，從而被更加廣泛的應用于臨床。既往研究中[23-24]，通過對不同模型大鼠進行天樞穴(ST25)、足三里穴(ST36)等穴位的不同AS，發現其腸道菌群的組成得到改善。在本實驗中，通過EA 天樞(ST25)及足三里穴(ST36)后與模型組相比，發現天樞-足三里組大鼠腸道菌群中雙歧桿菌及乳酸桿菌菌落數增加，大腸桿菌菌落數下降，且內毒素及代表腸道屏障功能的D-乳酸水平也有所下降。由此也可能說明電針刺激天樞及足三里穴可以保護腸道屏障功能以及改善內毒素血癥。

綜上，本實驗結果表明，對HIRI 大鼠進行天樞(ST25)及足三里穴(ST36)的電針預處理，通過病理結果可以觀察到腸道粘膜狀況得到改善，血清內毒素及D-乳酸水平下降，以及腸道雙歧桿菌菌落數、乳酸桿菌菌落數的增多與大腸桿菌菌落數的減少。表明電針預處理天樞(ST25)及足三里穴(ST36)可能會對HIRI 后的腸道屏障產生保護作用，使腸道菌群的組成以及內毒素血癥得到改善。而在未來可以通過16S rRNA 高通量測序等方法對腸道微生物相對豐度、多樣性以及整體結構與組成進行更詳盡的分析，從而更好的指導臨床應用。