Nrf2/HO-1信號通路在急性肺損傷中的研究進展

孔凱文,孟 巖綜述，鄧小明審校

0 引 言

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS)是由于肺泡-毛細血管屏障通透性增加導致的雙側肺水腫和低氧血癥的急性發作，因高死亡率和缺乏有效的治療藥物一直備受關注[1]。ALI/ARDS的發病機制尚未完全了解，目前認為氧化應激和劇烈的炎癥反應在ALI/ARDS進展種扮演著重要角色[2]。核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2)是細胞內一種重要的轉錄因子，被激活后可促進抗氧化酶和解毒酶的表達，在維持氧化還原穩態、代謝平衡和蛋白質穩態中起關鍵作用[3]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)是Nrf2的其中一個下游，是血紅素代謝過程的限速酶，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等多種作用[4]。最近的研究發現，Nrf2/HO-1信號通路在ALI/ARDS中能夠減輕炎癥反應和氧化應激損傷，抑制細胞焦亡和鐵死亡，進而減輕肺損傷。本文就Nrf2/HO-1信號通路在ALI/ARDS的研究進展作一綜述，以期為ALI/ARDS的治療和特效藥物的研發提供新的思路。

1 ALI/ARDS的定義

1967年，Ashbaugh等[5]通過一份病例報告對ARDS進行了初步描述，這份病例報告描述了成人危重癥患者出現急性低氧血癥、非心源性肺水腫、肺順應性降低、呼吸做功增加以及需要正壓通氣等臨床癥狀，這些癥狀的出現與一些臨床疾病相關，如胸部外傷、肺炎、膿毒癥和誤吸等。在這之后提出并使用了多種定義，直至1994年,美國-歐洲共識會議(the American-European Consensus Conference，AECC)的定義發表。AECC將ARDS定義為急性低氧血癥(PaO2/FIO2≤ 200 mmHg)，后前位胸片示雙側肺浸潤影，臨床無左心房高壓的證據；AECC還引入了急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的概念，采用的標準和ARDS類似，但低氧血癥相對較輕(PaO2/FIO2≤ 300 mmHg)[6]。2012年歐洲重癥醫學年會對這一定義進行了更新，制定了柏林定義，根據氧合水平，將ARDS分為輕度(200 mmHg

2 ALI/ARDS的病因和發病機制

ALI/ARDS的常見病因和危險因素分為兩種：①直接因素，肺炎(細菌和病毒，真菌較少見)、胃內容物誤吸和外傷(如肺挫傷)、缺血-再灌注損傷(體外循環和肺切除術后)、呼吸機相關性肺損傷、溺水(誤吸海水或淡水)以及吸入煙霧或有毒氣體等；②間接因素，由其他系統性疾病所致的肺損傷，如非肺源性膿毒癥、急性胰腺炎、輸血相關急性肺損傷以及失血性休克等[2]。

目前ALI/ARDS的病理機制尚未完全了解，但已有研究證明氧化應激和炎癥反應在ALI/ARDS的病理過程中扮演著十分重要的角色。各種損傷性刺激，如細菌、病毒、高氧、胃內容物誤吸以及呼吸機相關性肺損傷等均會直接破壞肺組織，同時誘導炎癥反應，從而對肺組織造成二次損傷。首先，損傷性刺激會激活Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages，AMs)表面的Toll樣受體，誘導趨化因子的分泌，從而將循環中的免疫細胞募集到肺泡內[8]。中性粒細胞遷移穿過肺泡上皮后，釋放毒性介質，包括蛋白酶、活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及中性粒細胞胞外殺菌網絡(neutrophil extracellular traps，NETs)[9]。中性粒細胞在宿主免疫反應中扮演著重要角色，但其釋放的毒性介質同時損傷了肺泡毛細血管內皮和肺泡上皮。肺泡上皮損傷還包括肺泡上皮細胞質膜的損傷，這可能是細菌釋放的成孔毒素、高氧和機械拉伸等引起的[10]。此外，血管內皮鈣粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)的穩定性降低，肺泡毛細血管通透性增加[11]。這會導致大量紅細胞滲出并釋放出血紅蛋白，血紅蛋白分解后引起肺泡內游離血紅素水平增加，加劇氧化應激損傷[12]?？傊?，以上因素綜合作用增加了肺泡-毛細血管屏障的通透性，進一步促進了炎性細胞的遷移，同時更多富含蛋白質的水腫液流入肺泡腔，顯著影響了氣體交換，最終導致患者低氧血癥，需要機械通氣。隨著病程進展，肺泡毛細血管損傷和肺間質水腫逐漸加重，CO2排出能力下降，從而引發高碳酸血癥，這也是ALI/ARDS患者肺死腔增加的原因[13]。此外，ALI/ARDS期間，許多內源性修復機制也受到了特異性抑制。例如低氧血癥、高碳酸血癥和流感病毒等其他因素會下調鈉離子通道和/或下調Na+/K+-ATP酶的活性，導致ALI/ARDS患者的肺泡液清除功能受損[14]。高碳酸血癥還會抑制肺泡上皮細胞的增殖，影響肺組織的自我修復[15]。

3 Nrf2/HO-1信號通路的活化

Nrf2/HO-1信號通路活化的關鍵是提高Nrf2的活性，這取決于其蛋白質水平，因此通過調控Nrf2蛋白的合成和降解過程可改變其活性。在正常生理狀態下，Nrf2存在于細胞質中，Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)分別與Nrf2的DLG模體和ETGE模體結合，其中與ETGE模體的親和性較高，而與DLG模體的親和性較低[16]。Cullin 3(CUL3)以支架蛋白的形式與Keap1的BTB結構域結合共同形成E3泛素連接酶復合體，然后該復合體通過Keap1特異性識別Nrf2并介導其泛素化，泛素化后的Nrf2被26S蛋白酶體降解[17]。這種降解機制使得細胞質中的Nrf2蛋白維持在一個較低的水平，確保只有一小部分新合成的Nrf2可到達細胞核以調節靶基因的基礎表達。當外界刺激存在時，如ROS、親電子試劑和來自三羧酸循環以及糖酵解過程的中間代謝產物等，可迅速對Keap1內的半胱氨酸殘基進行氧化修飾，以解除其對Nrf2的抑制作用[18]。先前認為Keap1與DLG 模體結合的喪失是Nrf2蛋白穩定性和氧化應激期間水平增加的主要途徑，但最近一項關于蛋白質-蛋白質相互作用的研究表明，親電子試劑不影響Keap1與Nrf2的DLG模體或ETGE模體的結合[19]。Keap1內半胱氨酸殘基的氧化使其無法招募E3連接酶進行Nrf2的泛素化，Nrf2的半衰期隨之延長，在細胞質種逐漸蓄積。此外，自噬蛋白p62是解除Keap1對Nrf2的抑制作用的另一個機制。p62通常會標記受損的蛋白質或細胞器以供自噬體識別，然后在溶酶體中進行降解。p62蛋白中的STGE模體與Nrf2的ETGE模體結構相似，也可與Keap1結合[20]。PI3K-Akt-mTOR信號通路的激活會誘發STGE模體中Ser349的磷酸化，使p62與Keap1結合得更緊密，然后通過自噬增加Keap1的降解[21]。因此，自噬過程常常伴隨著Nrf2蛋白的積累。

Nrf2在細胞質中蓄積后進入細胞核，與小Maf蛋白形成異二聚體，然后共同與靶基因啟動子區域的抗氧化反應元件(antioxidant response elements，ARE)結合[22]。在許多抗氧化基因和解毒基因的啟動子區域中都包含ARE，均可被Nrf2激活后，因此Nrf2在保護細胞免受外界刺激損傷的過程中扮演在重要角色。HO-1是Nrf2的其中一個下游，作為一種應激蛋白和代謝酶，參與調節細胞穩態、免疫防御以及炎癥反應，在多種急性器官損傷中發揮保護作用。近來的研究表明，ALI/ARDS患者的肺泡內血紅蛋白和游離血紅素的水平顯著增高，加劇了氧化應激損傷和Toll樣受體激活后引發的炎癥反應[12]。HO-1是血紅素降解過程的限速酶，能夠催化血紅素降解為膽綠素(biliverdin，BV)、Fe2+和一氧化碳(carbon monoxide，CO)[4]。然后，BV在膽綠素還原酶的作用下轉化為膽紅素(bilirubin，BR)，BV和BR均有很強的抗氧化活性，新的研究還發現BR具有免疫調節作用以及對脂質代謝過程的調控作用[23]。Fe2+具有促氧化作用，但當它合成鐵蛋白后具有抗氧化活性，能夠發揮細胞保護作用[24]。CO可改善線粒體功能，從而調節下游信號通路，最終產生抗凋亡、抗炎和免疫調節作用[25]。

在正常生理狀態下，肺組織內存在一定水平的Nrf2和HO-1，這對維持細胞內穩態十分重要。目前，已有多項研究發現，Nrf2/HO-1信號通路通過清除過量的ROS、抑制細胞因子風暴、鐵死亡和細胞焦亡，在多種因素誘發的ALI/ARDS中發揮保護作用。

4 Nrf2/HO-1信號通路在ALI/ARDS中的保護作用

革蘭陰性菌感染是誘發ALI/ARDS的重要原因之一，革蘭陰性菌外膜的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，可引起劇烈的炎癥反應。在經氣管內注射LPS誘發ALI/ARDS的小鼠模型中，炎癥反應在2～4 h內發生，并在24～48 h達到高峰，小鼠肺組織表現為彌漫性肺泡損傷、中性粒細胞浸潤和肺水腫[26]。研究發現，Nrf2/HO-1信號通路的激活可以減輕LPS誘發的炎癥反應，包括抑制AMs和肺泡上皮細胞釋放炎性因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α等)，以及減少中性粒細胞的遷移等，從而減輕肺水腫[27]。LPS誘發ALI/ARDS的另一個重要機制是氧化應激，而且ROS的病理性增加還會加劇炎癥反應，因此抑制氧化應激是減輕肺損傷的關鍵。在LPS誘發ALI/ARDS的小鼠模型中，Nrf2/HO-1信號通路被激活后可顯著逆轉LPS誘發的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的表達減少，同時清除過量生成的ROS，從而減輕氧化應激損傷，減輕肺水腫，促進肺泡-毛細血管屏障的修復[28]。目前，對于Nrf2/HO-1信號通路在ALI/ARDS中發揮抗炎和抗氧化作用的具體機制尚未完全了解，還需要更多的研究對這些機制進行詳細闡述。已有研究報道，Nrf2/HO-1信號通路被激活后，能夠抑制肺泡上皮細胞中炎性小體NLRP3的活化，進而抑制了其下游caspase1的激活，一方面中斷了炎性因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放，另一方面抑制了GSDMD的裂解，從而減少了細胞焦亡[29]。此外，最近研究發現鐵死亡也是ALI/ARDS病程進展的機制之一，而Nrf2/HO-1信號通路的激活可以明顯降低肺組織中的Fe2+濃度，提高GSH-Px和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的水平和活性，抑制脂質過氧化，從而減少了肺泡上皮細胞鐵死亡的發生。

除LPS之外，Nrf2/HO-1信號通路在其它直接因素誘發的ALI/ARDS中也可通過抑制炎癥反應和氧化應激來減輕肺損傷。如在葡聚糖凝膠誘導的大鼠肺損傷模型中，Nrf2/HO-1信號通路能夠抑制肺泡毛細血管內皮細胞表達黏附分子，包括ICAM-1和VCAM-1，以減少炎性細胞黏附、游走和浸潤，以減輕炎癥反應和肺水腫[31]。機械通氣(mechanical ventilation，MV)是危重患者發生呼吸衰竭常用的救治方法，但MV會在一定程度上加重肺損傷，即呼吸機誘發性肺損傷(ventilator induced lung injury，VILI)。Xu等[32]的研究發現，Nrf2/HO-1信號通路被激活后可減輕VILI中的炎癥反應，通過抑制NF-κB的核轉位，進而抑制其下游炎性因子的釋放，包括TNF-α、IL-1β 和IL-6等。肺缺血/再灌注損傷(lung ischemia/reperfusion injury，LIRI)多發生于肺栓塞、體外循環和肺移植術后，與患者的不良預后相關。研究表明，Nrf2/HO-1信號通路的激活可以有效抑制caspase-1/GSDMD通路引發的巨噬細胞焦亡[33]，同時還能夠提高SOD、GSH-PX 和過氧化氫酶等抗氧化酶的水平和活性，以消除反應性自由基，恢復氧化和抗氧化反應之間的平衡[33]。ALI/ARDS也是是海水淹溺最常見的并發癥，低溫、高滲的海水進入肺內后，破壞肺泡-毛細血管屏障，誘發氧化應激和炎癥反應，進而導致低氧血癥和肺水腫。有文獻報道，在海水淹溺性肺損傷小鼠模型中，使用富馬酸二甲酯激活Nrf2后，HO-1的表達隨之增加，進而清除了肺內過量生成的ROS，同時抑制了脂質過氧化，肺泡上皮細胞鐵死亡減少[34]。除發揮抗炎和抗氧化作用外，HO-1還可通過促進細胞再生，在肺損傷的修復期也發揮著重要作用[35]。

此外，在由其他間接因素導致的ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信號通路也發揮著重要的保護作用。Yu等[36]的研究發現在經盲腸結扎術誘發的膿毒癥肺損傷小鼠模型中，Nrf2被活化后進入細胞核，促進其下游HO-1的表達，HO-1蛋白水平的增加能夠抑制巨噬細胞釋放晚期促炎因子HMGB1，以減輕炎癥反應。還有研究報道，在急性胰腺炎誘發的ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信號通路被激活后也可通過抑制肺泡上皮細胞種炎性小體NLRP3的活化來減輕炎癥反應和肺組織損傷，而使用ML385抑制Nrf2的活性后發現，HO-1的表達減少，肺損傷隨之加重[37]。此外，腸缺血/再灌注損傷(intestinal ischemia/reperfusion，II/R)和腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury，CI/RI)常常會誘發遠端器官損傷，肺損傷最為常見。Dong等[38]研究發現，在Ⅱ/R誘發的急性肺損傷中，與野生型小鼠相比，Nrf2-/-小鼠肺內HO-1的mRNA和蛋白水平降低，膜脂過氧化增加，GSH水平降低，電鏡下觀察到Ⅱ型肺泡上皮細胞鐵死亡增多。由此可看出，在ⅡR誘發的肺損傷中，Nrf2/HO-1信號通路同樣可通過抑制鐵死亡發揮保護作用。在CI/RI誘發的ALI/ARDS中，Nrf2激活后誘導HO-1的基因轉錄，可減輕氧化應激損傷，促進氧化還原穩態恢復，從而減輕肺損傷[39]。

5 Nrf2/HO-1信號通路的激活策略

既往研究證明，在ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信號通路被激活后能夠發揮抗炎和抗氧化作用，從而減輕肺損傷和肺水腫，改善肺的氣體交換功能。目前，已有多項動物實驗證明Nrf2/HO-1信號通路是中草藥治療ALI/ARDS的有效靶點。Huang等[27]的研究發現荔枝草提取物salviplenoid A可促進Nrf2的表達和核轉位，進而激活Nrf2/HO-1信號通路。和厚樸酚、人參環氧炔醇和大黃素也可激活Nrf2/HO-1信號通路，但其發揮作用的具體機制尚未明確[29-30,37]。此外，促紅細胞生成素衍生物螺旋B表面肽、異補骨脂查爾酮和脂氧素受體激動劑BML-111等化合物在ALI/ARDS中也可促進Nrf2/HO-1信號通路的激活[28,31-32]。然而，這些治療方式目前還只用于實驗動物，其發揮作用的具體機制、使用方法以及安全性等問題，還需要大量的研究。

6 結語與展望

ALI/ARDS在危重患者中發病率和死亡率一直居高不下，臨床上仍缺乏有效的治療方法。ALI/ARDS的發病機制尚未完全了解，還需要更多的研究來進行全面的闡述。目前認為炎癥反應和氧化應激及其誘發的細胞焦亡和鐵死亡是ALI/ARDS的主要特征。Nrf2/HO-1信號通路通過清除過量的ROS、抑制細胞因子風暴、鐵死亡和細胞焦亡，在多種因素誘發的ALI/ARDS中發揮保護作用。因此，Nrf2/HO-1信號通路有望成為ALI/ARDS治療藥物研發的新靶點。目前，已有多種中草藥被證明可在ALI/ARDS發病過程中激活Nrf2/HO-1信號通路，但仍處于動物實驗階段，其能否用于臨床還有很多問題需要研究和討論。探究減輕炎癥反應和氧化應激損傷的方法以恢復肺的氣體交換功能仍是未來的研究方向。