達格列凈對人單核細胞系THP-1細胞增殖、凋亡，脂質水平的影響及相關機制研究

羅恩斯，董志會，陳冬萍，楊群峰，萬杰君

單核細胞在動脈粥樣硬化的發生發展中起關鍵作用。單核細胞中膽固醇流出的失衡最終導致轉化為載脂泡沫細胞，這些泡沫細胞積聚在動脈壁成為動脈粥樣硬化病變早期的標志[1-2]。過氧化物酶體增殖物激活受體c(peroxisome proliferator activated receptor c,PPARc)是一種核受體，在膽固醇穩態和動脈粥樣硬化形成的關鍵生物學過程中起關鍵作用[3]。一旦被激活，PPARc 會誘導一系列參與單核細胞中膽固醇流出的基因。肝X 受體α(liver X receptor α,LXRα)被確定為PPARc 的一種靶基因[4]。LXRα 最典型的作用之一是促進膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport,RCT)，即膽固醇從外周輸送到肝臟進行排泄[5]。RCT的第一步是單核細胞的膽固醇流出，單核細胞的膽固醇通過三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1(adenosine triphosphate binding cassette transporter A1,ABCA1)和其他轉運蛋白轉移到載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,apoAI)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)[6]。ABCA1是最早發現的LXRα 靶基因之一，可促進單核細胞膽固醇外流并維持細胞甾醇穩態。ABCA1的突變消除了膽固醇流出并增加了發生動脈粥樣硬化的風險[7]。miRNA 是小的(約19～22 nt)非編碼RNA，主要通過與靶mRNA 的3’端非翻譯的區域(3′-Untranslated Region,3’-UTR)結合來調節基因表達，從而導致mRNA降解或翻譯抑制。miRNA在多種正常和疾病相關生物過程的細胞過程中發揮重要作用，包括代謝穩態、腫瘤發生和心臟發生。最近，越來越多的證據表明miRNA 參與膽固醇代謝。使用生物信息學分析，預測幾種miRNA 可能靶向人LXRα 和ABCA1mRNA 的3’-UTR，并且miR-613具有較高的調節LXRα和ABCA1的概率[8]。先前的報道表明，miR-613 與甲狀腺乳頭狀癌、胃癌、乳腺癌和脂肪生成有關。然而，尚不清楚miR-613 是否通過靶向人髓系白血病單核細胞(human myeloid leukemia mononuclear cells,THP-1)中 的LXRα 和ABCA1 參與調節膽固醇流出。達格列凈是一種選擇性鈉依賴性葡萄糖轉運蛋白2 抑制劑(sodium dependent glucose transporter 2 inhibitor,SGLT2i)，作用于臟近端腎小管，抑制其對原尿中的葡萄糖重新吸收，降低腎糖閾值從而增加尿葡萄糖排出[9]。此外，動物實驗表明達格列凈導致單核細胞向糞便的逆向膽固醇轉運增加，從而減輕動脈內膜中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)滯留[9]。同時，一些臨床試驗也表明[10]，達格列凈可以通過改善內皮功能或降低一些血脂相關指標來降低動脈粥樣硬化風險。本研究擬探討達格列凈對人單核細胞系THP-1 細胞活性的影響及作用機制，為其抗動脈粥樣硬化作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 達格列凈(阿法埃莎化學有限公司)，Dulbecco 改良的Eagle 培養基(dulbecco modified eagle medium,DMEM,中國碧云天科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,中國大閩生物科技公司)；細胞計數試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)(美國MerckKGaA 生物科技有限公司)；結晶紫染色液(上海景天生物科技有限公司)；膜聯蛋白V-PE 凋亡檢測試劑盒(美國Millipore)；總膽固醇(total cholesterol,TC)、游離膽固醇(free cholesterol,FC)、膽固醇酯(cholesterol esters,CE)試劑盒(美國貝克曼)；核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)(Sigma,USA)；TRIzol 試劑；逆轉錄試劑盒；SYBR Green I Supermix(Takara)；放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解緩沖液(美國Sigma-Aldrich)；雙金錢子酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白質測定試劑盒；鈉鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠硝酸纖維素膜；小鼠單克隆抗人LXRα 一抗(1:1000;Santa Cruz Biotechnology)、小鼠單克隆抗人ABCA1 一抗(1:500;Santa Cruz Biotechnology)；小鼠單克隆抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗(1:5000;Santa Cruz Biotechnology)，horseradish peroxidase(HRP)綴合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(immunoglobulin,IgG)(1:5000;Santa Cruz Biotechnology)；高效化學發光(efficient chemiluminescence,ECL)試劑盒。iCycler IQ PCR 多色檢測系統、Quantity One軟件(Bio-Rad,USA) ；Cell-QuestTM Pro軟件(BD Biosciences,USA)。

1.2 細胞培養及分組 細胞培養：THP-1 細胞采用PRMI-1640(10%血清)在37℃，5% CO2 細胞培養箱中培養，100 ng/mL 佛波酯(phorbol ester,PMA)及100 mM 氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)誘導24 h后分別加入不同濃度達格列凈(37.5 μg/L、75 μg/L、150 μg/L；前期的預實驗求出達格列凈對前述THP-1 細胞的LD50 為300 μg/L，本實驗分別以1/2、1/4、1/8 LD50 作為高中低劑量)，繼續培養72 h后收集細胞。分組設計：A組：THP1+PMA+ox-LDL、B 組：THP1+PMA +ox-LDL +37.5μg/L 達格列凈、C 組：THP1+PMA +ox-LDL +75μg/L 達格列凈、D 組：THP1+PMA +ox-LDL +150μg/L達格列凈。每組設計6個復孔。

1.3 細胞增殖測定 細胞培養結束后，將人單核細胞系THP-1 細胞以4×103個細胞/孔的密度接種到96 孔板中，培養24 h。每孔加入共10 μL CCK-8 溶液，置于37 ℃下孵育4 h。使用酶標儀在450 nm 處測量光密度(optical density,OD)值。通過吸光度值計算各組細胞存活率。

1.4 細胞單克隆形成數目水平測定 將細胞以800個細胞/孔接種到6 孔板中14 d，每3 d 用含有10%FBS 的培養基更新培養基，觀察菌落形成，計數超過40 個細胞的集落，觀察四個視野，獲取平均值，應用結晶紫染色并拍攝代表性照片。

1.5 TC、FC、CE 水平測定 貝克曼AU-480 全自動生化儀測定各組細胞液中TC、FC、CE水平。

1.6 細胞凋亡水平測定 使用膜聯蛋白V-PE 凋亡檢測試劑盒檢查凋亡細胞。收集細胞，用5 μL 膜聯蛋白V-PE 和5 μL PI 染色。流式細胞儀檢測細胞凋亡，使用Cell-QuestTM Pro 軟件分析結果。收獲預處理的細胞，在4 ℃下在冰冷的70%乙醇中固定過夜，然后重懸于含有1 mg/mL RNase 和50 μg/mL PI(Sigma)的1 mL PBS 中在暗箱中室溫放置30 min。通過Cell-QuestTM Pro 軟件計算細胞周期不同階段的細胞百分比。

1.7 細胞miR-613、LXRα、ABCA1mRNA 水平測定 使用TRIzol試劑提取總RNA。使用RT-PCR系統及逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。根據制造商的方案，使用SYBR Green I Supermix 在20 μL 最終反應體積中進行RT-PCR。所有反應均在iCycler IQ 多色檢測系統上進行三次，miR-613、LXRα、ABCA1引物由GenePharma(中國上海)設計，序列如下：miR-613，反 向 5'-TCGCGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTGCTAC-3'，正向5'-TGGGGCTAGTCAGCTAGTCGACTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTACTGCT-3'；LXRα，正向5'-GTGGCTAGTCGTCGTCGATGCTGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCC-3'，反 向5'-GTGGTCGTAGCTAGTCGACTAGTCGATGCTAGCTAGCTAGTCGTAGCTAGCTGC-3'；ABCA1，正 向 5'-TGGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTGACTAGTCC -3'，反 向5'-GTGGGTCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGTCAGTCGATGCTAGCGGT-3'；U6，正 向5'-TGGGCTGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGTC-3'，反 向5'-GTGGGTCGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTGCTAGTCGATGC -TAGCTGCTCA-3'。循環參數如下：95 ℃10 s，然后40 個94 ℃15 s 循環，再55 ℃30 s，最后在70 ℃延伸30 s。所有定量均標準化為反應中人U6 的水平。比較閾值循環(CT)(2-DDCt)方法比較常見參考RNA 和靶基因RNA 之間的CT 值差異，用于獲得基因表達的相對倍數變化。

1.8 細胞LXRα、ABCA1 蛋白水平測定 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液從人單核細胞系THP-1 細胞中提取蛋白質。使用BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。使用10% SDS-PAGE 凝膠分離等量的蛋白質裂解物(每個泳道20 μg)，然后將印跡電解到硝酸纖維素膜上。用含有0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽水中的5%脫脂奶粉封閉膜2 h，并在4 ℃下與以下一抗孵育過夜：小鼠單克隆抗人LXRα、小鼠單克隆抗人ABCA1，小鼠單克隆抗人GAPDH 用作蛋白質加載的內部對照。24 h后將膜進一步與HRP 綴合的山羊抗小鼠IgG 在室溫下孵育1 h，通過ECL試劑盒檢測免疫復合物，條帶的綜合密度通過Quantity One軟件進行量化。

1.9 統計學處理 采用IBM SPSS 24.0 軟件統計分析，定量數據以均數±標準差()表示，多組數據差異使用單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組單核細胞系THP-1 細胞OD 值、存活率的比較 與THP-1細胞組(A組)比較，達格列凈給藥組(B、C、D 組)OD 值、存活率顯著降低(P＜0.05)；且隨著達格列凈劑量的增加，達格列凈低(B 組)、中(C 組)、高劑量組(D 組)OD 值、存活率逐漸降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組單核細胞系THP-1細胞OD值、存活率比較()

表1 各組單核細胞系THP-1細胞OD值、存活率比較()

與THP-1細胞組比較，aP＜0.05；與達格列凈低劑量組比較，bP＜0.05；與達格列凈中劑量組相比，cP＜0.05。

2.2 各組單核細胞系THP-1 細胞單克隆形成數目的比較 與THP-1 細胞組(A 組)比較，達格列凈低、中、高劑量組(B、C、D 組)單克隆形成數目降低(P＜0.05)；且隨著達格列凈劑量的增加，達格列凈低(B組)、中(C 組)、高劑量組(D 組)單克隆形成數目逐漸降低(P＜0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組單核細胞系THP-1 細胞單克隆形成數目比較(甲基紫染色，×200倍)

表2 各組單核細胞系THP-1細胞單克隆形成數目的比較()

表2 各組單核細胞系THP-1細胞單克隆形成數目的比較()

2.3 各組單核細胞系THP-1細胞凋亡率的比較 與THP-1 細胞組(A 組)比較，達格列凈低、中、高劑量組(B、C、D組)凋亡率升高(P＜0.05)；且隨著達格列凈劑量的增加，達格列凈低(B 組)、中(C 組)、高劑量組(D組)凋亡率逐漸升高(P＜0.05)。見表3。

表3 各組單核細胞系THP-1細胞凋亡率的比較()

表3 各組單核細胞系THP-1細胞凋亡率的比較()

圖2 各組單核細胞系THP-1細胞凋亡率比較

2.4 各組單核細胞系THP-1 細胞TC、FC、CE 水平比較 與THP-1細胞組(A組)比較，達格列凈低、中、高劑量組(B、C、D 組)TC、FC、CE 水平降低(P＜0.05)；且隨著達格列凈劑量的增加，達格列凈低(B 組)、中(C 組)、高劑量組(D 組)TC、FC、CE 水平逐漸降低(P＜0.05)。見表4。

表4 各組單核細胞系THP-1細胞TC、FC、CE水平比較()

表4 各組單核細胞系THP-1細胞TC、FC、CE水平比較()

注：與THP-1細胞組比較，aP＜0.05；與達格列凈低劑量組比較，bP＜0.05；與達格列凈中劑量組比較，cP＜0.05。

2.5 各組單核細胞系THP-1 細胞miR-613、LXRα、ABCA1 mRNA 轉錄水平比較 與THP-1 細胞組(A組)比較，達格列凈低、中、高劑量組(B、C、D 組)miR-613 表達水平升高(P＜0.05)，LXRα、ABCA1 mRNA表達水平降低(P＜0.05)；且隨著達格列凈劑量的增加，達格列凈低、中、高劑量組miR-613 表達水平逐漸升高(P＜0.05)，LXRα、ABCA1 mRNA 表達水平逐漸降低(P＜0.05)。見表5。

表5 各組單核細胞系THP-1細胞miR-613、LXRα、ABCA1 mRNA表達水平比較()

表5 各組單核細胞系THP-1細胞miR-613、LXRα、ABCA1 mRNA表達水平比較()

注：與THP-1細胞組相比，aP＜0.05；與達格列凈低劑量組相比，bP＜0.05；與達格列凈中劑量組相比，cP＜0.05。

2.6 各組單核細胞系THP-1細胞LXRα、ABCA1蛋白表達水平比較 與THP-1 細胞組(A 組)比較，達格列凈低、中、高劑量組(B、C、D 組)LXRα、ABCA1 蛋白表達水平降低(P＜0.05)；且隨著達格列凈劑量的增加，達格列凈低(B 組)、中(C 組)、高劑量組(D 組)LXRα、ABCA1 蛋白表達水平逐漸降低(P＜0.05)。見表6、圖3。

表6 各組單核細胞系THP-1細胞LXRα、ABCA1蛋白表達水平比較()

表6 各組單核細胞系THP-1細胞LXRα、ABCA1蛋白表達水平比較()

與THP-1細胞組相比，aP＜0.05；與達格列凈低劑量組相比，bP＜0.05；與達格列凈中劑量組相比，cP＜0.05。

圖3 各組單核細胞系THP-1 細胞LXRα、ABCA1 蛋白表達水平電泳圖

3 討論

單核細胞內皮下聚集和轉化為泡沫細胞是動脈粥樣硬化病變起始的關鍵事件。膽固醇及脂質流入和流出之間的不平衡是單核細胞泡沫細胞形成的原因。核酸內切酶VIII 樣3 缺乏導致單核細胞膽固醇流出能力降低與加速動脈粥樣硬化斑塊形成有關。在載脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)缺陷(apoE-/-)小鼠模型中，單核細胞中膽固醇流出的藥理學誘導可以防止動脈粥樣硬化病變的發展[11]。因此，了解單核細胞膽固醇流出的機制對于開發有效的動脈粥樣硬化治療方法具有重要意義。

達格列凈為鈉依賴性葡萄糖轉運蛋白2 抑制劑，選擇性抑制鈉依賴性葡萄糖轉運蛋白2，使腎臟對尿糖的重新吸收減少，增加腎臟排出葡萄糖，發揮降糖作用。近年，國內外多個研究表明達格列凈存在心臟腎臟的保護作用。有研究表明，達格列凈可以降低糖尿病小鼠肝細胞中的炎癥因子、FC、CE 水平，升高高密度脂蛋白膽固醇水平。既往有研究發現接受達格列凈治療的2 型糖尿病患者巨噬細胞的膽固醇流出能力較基線時有顯著提高[12]。最近達格列凈已被證明可有效改善內皮功能，減少氧化和促炎狀態，并對心血管功能產生有益影響[13]。達格列凈還可以通過改善胰島素抵抗代謝紊亂來有效改善血脂和肝功能。重要的是，達格列凈在各種疾病中表現出重要的抗炎能力。例如，達格列凈通過抑制NOD 樣受體家族3(NOD like receptor 3,NLRP3)炎性體形成和促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6 和IL-18 的產生來預防糖尿病腎病的發病機制[14]；達格列凈的給藥通過誘導表達白細胞和CD8+淋巴細胞的獨特變化來減輕血管緊張素II誘導的心臟舒張功能障礙、纖維化和炎癥。在實驗性心肌梗死動物模型中，達格列凈可顯著降低術后死亡率并恢復心臟功能。這些證據表明達格列凈可能對心血管有益[15]，我們通過將達格列凈應用于培養的人單核細胞系THP-1 細胞來探索其生物學效應。本研究結果顯示：與THP-1細胞組比較，達格列凈低、中、高劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數目、TC,FC,CE 水平降低，凋亡率升高，且具有劑量-效應關系(P＜0.05)。這表明，達格列凈能抑制人單核細胞系THP-1 細胞增殖，促進人單核細胞系THP-1細胞凋亡，降低人單核細胞系THP-1細胞脂質水平。

microRNAs(miRs)是一個小型非編碼RNAs 大家族，可通過與mRNAs 的3′-非翻譯區(3′-UTR)的部分互補結合來抑制多個靶基因的表達。表達譜研究表明，與正常動脈比較，許多miR 在動脈粥樣硬化斑塊中異常表達，這表明它們與動脈粥樣硬化的進展有關[16]。越來越多的miR 被發現參與泡沫細胞的形成和動脈粥樣硬化。例如，miR-328-5p顯示出加速膽固醇從載脂單核細胞流出的能力[17]。最近一項研究表明，在脂多糖刺激后miR-613 在單核細胞中上調，并且可以抑制脂多糖誘導的炎癥反應，同時miR-613 抑制肽聚糖刺激的單核細胞中促炎細胞因子的產生，表明miR-613 在單核細胞中具有抗炎抗脂活性[18]。LXRs 是孤核受體超家族的成員。兩種同種型已經被表征，即LXRα 和LXRβ，前者的表達更局限在肝臟、腎臟、脾臟、脂肪組織、肺、腸、骨骼肌和巨噬細胞中，而后者被普遍表達。LXRα 被認為是關鍵的轉錄調節因子，參與細胞甾醇穩態的調節。ABCA1 是ATP 結合盒(ABC)家族之一，是PPARc-LXRα 信號通路的靶標[19]。ABCA1和ABCG1 在HDL 介導和載脂蛋白AI 介導的膽固醇流出中起主要作用。過往報道表明[20-21]，PPARc通過在LXRα 的啟動子區域內結合PPRE 直接上調LXRα 的表達，而LXRα 直接上調ABCA1 的表達。在本項研究中，我們發現，與THP-1細胞組比較，達格列凈低劑量組、達格列凈低、中、高劑量組miR-613 表達水平升高，LXRα、ABCA1 表達水平降低(P＜0.05)，這說明，達格列凈低通過上調miR-613 間接降低LXRα 和ABCA1 的表達進而抑制LXRα/ABCA1通路的激活。

綜上所述，達格列凈能抑制人單核細胞系THP-1 細胞增殖，促進人單核細胞系THP-1 細胞凋亡，降低人單核細胞系THP-1 細胞脂質水平；其機制可能與達格列凈低通過上調miR-613 間接降低LXRα 和ABCA1 的表達進而抑制LXRα/ABCA1 通路的激活有關。本研究未能直接證明miR-613 對LXRα、ABCA1 的靶向調節作用，這將在后續研究中通過螢光素酶報告基因實驗來直接證明miR-613與LXRα、ABCA1的靶向調節關系。