β-谷甾醇靶向調控PI3K3CG基因保護心肌肥厚作用研究

李鵬宇，陳夢真，冉嘉欣，劉思宇，孫輝

心力衰竭（heart failure,HF）是一種嚴重威脅人類健康的心臟疾病，且發病率正逐年上升[1]。心肌肥厚是心力衰竭的重要病理生理過程之一[2]。心臟及心肌細胞增大導致心室壁張力降低，為保持心臟效率和輸出量致使心肌工作量增加或心臟損傷，引起器官結構的破壞并導致心力衰竭[3]。因此，新的心肌肥厚的治療藥物和潛在治療靶點將為心血管疾病的預防和治療提供新方法。

中藥網絡藥理學（Pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine system,TCMS）是將生物信息學、計算生物學及靶向藥理學的方法整合成一種新的研究思路，其研究思路具有全局性和系統性的特點[4]。通心絡是由7 種不同君藥及5 種不同的臣藥制成的一種復方中藥[5]，廣泛應用于心血管疾病的治療，可以穩定動脈粥樣硬化斑塊、降低血脂水平、改善內皮功能、促進血管擴張、抑制炎癥和凋亡，并促進血管生成[6]。然而，通心絡對于心肌肥厚的作用尚不清楚，尤其是通心絡中何種關鍵因子起到保護作用尚不明確。

β-谷甾醇（β-sitosterol）是青蒿屬植物的有效成分，已被用于預防三硝基苯磺酸誘導的小鼠結腸炎[7]。β-谷甾醇具有良好的抗氧化劑或營養添加劑[8]。一項研究報道了β-谷甾醇通過抗氧化及降低血糖逆轉由鏈脲佐菌素誘導的糖尿病發生[9]。因此，本研究基于網絡藥理學研究方法分析通心絡各成分靶點及藥物機理，探討β-谷甾醇在心肌肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1 通心絡的化學組成 本研究采用計算系統生物學實驗室的中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索通心絡中人參、赤芍、檀香、降香、乳香、酸棗仁以及冰片7 味藥的成分。

1.2 篩選閾值

1.2.1 候選化合物篩選 將中藥人參、赤芍、檀香、降香、乳香、酸棗仁、冰片的化合物口服生物利用度(OB)篩選閾值設為OB≥30%，7味中藥的類藥性(DL)閾值設為DL≥0.2及腸上皮通透性(Caco-2)閾值設為Caco-2＞-0.4，最終篩選出95個候選化合物。

1.2.2 構建化合物-靶點網絡 采用TCMSP 數據庫獲得通心絡小分子化合物對應的靶點名稱，應用Uniprot 數據庫將靶點基因全稱轉化為gene ID 號，從而通過Cytoscape 3.7.2軟件構建出通心絡的高活性化合物-靶點網絡，進行通心絡藥理學作用機制深入探究。并通過Cytoscape 3.7.2軟件構建出人參這味中藥的高活性化合物-靶點網絡。

1.2.3 基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將獲得的數據中的β-sitosterol 活性分子采用GO 功能和KEGG通路對靶基因進行富集分析，以此闡明中藥化合物的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用。

1.3 材料 異丙腎上腺素（Isoproterenol，ISO，鶴峰藥廠，上海，中國）。β-谷甾醇（阿拉丁，上海，中國）。ANP、BNP、PI3K3CG 和β-MHC 相應引物（生工生物工程技術服務有限公司，上海，中國）。

1.4 心肌細胞培養與處置 H9C2 心肌細胞（中國細胞庫，上海，中國），在含有10%胎牛血清（賽默飛世爾，美國）的DMEM（?？寺?，美國），其中含有100單位/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素。置于37 ℃，含有5%CO2的濕空氣恒溫孵箱中培養備用。待細胞對數期生長至60%～70%后，將10 μM ISO 加入心肌細胞中，誘導其成為心肌肥厚模型。同時，將不同濃度的β-谷甾醇加入到ISO 誘導的心肌細胞中，（正常組，ISO 組，ISO+β-谷甾醇（0.01～1.0 mM）以及單獨β-谷甾醇組）24h。

1.5 心肌肥厚模型的建立 使用健康的Sprague-Dawley 的雄性大鼠（180～200 g）。動物的住房條件（溫度21+2℃，濕度55%～75%），12 h 暗/光循環，無食物和水的限制。所有實驗程序均由哈爾濱醫科大學倫理委員會證明（倫理號：IRB3015722）。經過5 d 的靜態處理，經頭頸部皮下注射ISO（每天2.5 mg/kg）或者β-谷甾醇（每天0.5 mg/kg）用于14 d。對照組注射等量的生理鹽水。

1.6 心肌細胞表面積的測定 不同組細胞采用4%多聚甲醛固定15 min，然后將H9C2 細胞通過0.4%TritonX-100 固定90 min，山羊血清室溫封閉90 min。接下來，心肌細胞結構染色，然后采用熒光顯微鏡（Nikon80i，日本）進行拍照。通過Image J 數據軟件對于心肌細胞面積進行測定。

1.7 熒光定量PCR 用TRIZOL 提取心肌細胞以及心肌組織中的總RNA。通過ABI7500 快速實時定量PCR 系統（Applied Biosystems，美國）檢測心肌細胞以及心肌組織中的心鈉素（Atrial Natriuretic Peptide,ANP），B 型利鈉肽（B-type natriuretic peptide,BNP）以及β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）的表達，ANP，BNP 以及β-MHC 的序列如下：

1.8 H&E 染色 將大鼠的心臟采用0.9%的生理鹽水沖洗干凈后，固定在10%福爾馬林，待固定完成后，將心臟組織切片至7 μm，蘇木精染色及曙紅（H&E）。心肌細胞的橫斷面，在400 倍放大率下檢測心肌細胞肥大面積。細胞橫切面面積測定通過magePro-Plus4.0系統。

1.9 超聲心動評價心功能 心臟功能評估是使用Vevo2100 圖像采集系統（Visualsonics，多倫多，加拿大）配備30 mHz 微掃描傳感器。在胸骨旁長軸和短軸上均記錄了M 型追蹤。測量QT間期和R間期，以及心率校正用Bazett 公式：QTc/QT/（RR）1/2，接受方法修正qt間期。

1.10 統計學處理 所有實驗數據使用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料使用均數±標準差（）表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選活性化合物 藥物的口服生物利用度（OB）是藥理學中最重要的藥代動力學參數之一，它反映所給藥物進入人體循環的藥量比例，高OB值一般是決定生物活性分子類藥性（DL）的關鍵指標。Caco-2細胞模型是一種人克隆結腸腺癌細胞，結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結構，并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系?？梢杂脕硌芯克幬镂盏臐摿?，藥物運轉的機制，以及研究藥物、營養物質、植物性成分的腸道代謝，目前也是一種常用的評價藥物滲透性的指標。本研究從TCMSP網站下載了這些化合物的OB、DL和Caco-2指標來共同篩選其中潛在的高活性化合物。為了使篩選的化合物具有代表性，同時要從整體上反映通心絡的藥理學特性，7 味中藥的OB、DL 和Caco-2 閾值設為OB≥30%，DL≥0.2，Caco-2＞-0.4。將通心絡的7味中藥中的化合物通過篩選，得到95個活性成分作為候選化合物。其中有21 個化合物來自人參，20個來自赤芍，2個來自檀香，37個來自降香，8個來自乳香，8個來自酸棗仁，3個來自冰片（表1）。而，β-谷甾醇作為主要成分在人參，赤芍以及降香中均有出現，且出現頻率最高。

表1 通心絡人參活性成分

2.2 化合物-靶點相互作用網絡 采用Cytoscape 3.7.2軟件構建的化合物-靶點網絡共包含248個節點（68個化合物節點，180個靶基因節點）和1034條邊，連接化合物與靶點對應的基因表示他們之間有作用關系（圖1）。由于在TCMSP 數據庫中并沒有找到冰片中的活性成分對應的靶點，因為圖1 中包含了通心絡7種成分的化合物-靶點網絡。

圖1 通心絡有效成分-靶點網絡不同形狀圖形代表了不同成分來源

隨后，對于通心絡的君藥“人參”的活性成分，利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建的化合物-靶點網絡，共包含125個節點（16個化合物節點，109個靶基因節點）。通過查閱文獻發現這些活性成分中，β-谷甾醇可能是潛在的抗心肌肥厚活性成分。故，在后續的研究中，主要以β-谷甾醇為主要研究對象。

2.3 GO 富集與通路富集分析 將通心絡中名為β-谷甾醇的活性成分所對應的靶基因映射到DAVID數據庫中，進行GO 生物學功能分析和KEGG 富集分析，以FDR 校正值作閾值進行篩選，共獲得43 個GO 條目和28 條KEGG 通路。在富集GO 條目中，與分子功能有關的條目6 個，涉及神經遞質受體的活動、跨膜受體的活動、跨膜信號受體活性、被動跨膜轉運蛋白活性、底物特異性跨膜轉運蛋白活性；與生物過程有關的條目27 個，涉及循環系統過程、細胞對化學刺激的反應、對有機物的反應、信號轉導、藥物反應、對含氧化合物的反應等方面；與細胞組成有關的條目10 個，包含原生質膜的組成、質膜的固有成分、等離子體膜、細胞邊緣、神經元、突觸后膜等方面。富集的KEGG 通路包括神經活性配體-受體相互作用信號通路、鈣離子信號通路、膽堿能突觸信號通路、含血清素的信號通路以及cAMP信號通路等。

2.4 β-谷甾醇減弱ISO 誘導 H9C2 細胞表面積增加 采用ISO（10 μM，48 h）誘導H9C2 細胞構建體外的心肌肥厚模型，通過肌動蛋白α 染色法檢測心肌細胞肥大。如圖2A 所示，ISO（10 μM，48 h）明顯誘導心肌細胞表面積增加。β-谷甾醇0.01、0.05、0.1 和1.0 mM 作用24 h 能夠明顯抑制ISO 誘導的心肌細胞面積的增加。

圖2 β-谷甾醇對H9C2細胞表面積的影響

通過qRT-PCR 檢測心肌肥厚相關蛋白ANP（圖3A），BNP（圖3B）以及β-MHC（圖3C）的mRNA表達，結果表明，β-谷甾醇能夠逆轉由ISO 誘導的ANP，BNP以及β-MHC的表達上調。

圖3 β-谷甾醇對ISO誘導的H9C2細胞中肥大標志物的影響與對照組比較，*P＜0.05，正常組與ISO組比較，#P＜0.05，β-谷甾醇與ISO組相比。

2.5 β-谷甾醇抑制ISO 誘導的心肌肥大后大鼠心臟重構 通過在體實驗驗證β-谷甾醇對于心肌組織的影響。結果如圖4A 所示，與對照組比較，ISO組心臟/體重比明顯升高，而β-谷甾醇能夠降低由ISO 誘導的心臟/體重比升高及降低由ISO 誘導的左心房/體重比（圖4B）。H&E 染色結果表明β-谷甾醇能夠降低由ISO 誘導的心肌細胞面顯增大（圖4C）。超聲心動圖評價大鼠心功能不同的治療方法，如表1 所示，心動超聲結果顯示了LVAWd 和LVPWd與對照組比較，ISO 組大鼠心臟舒張功能明顯降低（P＜0.05）。通過qRT-PCR 檢測心肌細胞肥大標志物ANP（圖5A），BNP（圖5B）及β-MHC（圖5C）的mRNA 表達，結果顯示ISO 組能夠明顯增加心肌組織中ANP，BNP 以及β-MHC 的表達，而β-谷甾醇能夠逆轉由ISO誘導的ANP,BNP及β-MHC的表達上調。2.6 β-谷甾醇通過調控PI3K3CG 逆轉ISO 誘導的心肌細胞肥大 通過Western blot 以及qRT-PCR 方法檢測心肌組織以及H9C2 細胞中PI3K3CG 的表達，結果顯示ISO 能夠使H9C2 以及心肌組織中PI3K3CG 表達升高，而β-谷甾醇能夠降低由ISO 誘導的PI3K3CG表達上調（圖6 A-B）。

圖4 β-谷甾醇對心肌肥厚模型大鼠的HW/BW（A）和LVW/BW（B）的作用，每組3-6只大鼠。（C）H&E 染色（400倍放大鏡）以及不同組的橫截面積數據，n=4-5只大鼠。與對照組比較，*P＜0.05，正常組與ISO 組比較，#P＜0.05，β-谷甾醇與ISO 組相比，ISO（2.5 mg.kg-1.d-1，持續10 d）；β-谷甾醇（1.5 mg.kg-1.d-1，持續10 d）。

圖5 β-谷甾醇對ISO誘導的大鼠心肌肥厚模型中肥大標志物的影響

表2 大鼠心功能參數

圖6 β-谷甾醇逆轉由ISO誘導的心肌組織以及H9C2細胞中PI3K3CG表達

3 討論與結論

通心絡，是一種具有益氣活血，通絡止痛功效的中成藥，臨床中用于氣虛血瘀絡阻型中風病以及心腦血管疾病的治療。本研究基于網絡藥理學方法，首先構建了通心絡主要成分的化合物-靶點網絡（圖1）。在篩選的過程中，我們發現β-谷甾醇可能是通心絡中主要作用藥物。有文獻證明，β-谷甾醇可調控N-二乙基亞硝胺的表達亞硝酸鐵誘導的大鼠急性腎毒性有促進作用[11-12]。β-谷甾醇還可通過誘導線粒體谷胱甘肽氧化還原循環過程，逆轉由四氯化碳誘導肝毒性[13-14]。為了進一步探究β-谷甾醇作用的關鍵靶點，通過基因功能以及信號通路富集后，結果表明這些靶點的分子功能主要體現在跨膜受體活性，調控轉運等。而對KEGG 通路富集分析的結果說明，除了一些癌癥相關通路之外，這些靶點也富集到了鈣信號通路。而鈣離子通路在多種心臟相關的疾病中起著重要的作用，如細胞內鈣離子信號通路是阿托伐他汀減輕心肌肥厚的重要通路之一[15]。鈣離子信號通路參與FGF23 對于血管緊張素II 介導的心肌肥厚[16]?；谝陨系慕Y果證明我們前期對于下游通路的篩選是可靠的。同時，進一步對β-谷甾醇的下游的作用靶點進行深入挖掘，發現一些關鍵靶點，如PI3K3CG。以往的報道表明，PI3K3CG作為一個抑制因子參與了心臟GSK-3的表達[17]。PI3K3CG促進心肌梗死后的梗死面積增加并預防心肌梗死后的不良重塑[18]。結合以上結果，PI3K3CG 可能是β-谷甾醇保護心肌肥厚的重要作用靶點。隨后，通過體內、體外實驗證明β-谷甾醇能夠抑制ISO 誘導的心肌肥厚的發生，使ANP，BNP 以及β-MHC 的表達降低，且通過調控PI3K3CG基因實現的。

綜上，我們的結果基于網絡藥理學分析通心絡的主要抗心肌肥厚活性成分，隨后分子生物方法證實β-谷甾醇是主要的有效成分，且能夠干預心肌肥厚的病理、生理過程，阻斷其惡性進展，能夠給通心絡以及β-谷甾醇提供更好的應用價值以及理論基礎。