過量硒-L-蛋氨酸對青鳉魚胚胎的毒性作用及與氧化應激機制的關聯

周旖妮，王歡，楊景峰，于永利,2,#，董武,*

1. 內蒙古自治區毒物監控及毒理學重點實驗室，內蒙古民族大學動物科技學院，通遼028000 2. 內蒙古民族大學生命科學與食品學院，通遼 028000

硒(selenium, Se)是人和動物正常生長和發育所需的一種天然微量元素。但當其濃度較高時，會產生毒性作用[1-2]。硒經由農業灌溉排水、采礦作業和燃煤殘留物進入淡水環境[3]。令人擔憂的是，富硒煤灰排放到附近水域，導致硒積累的增加，并對居民和各種動物產生負面影響。美國北卡羅來納州貝勒斯湖和薩頓湖受到含硒煤灰的污染，也造成湖內魚類組織中的硒含量超標，硒含量遠超毒性閾值[4-5]。

硒代蛋氨酸(seleno-L-methionine,SeMet)是水生食物鏈中有機硒的主要形式，有機硒對胚胎發育作用明顯[6-7]。當親代(F0)飲食中的SeMet在體內積累到一定程度時會影響魚卵的發育，甚至導致畸形[8-9]。許多魚類的早期生命階段對環境污染物非常敏感[10]。魚類對硒的敏感性可能與其硒蛋白含量高有關[11]。在鹽度水平較高的環境下，青鳉魚(Oryziaslatipes)對SeMet毒性尤為敏感，可導致死亡率、孵化率和畸形率增加[12-13]。

有關硒毒性機制，有2種假說：(1)蛋白質組裝過程中硫被取代導致分子結構和功能改變；(2)氧化應激導致蛋白質、脂質和DNA損傷[6,14]。后者最受關注。氧化應激是有機體對外來或者內部代謝化學物質的應激反應。很多化學物質導致氧自由基和脂質過氧化物的過量產生，進而有機體會應激產生過量的抗氧化劑或自由基清除酶，對細胞造成損害[15-16]。有機硒是否影響超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)等抗氧化酶，并增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的產生，從而對多個器官造成氧化損傷還有待研究。ROS過量產生，或抗氧化劑減少，導致生物大分子受損，危及細胞的健康[17]。ROS激活涉及轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)，它與抗氧化反應元件(antioxidant response element, AREs)結合，并調節對氧化劑和親電試劑的適應性反應[18]。宿主代謝將SeMet轉化為能夠氧化谷胱甘肽(glutathione,GSH)的硫醇等化合物以產生超氧化物，進而導致氧化應激[19-20]。而谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPx4)是谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)蛋白質家族的成員，通過還原GSH催化過氧化氫和脂質過氧化物的還原，從而保護細胞免受氧化損傷[21]。Arnold等[22]報道斑馬魚(Daniorerio)胚胎暴露于SeMet造成氧化應激以及GSH關聯基因表達的增加。

青鳉魚作為發育生物學模式生物有著悠久的歷史[23]。研究表明青鳉魚更有利于生命早期發育階段的胚胎毒性研究[24-25]。相比于斑馬魚的發育，青鳉魚有相對較長的發育時期，且早期胚胎透明，可以通過透明絨毛膜看到胚胎的發育狀態[26-27]。此外，有大量的分子工具可用于研究毒性機制，包括與氧化應激相關的基因[28-29]。

本研究的目的是確定SeMet水溶液對青鳉胚胎生存和發育的影響，特別是SeMet造成的形態學變化。為了確定SeMet的毒性作用機制，探討了SeMet的氧化應激機制和特定基因表達的變化。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 青鳉魚和暴露方法

青鳉魚在循環水系統中繁育和維護。溫度維持在24 ℃，在pH 7.2的循環水條件下飼喂，并以14 h∶10 h的光∶暗循環進行光線調節。每天2次喂食飼料(Otohimeβ1 diet, Pentair Aquatic Eco-Systems, USA)，并補充豐年蝦(90% Great Lakes Strain, Pentair Aquatic Eco-Systems, USA)。在早晨喂食約1 h后收集受精卵。通過在濕潤紙巾上輕輕滾動來清潔和分離受精卵，當胚胎發育至6～7 hpf(hours post-fertilization)，青鳉卵被轉移到6孔組織培養板(VWR, Corning)實施暴露，暴露至10 dpf (day post fertilization)，期間每24 h更換一次暴露液，每個孔10個受精卵(3～10個重復)。每孔含有5 mL 0.1%(m/V)鹽水、0.1%(V/V)二甲基亞砜(DMSO, Sigma-Aldrich, USA)或者SeMet(Sigma Aldrich, USA)的水溶液(0、0.1、1、10、100、500和1 000 μmol·L-1)。

1.2 胚胎觀察和影像學

根據Iwamatsu[26]和Kinoshita等[27]的研究方法，使用尼康SMZ1500立體顯微鏡進行檢查(Nikon Instruments, Inc., USA)，每天檢測直至10 dpf，記錄各種表型的改變[30-31,9]。通過檢測確定存活率和孵化率，并且根據改良寇式計算法計算LC50[32]。表型改變包括：心包水腫(心包腔內有液體滯留導致心臟與心臟外膜之間空間變大)；腹部水腫(發育中的內臟與卵黃囊背緣之間有清晰的空間)；顱面異常、頜部或眼睛大小和/或形狀改變；脊索畸形；脾臟顏色變化、身體表皮顏色缺乏或變化；膽囊顏色缺乏或變化；尾部血液循環遲緩，尾部血流停滯；血液顏色蒼白程度(紅色減少或缺乏)；鰾的發育和充盈程度(孵化后鰾的充氣或未充氣)；運動狀態的改變(活動能力缺乏或減少)；以及上面未列出其他表型。觀察時，魚體在解剖學上被定位于右側側臥位，并盡量避免傾斜，從而使魚頭部指向左側。每天檢測拍照，直至第10天對所有圖片和數據進行統計分析。

LC50的95%可信限=log-1(logLC50±1.96×SX50)

式中：i表示組距，即相鄰2組劑量對數劑量之差；Xm表示最大劑量對數；p表示各劑量組死亡率；pm表示最高死亡率；q表示各劑量組存活率；pn表示最低死亡率；∑p表示各劑量組死亡率之和；n表示各組動物數；SX50表示logLC50的標準誤。

1.3 胚胎樣品前處理及硒濃度測定

為了評估硒通過絨毛膜的滲透，將青鳉魚胚胎(6～7 hpf)放置于6孔板中，并暴露于10 μmol·L-1SeMet。當胚胎發育到6 dpf時，將整個胚胎清洗后放在預先清潔、有蓋的玻璃瓶中稱量，并添加1 mL微量金屬級濃硝酸(HNO3, Sigma-Aldrich, USA)。將小瓶放置在85 ℃的金屬浴上過夜直到內容物消失變清。然后將小瓶從金屬浴中取出并在室溫下冷卻約15 min。冷卻后，用9 mL 2%HNO3和0.5%鹽酸(HCl, Sigma-Aldrich, USA)溶液稀釋消化液。使用6 mL·min-1的H2流速，高純度標準(High Purity Standards, USA)控制實驗用水。采用電感耦合等離子體質譜法(Agilent 7700X ICP-MS equipped with an Octopole Reaction System)測定硒濃度。

1.4 組織切片和蘇木精-伊紅(HE)染色

青鳉魚胚胎發育至10 dpf后收集到離心管中，用4%的多聚甲醛(PFA)固定過夜，然后用一系列濃度乙醇脫水，二甲苯透明處理后用石蠟包埋，并制作5 μm切片，放置于37 ℃恒溫箱中烘干用于HE染色。當染色時，切片首先經過二甲苯脫蠟10 min，接著用一系列濃度乙醇(100%、95%、90%、80%和70%)浸泡各2 min；然后進行常規HE染色并封片鏡檢。

1.5 總RNA提取

從對照組(10 dpf)、暴露組(0.1、1、10和100 μmol·L-1)的整個胚胎中提取RNA。收集后，使用勻漿儀(Kinematica, GT10-35，瑞士)將胚胎在1mL TRIzol?RNA試劑(Life Technologies, USA)中均質分散組織并獲取RNA。接下來，按照Dong等[30]的方法分離出總RNA。在樣品洗脫前，DNA用DNAase酶切，并根據制造商的說明(Qiagen, USA)用無RNase和無DNase水進行洗脫。使用NanoDropND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Inc., USA)測定RNA含量和260 nm/280 nm的比值。

1.6 實時熒光定量PCR

采用高容量cDNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems, USA)，使用250 ng總RNA合成互補DNA(cDNA)，反應體系為20 μL。采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測胚胎中Nrf2、GPx4和18S轉錄水平。使用PrimerQuest(Integrated DNA Technologies, USA)設計了青鳉特異性qPCR引物(表1)。采用96孔PCR板和ABIPlus One(Applied Biosystems)分別對Nrf2、GPx4和18ScDNA進行PCR擴增。每20 μL qPCR反應，用6 μL(0.1 ng·μL-1)first strand cDNA、2 μmol·L-1forward primer、2 μmol·L-1reverse primer和10 μL QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix擴增cDNA(Qiagen, Inc., USA)。qPCR反應條件為95 ℃、15 min，實施40個循環，94 ℃、15 s，60 ℃、30 s。以18S的mRNA表達量作為標準，使用2-ΔΔCt計算相對表達量[33]。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.7 SOD、MDA和ROS的檢測

青鳉魚胚胎從6～7 hpf暴露至10 dpf進行SOD、MDA和ROS的檢測。SOD的檢測利用高度水溶性四唑鹽(MTT)法，其與超氧陰離子(·O2-)反應生成一種水溶性染料，在基于黃嘌呤氧化酶偶聯反應的基礎上檢測。使用鉬酸銨法檢測CAT活性，使用碘巴比妥酸技術在532 nm處測定MDA含量，通過檢測細胞內二氯熒光素(DCFH)的熒光強度來確定ROS水平，熒光發射波長為485 nm，激發波長為525 nm。使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測每個樣品的總蛋白水平。

1.8 統計分析

所有結果的分析采用t-test、one-way ANOVA和post-hoc Tukey-Kramer測試的方法(GraphPad Software, Inc. USA)。分析采用95%(α=0.05)可信限，P<0.05表示差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 有機硒暴露在青鳉魚胚胎中的殘留

ICP-MS分析顯示，硒的暴露造成青鳉魚胚胎中硒濃度顯著升高(P<0.05)。對照組胚胎的硒濃度為0.294 mg·kg-1(以濕質量計)，暴露于10 μmol·L-1SeMet的胚胎的硒濃度為1.17 mg·kg-1(圖1(b))。暴露胚胎絨毛膜的硒明顯高于對照組(P<0.05)。

圖1 硒代蛋氨酸(SeMet)分子式及其在青鳉魚胚胎中的殘留注：(a)有機硒分子式；(b) 10 μmol·L-1 SeMet暴露在青鳉魚胚胎中的殘留，濃度以單位濕質量計；通過t檢驗檢測2組之間的差異，不同字母表示暴露組與對照組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 Seleno-L-methionine (SeMet) molecules and SeMet residues in medaka embryosNote: (a) Molecular of SeMet; (b) Effect of 10 μmol·L-1 SeMet exposure on selenium content in medaka embryos, and the content is expressed based on wet mass; differences between the two groups were detected by the t-test, and the different letters indicate significant differences between the exposure and control groups (P<0.05).

2.2 有機硒對青鳉魚胚胎死亡率和孵化率的影響

當胚胎發育到9 dpf時，對照組生存率維持在98.6%，而當SeMet暴露(0.1、1、10、100、500和1 000 μmol·L-1)時，隨著濃度的升高時生存率也逐漸降低，生存率分別是92.5%、90%、32.5%、41.3%、52.5%和0%)(圖2(a))。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1暴露組的生存率在1～10 d時接近，沒有顯著差異(P>0.05)。有趣的是，10 μmol·L-1暴露組的生存率從6 d開始顯著低于100 μmol·L-1和500 μmol·L-1暴露組(P<0.01)。當染毒到9 d和10 d時，10、100、500和1 000 μmol·L-1暴露組的生存率都顯著低于對照組的(P<0.01)(圖2(a))。通過改良寇式方法得出9 dpf的LC50為11.0739 μmol·L-1，其95%置信范圍為10.3777～11.8168 μmol·L-1。孵化率也是體現胚胎發育狀態的重要指標。對照組的孵化率在第10天達到88.5%，而0.1、1、10、100、500和1 000 μmol·L-1SeMet暴露組的孵化率分別為87.9%、86.9%、80%、63.8%、0%和0%(圖2(b))。與對照組相比，100、500和1 000 μmol·L-1SeMet顯著降低了青鳉魚的孵化率(P<0.05)?？紤]生存率和孵化率的原因，采用0.1、1、10和100 μmol·L-1的SeMet進行進一步研究。

圖2 不同濃度SeMet暴露對青鳉胚胎(幼魚)生存率和孵化率的影響注：(a)存活率；(b)孵化率；6～7 hpf青鳉魚胚胎暴露SeMet的水溶液后，每天觀察胚胎，計算存活和孵化數直到10 dpf；每組包含10個胚胎，每組3個重復；(a)中*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，與對照組相比；(b)中不同字母表示2組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 2 Effect of different concentrations of SeMet exposure on survival rate and hatching rate of medaka embryos (larva)Note: (a) Survival rate; (b) Hatching rate; embryos developing 6～7 hpf were exposed to SeMet aqueous solution; embryos were observed each day and survival or hatching numbers were counted until 10 dpf; each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with the control in figure (a); different letters indicate significant differences (P<0.05) in figure (b).

2.3 有機硒對青鳉魚胚胎表型的影響

有機硒造成青鳉魚胚胎發生多種畸形，首先觀察到心包水腫。在對照組中只有0.71%的胚胎出現心包水腫，而在10 dpf時，0.1、1、10和100 μmol·L-1SeMet暴露組的心包水腫發生率分別為1.3%、7%、3.9%和5%(圖3(b)、(d)和(e))。隨著SeMet暴露濃度的增加，心包水腫率有增加的趨勢，但各組之間沒有顯著差異。但通過組織切片和HE染色進一步確認發生心包膜水腫的幼魚，發現心臟被牽拉成為細長試管形狀，心臟內壁變薄，甚至呈現單細胞狀態(圖3(d))。其次，在6 dpf時發現SeMet暴露造成血液變淡(白血)。對照組出現血液變淡的比例為0%，而0.1、1、10和100 μmol·L-1組分別為0%、2.5%、50%和46.8%。與對照組相比，10 μmol·L-1和100 μmol·L-1組中該表型個體百分比顯著增加(P<0.05)(圖4(d)～(g))。此外，還觀察到腹部水腫、顱面異常、脊索畸形、脾臟和膽囊顏色的改變、尾部血液循環的改變、SeMet暴露組的魚鰾改變和其他改變，并有劑量依賴性增加的趨勢。雖然沒有定量，但做了總的畸形率統計。對照組的總改變率為4.1%。與對照組相比，0.1、1、10和100 μmol·L-1SeMet暴露組的總變化率分別增加了1.4倍、12.5倍、28.4倍和24.9倍。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1SeMet暴露組的發生率較低，與對照組相比沒有統計學意義。但10 μmol·L-1組和100 μmol·L-1組的總變化率明顯高于對照組(P<0.05，圖5(a))。

圖3 不同濃度SeMet暴露對青鳉胚胎(幼魚)心包水腫的影響注：(a)和(c) 對照組胚胎；(b)和(d) SeMet暴露組；(c)和(d) HE染色；(e)10 dpf時心包水腫的發生率圖；(a)和(b)中的紅色箭頭表示心臟，**表示魚鰾；(c)和(d)中的雙箭頭表示心臟壁；h表示心臟；每組包含10個胚胎，每組3個重復。Fig. 3 Effect of different concentrations of SeMet exposure on pericardial edema of medaka embryos (larva)Note: (a) and (c) Control embryos; (b) and (d) SeMet exposed group; (c) and (d) HE staining; (e) Plot of the incidence of pericardial edema at 10 dpf; the red arrow indicates the heart, and **indicates the swim bladder, in (a) and (b); double arrows indicate the heart wall, and h indicates heart, in (c) and (d); each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group.

圖4 不同濃度SeMet暴露后青鳉胚胎(幼魚)出現的白血表型注：(a)～(c)對照組；(d)～(f) 100 μmol·L-1 SeMet暴露組；(b)和(e)分別是(a)和(d)的高倍放大圖；(g)白血表型的發生；e表示眼睛，h表示心臟，o表示心包，s表示魚鰾，g表示鰓；每組包含10個胚胎，每組3個重復；不同字母表示2組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 4 Effect of different concentrations of SeMet exposure on white blood phenotype of medaka embryos (larva)Note：(a)～(c) Control group; (d)～(f) 100 μmol·L-1 SeMet exposed group; (b) and (e) are high magnification figure of (a) and (d), respectively; (g) Occurrence of white blood phenotype; e indicates eye; h indicates heart; o indicates oil drop; s indicates swim bladder; g indicates gill; each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group; different letters indicate significant difference (P<0.05).

圖5 不同濃度SeMet暴露后青鳉胚胎(幼魚)出現的表型注：(a)10 dpf時所有表型改變的比率；(b)計算游泳表現發生改變的比率；每組包含10個胚胎，每組3個重復；不同字母表示2組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 5 Effect of different concentrations of SeMet exposure on the phenotype of medaka embryos (larva)Note: (a) The rate of all altered phenotypes at 10 dpf were counted; (a)The rate of individuals showing alterations in swimming performance were counted; each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group; different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.4 有機硒對青鳉幼魚行為學的影響

觀察了孵化后個體行為學的變化。對照組幼魚魚鰾開始發育，表現出快速運動、在水柱內的一致位置和垂直方向。然而，當暴露于SeMet后，一些胚胎顯示出異常改變，對照組、0.1、1、10和100 μmol·L-1組中異常改變比率分別為2.5%、2%、15%、28.7%和29.9%。暴露造成的運動改變顯示出不規則的劑量依賴性增加趨勢，差異不顯著(圖5(b))。

2.5 有機硒對氧化應激關聯基因表達的影響

考察有機硒的暴露與氧化應激相關的基因表達的變化關系，與對照組相比，Nrf2在1、10和100 μmol·L-1組中的表達量分別增加了0.96倍、0.92倍和2.1倍。100 μmol·L-1暴露組的Nrf2表達量顯著高于對照組和0.1 μmol·L-1組(P<0.05)。GXP4在1、10和100 μmol·L-1組中的表達量分別為1.5倍、2.1倍和3.7倍(圖6)。雖然沒有統計學意義，但暴露組GPx4表達呈劑量依賴性增加趨勢。

圖6 不同濃度SeMet暴露后青鳉胚胎(幼魚)氧化應激基因表達注：(a) Nrf2；(b) Gpx4；從6～7 hpf到10 dpf，胚胎暴露于SeMet水溶液，并收集幼魚進行RT-qPCR分析；每組包含10個胚胎，每組至少3個重復；不同字母表示2組之間的顯著差異(P<0.05)。Fig. 6 Effect of different concentrations of SeMet exposure on oxidative stress gene of medaka embryos (larva)Note:(a) Nrf2; (b) Gpx4; embryos were exposed to SeMet aqueous solution from 6～7 hpf until 10 dpf and collected the larva for the RT-qPCR analysis; each group contains 10 embryos, with 3 replicates at least in each group; different letters indicate a significant difference (P<0.05).

2.6 有機硒暴露對青鳉魚造成氧化應激

當胚胎發育到10 dpf時測定SOD、CAT活性和MDA、ROS含量。與對照組相比，0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1的有機硒沒有引起SOD活性的變化，但10 μmol·L-1和100 μmol·L-1有機硒降低了SOD活性，分別顯著降低了31.1%和32.8%(P<0.05)(圖7(a))。有機硒有引起CAT活性降低的趨勢，但沒有顯著變化(P>0.05)(圖7(b))。同樣0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1有機硒沒有引起MDA和ROS的變化，但10 μmol·L-1和100 μmol·L-1的有機硒暴露顯著增高了MDA含量(1.39倍，P<0.05；1.40倍，P<0.05)，也增高了ROS(1.37倍，P<0.05；1.23倍，P>0.05)含量(圖7(c)和(d))。

圖7 不同濃度SeMet暴露后青鳉胚胎(幼魚)氧化應激指標注：(a) SOD活性；(b) CAT活性；(c) ROS含量；(d) MDA含量；胚胎在6～7 hpf至10 dpf期間暴露于SeMet水溶液；不同字母表示顯著差異(P<0.05)；每組包含10個胚胎，每組3個重復。Fig. 7 Effect of different concentrations of SeMet exposure on oxidative stress measurement of medaka embryos (larva)Note: (a) SOD activity; (b) CAT activity; (c) ROS content; (d) MDA content; embryos were exposed to a range of SeMet aqueous solution from 6～7 hpf to 10 dpf; different letters indicate significant differences (P<0.05); each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group.

3 討論(Discussion)

暴露于SeMet水溶液會影響青鳉魚胚胎的發育。SeMet(10～1 000 μmol·L-1)暴露造成胚胎的存活率和孵化率的降低，10 μmol·L-1和100 μmol·L-1SeMet引起的總表型變化明顯多于對照組。本研究發現SeMet暴露增加了異常表型，并呈現濃度-效應依賴性。有趣的是，10 μmol·L-1組與最高暴露組(100 μmol·L-1)有相似的反應，表現出中劑量效應。此外，氧化應激相關基因表達的增加可能是造成SeMet毒性作用的起因。

青鳉魚的絨毛膜只有輕微的滲透性，可對水溶性外源毒性物質造成一定程度的阻隔[31,34]。ICP-MS能夠確定胚胎暴露的硒的量，并確定絨毛膜的保護作用。研究認為，在對照組胚胎中檢測到的硒在微量營養素水平，胚胎中的硒被認為是從母體飲食獲得[35]。在暴露胚胎中觀察到硒含量的升高，表明SeMet穿過絨毛膜到達胚胎并影響其發育。

本研究觀察到有機硒造成青鳉胚胎存活率的下降，并有一定的濃度依賴性，在10 μmol·L-1SeMet時具有中劑量效應。Arnold等[22]發現100 μg·L-1和400 μg·L-1SeMet暴露造成斑馬魚胚胎死亡率的增加。Kupsco和Schlenk[12-13]也報道，在5～6 hpf時5 μmol·L-1SeMet暴露會造成青鳉胚胎存活率下降，即使在胚胎的1～8 dpf時暴露也會造成存活率的下降。本研究也發現存活率的降低，并通過改良寇式方法得出9 dpf的LC50為11.0739 μmol·L-1。而5～6 dpf后觀察到的存活率下降可能是由于孵化前絨毛膜通透性增加，允許SeMet的額外流入[22,34]。然而，本研究結果還不能解釋為什么在10 μmol·L-1時觀察到如此高的死亡率。SeMet暴露由3位不同的研究人員實施重復實驗，結果相同。同時還觀察到，SeMet也造成10 dpf青鳉胚胎孵化率下降的總體趨勢，同樣，Villalobos等[31]也有報道，持續暴露SeMet導致孵化減少。確定孵化延遲或缺失的確切原因需要探討包括宿主的生理過程和/或酶活性與硒相關的特定變化，這在未來有必要深入研究。

本研究對6～7 hpf胚胎的暴露顯示出與Kupsco和Schlenk[12-13]在5～6 hpf暴露時相似的表型變化，他們觀察到了更大的心臟和顱面畸形，并且硒組織濃度為5～6 μg·g-1時孵化率降低。雖然沒有統計學意義，但本研究早在3 dpf時就觀察到心包水腫，直到胚胎發育到5～9 dpf(結果未展示)。在早期階段，水腫的出現與心臟生長和分化的主要發育相一致[26]。在斑馬魚胚胎的硒暴露實驗中也出現心包水腫，包括納米硒、四氯化硒(SeCl4)和亞硒酸鈉(Na2SeO3)[36-38]。

本研究首次發現有機硒造成血液顏色變淺的表型。硬骨魚的造血功能已經非常明確，血液參數(即離子濃度、血紅蛋白和紅細胞壓積)也已被用作污染物引起生理反應的指標[39]。硒可以與血紅蛋白結合，使其不能攜帶氧氣，導致紅細胞死亡和呼吸能力下降[40]。已有研究表明，成魚以及胚胎硒暴露會造成血液的變化[38-39]；在斑馬魚體內，硒蛋白在胚胎中胚層和血細胞中特異性的表達[41]。已有研究證實了GPx在血液中的重要性，它被GSH還原為硒化物，然后運輸到血漿，選擇性地與白蛋白結合，最后轉移到肝臟[42]。本研究雖不能將觀察到的血液體顏色變淺的表型歸因于特定的血液學指標異常，但這可能與GSH和氧化應激相關，未來有必要深入探索青鳉造血的機制[43]。

本研究還觀察了SeMet暴露對幼魚運動的影響。成年斑馬魚飼喂含硒飼料可造成其后代的臨界游泳速度(Ucrit)、尾波振幅和運動活動的降低[44]。本研究未直接測試游泳指標，而是觀察了幼魚在水中移動和定位的能力。魚鰾完全或部分缺失可能是游泳活動減少的主要原因。這些變化意味著青鳉幼魚必須不斷移動以保持在水中的位置，從而增加其氧氣和能量消耗，導致青鳉魚幼魚的下沉和極度消瘦，甚至死亡[45]。

在魚類中，硒的毒性機制仍不清楚。氧化應激是這2種機制假說中研究最多的一種。在本實驗中，當青鳉胚胎暴露于SeMet時，Nrf2和GPx4均增加。已知多種化學物質和環境制劑可以通過Nrf2誘導抗氧化反應元件(AREs)基因[46]。在斑馬魚胚胎中，SeMet暴露導致的畸形與超氧化物歧化酶(sod2)和谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(gclc)基因表達以及總谷胱甘肽(TGSH)、還原谷胱甘肽(RGSH)和TGSH/氧化谷胱甘肽(GSSG)比率有關[21]。Penglase等[44]報道稱，經膳食暴露硒的親代斑馬魚所產子代(F1)增加了GPx蛋白(GPx1a、GPx1b、SEPP1a和SEPP1b)表達，可能是對硒產生的超氧陰離子的抗氧化反應。GPx4是一種抗氧化酶，可以直接還原磷脂和膽固醇的氫過氧化物，將有毒的過氧化物修飾為無毒的羥基化合物，以保護膜的結構和功能[47]。研究表明，氫過氧化物可觸發細胞凋亡，在細胞增殖和分化中發揮作用，并促進紅細胞成熟，維護氧化還原的平衡[48]。本實驗結果顯示硒誘導Nrf2表達的增高，這種增高可能是由于斑馬魚胚胎對抗氧化應激反應的一種保護作用。未來的工作有必要檢測細胞凋亡和其他關聯GPx蛋白的表達。

總之，本研究發現SeMet水溶液暴露會導致生命早期青鳉胚胎的發育毒性，并呈濃度依賴性。在10 μmol·L-1和100 μmol·L-1SeMet暴露組中，暴露導致存活率和孵化率下降，包括心包水腫、血液顏色和運動行為的改變。有趣的是，在眾多表型類別中，10 μmol·L-1暴露組造成的影響最大，這表明有機硒存在中劑量效應。此外，有機硒造成氧化應激關聯指標的增加可能是造成青鳉胚胎毒性的作用機制。未來有必要與其他種類硒的暴露進行比較，加強對硒所引起胚胎毒性的認識。此外，延長低濃度有機硒持續暴露時間，可進一步了解早期暴露對青春期或者成年的影響。