制干辣椒果實辣椒素對干旱、鹽及其雙重脅迫的響應

呂慧 吉雪花 張中榮 朱冉冉 王世寧 謝雪果 袁雷

摘? ? 要：為明確干旱、鹽等環境因素對制干椒辣椒素含量的影響，試驗以紅龍23號板椒為材料，從現蕾期開始設置不同土壤含水量65%（W1）、45%（W2）和NaCl（S1=120 mmol·L-1）及鹽旱復合處理（W1S1、W2S1），利用高效液相色譜法分析轉色期果實辣椒素素含量，并送樣進行轉錄組測序。結果表明，W1處理下辣椒素含量較對照增加107.11%，W2處理時辣椒素含量下降73.01%;含鹽處理均能提高辣椒素含量，其中W2S1處理的較對照高392%。鹽、旱脅迫主要影響苯丙烷生物合成途徑，其中HCT、4CL、CAD等基因表達受影響較大;聚類分析表明BCKDHE2、ENRb等基因主要響應干旱脅迫，CCR、GS2 主要響應鹽脅迫。由上可知，適度干旱和鹽脅迫均能提高辣椒素含量;干旱加劇時與鹽分的復合效應更顯著，對辣椒素積累的促進作用更大。

關鍵詞：辣椒素;干旱脅迫;鹽脅迫;雙重脅迫;轉錄組

中圖分類號：S641.3 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2871（2022）02-078-07

Capsaicin of dry pepper fruit grown under drought， salt and combined stress condition

Lü Hui， JI Xuehua， ZHANG Zhongrong， ZHU Ranran， WANG Shining， XIE Xueguo， YUAN Lei

（Agricultural College of Shihezi University/Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germplasm Resources Utilization， Shihezi 832000， Xinjiang， China）

Abstract： Honglong 23 pepper was cultivated in pots stressed with drought and salt from budding to fruit color break to understand the effects of stress on capsaicin in pepper fruit for drying. Soil water contents were 65% （W1） and 45% （W2） of saturated content， NaCl concentration was 120 mmol·L-1（S1）， and combined stresses were W1S1 and W2S1. Capsaicin contents were measured with HLPC， transcriptional data was analyzed by Personal Biotechnology Co Ltd. The results showed that the capsaicin content of pepper fruit under W1 treatment was 107.11% higher than that of the control， and the capsaicin content with W2 treatment was 73.01% lower than that of the control. Salt treatments （S1， W1S1， W2S1） increased the capsaicin content， and the capsaicin content in W2S1 treatment was 3.92 times of the control. Salt and drought stresses mainly affected the phenylpropane biosynthesis pathway of capsaicin， and had a great impact on the expression of HCT， 4CL， CAD genes in phenylpropane pathway. Cluster analysis showed that CPR， pAMT2 genes responded to the three stresses， while BCKDH E2， ENRb mainly responded to water stress， CCR and GS2 mainly responded to salt stress. Moderate drought and salt stress can increase the content of capsaicin in fruits. The combination of severe drought and salt had the most significant effect on capsaicin， while the mild drought and salt had little effect.

Key words： Capsaicin; Drought stress; Salt stress; Combined stress; Transcriptome

辣椒因其特殊的風味，備受人們的喜歡，而制干辣椒是新疆新興的特色經濟作物，隨著種植規模的不斷擴大，新疆已成為全國制干椒的原料生產基地。制干辣椒可用于提取辣椒素、辣椒紅素等高附加值產品[1-2]。辣椒素類化合物是辣椒產生辛辣味的主要來源物質，同時也是評價制干辣椒果實品質的重要指標。研究表明辣椒素類物質有30多種，其中辣椒堿和二氫辣椒堿是辣椒素主要成分，占果實辣椒素總含量的90%[3-4]。辣椒素作為一種次生代謝產物，在農藥研發、軍事防御、食品加工、醫學藥理、臨床研究等方面被廣泛使用[5-7]。辣椒素主要在果實胎座中形成，其含量較低，供不應求，限制了其在市場中的大量使用[8]。因此，提高辣椒素含量是辣椒栽培和育種環節的重要目標。

辣椒素類物質的合成途徑主要有兩條：苯丙氨酸途徑和支鏈脂肪酸途徑[3，9-10]。多個基因參與了上述兩條途徑。目前已克隆的辣椒素代謝相關基因有PAL、C4H、CoAOMT、pAMT、KAS、ACL、FAT、ACS和AT3 等基因[11-12]。研究表明果實胎座中的C4H、CoAOMT、pAMT、KAS、AT3等基因的表達量與辣椒素含量呈正相關關系[13]。

辣椒素的含量不僅取決于基因型，還受到外界環境的影響。張海英[14]研究表明堿性鹽脅迫可以顯著提高紅熟果中辣椒素的含量。新疆氣候干旱、水資源短缺，而地表蒸騰強烈，因此鹽堿土面積較大。實際生產中制干辣椒生長期面臨著鹽堿和干旱的雙重脅迫[15]。目前，對辣椒素的環境影響研究主要集中在單一因素，且多在生理方面開展，對復合脅迫下的變化報道較少。

筆者以制約新疆制干辣椒生長的兩個關鍵環境因子干旱和鹽為出發點，采用高效液相色譜和轉錄組測序技術，分析辣椒素代謝相關基因在干旱、鹽及雙重脅迫下的表達，結合辣椒素含量的變化，明確其對干旱、鹽及復合脅迫的響應差異，為農業生產中提高制干椒辣椒素含量提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為加工辣椒品種紅龍23號羊角椒，由新疆天椒紅安農業科技有限公司提供。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機方式，2020年3—8月于新疆石河子大學農學院試驗站日光溫室進行（85°59′E，44°18′N）。將催芽后的紅龍23號種子播種到體積比草炭∶蛭石=2∶1的穴盤中（尺寸為540 mm×280 mm），待其至6片真葉時定植于盆土體積比為草炭和蛭石（2∶1）∶園土（殺菌消毒）∶沙子=2∶4∶1的花盆（30 cm×45 cm）中，每盆質量8 kg。試驗設置3個水分梯度：正常水分W0（土壤相對含水量為100%）、輕度干旱W1（土壤相對含水量為65%）、中度干旱W2（土壤相對含水量為45%）;2個鹽濃度：無鹽S0（NaCl=0 mmol·L-1）、重度鹽S1（120 mmol·L-1），共6組處理，分別為CK（W0S0）、干旱脅迫（W1、W2）、鹽脅迫組（S1）、鹽旱雙重脅迫（W1S1、W2S1）組（具體見表1）。試驗于花后7 d進行處理，每處理10盆，每盆3株重復。采用稱質量法控制水分含量，每2～3 d稱質量1次;鹽分通過電導率控制，每2～3 d測定1次。處理后20 d于轉色期采果實測定。各處理選第2～4層果實2～3個置于液氮速凍，-80 ℃保存。

1.3 指標測定

1.3.1? ? 辣椒素含量的測定方法? ? 參照厲志偉等[16]和張海英[14]的方法稍加改進。將辣椒果實置于105 ℃殺青30 min，而后于50 ℃烘干至恒重，在60 ℃水浴中超聲輔助甲醇提取樣品中辣椒素及二氫辣椒素。用LC-2010AHT高效液相色譜儀進行辣椒堿及二氫辣椒素的HPLC 測定。流動相體積比為甲醇∶超純水=80∶20，檢測波長為280 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL?？偫苯匪睾?（辣椒素含量+二氫辣椒素）/90%。

1.3.2? ? Illumina測序及測序數據的分析? ? 委托南京派森諾基因科技有限公司進行Illumina測序。原始下機數據（Raw Data）經過過濾，去除帶接頭、低質量的Reads后得到高質量序列（Clean Data），將過濾后的Reads比對到參考基因組GCF_000710875.1_Pepper_Zunla_1_Ref_v1.0_genomic.fna進行對比，對比對上的Reads進行拼接，還原出轉錄本序列;分析比對所得基因功能注釋，所用的數據庫為GO（Gene Ontology），KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）。

根據對照組（CK）和各處理組間基因表達量對比進行差異表達分析，以表達差異倍數 |log2 FoldChange| > 1、顯著性以p < 0.05作為篩選差異表達基因條件，并對差異表達基因進行代謝通路富集分析。

1.3.3? ? 差異基因的qRT-PCR驗證? ? 選取差異表達基因并采用Trizol試劑提取果實的RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行反轉錄，引物序列的設計及合成均由上海生工生物工程公司完成。每處理的每個基因3次重復，按照2-ΔΔCt相對定量法計算基因相對表達量。

1.4 數據處理

所得的試驗數據采用Excel 2010、SPSS17.0軟件進行統計分析，用Origin 9.0軟件進行作圖。聚類分析采用在線軟件Clust Vis制作：https：//biit.cs.ut.ee/clustvis。

2 結果與分析

2.1 干旱、鹽及雙重脅迫對辣椒果實中辣椒素含量的影響

由圖1 可知，輕度干旱、鹽及雙重脅迫均有利于果實辣椒素的積累，且果實中辣椒素含量與對照（CK）相比差異顯著。單一脅迫時，S1中辣椒素增加幅度較W1小;且辣椒素含量隨著干旱程度的加劇而急劇減少，W1較對照顯著提高了107.11%，W2較對照顯著減少了73.01%。雙重脅迫下，W1S1處理的辣椒素較對照顯著增加了43.55%，較W1顯著下降了30.69%，但與S1間差異不顯著。W2S1的辣椒素含量較對照顯著提高了3.92倍，較W2顯著提高了12.69倍，較S1顯著提高了2.61倍。上述結果說明適度的干旱和鹽脅迫均能提高辣椒素含量，重度干旱時鹽旱互作明顯。

2.2 干旱、鹽及雙重脅迫下辣椒果實差異表達基因分析

由圖2可知 W1處理中有1440個差異基因，其中630個基因表達量上調，810個基因表達量下調。W2有1592個差異基因，其中992個基因表達量上調，600個基因表達量下調。S1檢測出2416個差異表達基因，其中1343個上調，1073個下調。W1S1處理有2254個差異基因，其中1212個基因上調，1042個基因下調。W2S1處理有2822個差異基因，1576個基因表達量上調，1246個表達量下調。以上結果表明差異基因數目隨干旱程度的加劇而增加。含鹽處理（S1、W1S1、W2S1）的差異基因數量高于干旱處理（W1、W2）。

2.3 差異表達基因KEGG pathway分析

筆者集中對苯丙烷生物合成，苯丙氨酸代謝，脂肪酸生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等與辣椒素代謝有關的途徑進行分析。如圖3所示，干旱、鹽及其雙重脅迫下與辣椒素有關的途徑主要集中在苯丙烷生物途徑上，其次為苯丙氨酸途徑和脂肪酸途徑。整體上W2S1對5條途徑都較敏感，W2處理對各途徑的響應較緩慢。在苯丙烷合成途徑中，W1、W2S1的上調基因數目較多，而W2、W1S1上調基因個數基本一致;S1和W2S1下調基因數目較多。S1、W2S1在苯丙氨酸代謝途徑中上調和下調的差異基因均較多。在脂肪酸合成途徑中，W1S1和W2S1的上調基因數目均較多，W1和S1的下調基因數目較多。在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成途徑中，干旱脅迫處理的差異基因均下調;含鹽處理S1、W1S1和W2S1的差異基因上調、下調均較多。S1、W2S1處理的差異基因在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸途徑中上調和下調基因較多。以上表明S1、W1S1及W2S1等含鹽處理的差異基因在各途徑中的富集程度高于W1、W2等單一干旱脅迫，其中W2S1處理的果實辣椒素相關基因在各途徑富集程度均較高，除苯丙烷途徑外，W1和W2處理的辣椒素差異基因在其他途徑富集程度不高。

2.4 辣椒素代謝相關基因的聚類分析

研究分析了43個與辣椒素代謝相關的基因在干旱脅迫、鹽脅迫及其雙重脅迫下的表達量，并對各處理下的基因進行表達譜聚類分析，由圖4可知，可將辣椒素相關基因分為A、B兩組。

A組共有13個基因，按照表達模式又分為4小類A1、A2、A3、A4。

A1組：包含BCKDH E2基因。該基因位于支鏈脂肪酸途徑的中游。該基因在W1處理下的表達量高于其他處理，在W2中表達量最低。BCKDH E2在含鹽處理S1、W1S1、W2S1的表達量均低于CK。

A2：CAD、SAMSyn、ACS2等，這組基因在CK 和W1S1處理中表達量均較低。單一干旱或單鹽脅迫的CAD基因表達量高于CK和復合脅迫。SAMSyn、ACS2基因在W1、W2中的表達量高于CK，同時隨著干旱程度的增加而增加。SAMSyn、ACS2基因在S1、W2S1的表達量高于CK，在W1S1中表達量低于CK。在S1、W1S1、W2S1等含鹽處理中，SAMSyn、ACS2基因表達量變化較大，先下降后上升。

A3組：該組只包含ACS1基因。該基因在W1S1處理中表達量最高，而在其他處理中表達量較低。

A4：包括pAMT2、PAT、CCR、Fdx-GOGAT、GS2、CPR、ALS、AHRI等基因，上述基因在W2S1復合脅迫下表達量較高，其次為W1S1處理，在CK和W1處理中表達量較低。

B組共有30個基因，按照表達模式又分為5小類B1、B2、B3、B4、B5。

B1：BCAT是支鏈脂肪酸途徑的中游基因，在CK中表達量最高，而在W1中表達量最低，在其他處理組的表達量均較低。

B2：包括ENRb、ADT、IPMI、IPMS、IPMDH基因。這組基因在W1處理下表達量很高，其次為W2處理。在S1、W1S1、W2S1等含鹽處理中表達量均較低。

B3：HCT、KasI、4CL等基因在W2中的表達量最高，在W2S1和S1中表達量較低。

B4：KasIIIb、CCoAOMT、BCKDH E1a為一類，其在CK中表達量較高。其中，BCKDH E1a表達量最高，3個基因在W1、S1、W2S1處理中表達量均較低。其中，CCoAOMT在W2S1中表達量最低。

B5：包括α-CT、DH、C4H、FatB、PDH E1a、PDH E1b、KR、PDH E2、ENRa、PDH E3、BC、PAL、BCCP、KasIIIa、MCAT、C3H、BCKDH E3、CM1等18個基因。這組基因在CK、W2、W1S1中表達量較高，在S1、W2S1中表達量較低。在W1、W2處理中，α-CT、DH、C3H的表達量隨干旱程度的增加而減少。在含鹽處理中，α-CT、DH、C4H、FatB、PDH E1a、PDH E1b、KR、PDH E2、ENRa、PDH E3、BC、PAL、BCCP、KasIIIa、MCAT、BCKDH E3、CM1在W1S1的表達量均高于S1、W2S1處理。α-CT、DH、C4H、FatB、PDH E1a、PDH E1b、KR、PDH E2、ENRa、PDH E3、BC在W1S1的表達量均高于W1，PAL、BCCP、KasIIIa、MCAT、C3H、BCKDH E3、CM1在W1S1的表達量則低于W1。α-CT、DH、C4H、FatB、PDH E1a、PDH E1b、KR、PDH E2、ENRa、PDH E3、BC、PAL、BCCP、KasIIIa、MCAT、C3H、BCKDH E3、CM1基因在W2的表達量均高于W2S1。輕度干旱時，加入鹽分后，可以提高α-CT、DH、C4H、FatB、PDH E1a、PDH E1b、KR、PDH E2、ENRa、PDH E3、BC等的表達量，當干旱脅迫加劇后，則會降低基因的表達量。

2.5 辣椒素代謝相關差異基因分析

在43個辣椒素代謝相關基因中以差異倍數 |log2FoldChange| > 1、顯著性p < 0.05為標準，篩選各處理組中符合條件的差異基因并作分析（表3）。

在處理W1中篩選出3個表達量顯著下調的辣椒素代謝相關基因KasI、BCAT、BCKDH E1a;W2處理中，有4個差異基因，BCKDH E1a顯著下調，KasI、HCT、GS2顯著上調;S1處理中有13個差異基因，分別為C4H、KasI、KasIIIa、PAL、BCKDH E1a、CM1、GS2、PDH E1a、PDH E1b、PDH E3、BC、ENRa、MCAT。其中，GS2基因表達量顯著上調，其余表達量顯著下調;BCAT、ACS1、GS2在W1S1處理下差異顯著，其中，BCAT表達量顯著下調，其余下調;在處理W2S1中，GS2表達量顯著上調，KasI、PAL、C3H、BCKDH E1a、CM1、PDH E3、BC、ENRa、MCAT基因表達量下調。

2.6 差異基因的實時熒光定量qRT-PCR

為確保轉錄組測序數據的準確性，從差異顯著的基因中隨機選取10個基因HCT、KasI、KasIIIa、C4H、PAL、BCKDH E1a、BCAT、ENRa、GS2、ACS1進行表達量驗證。由圖5可知，10個辣椒素合成相關基因在干旱脅迫、鹽脅迫、旱鹽脅迫下均有表達，且表達量有差異。HCT基因在干旱脅迫下表達量上調，在鹽脅迫和旱鹽雙重脅迫時表達量均降低。KASI基因在W2和W1S1處理中表達量上調，其余處理表達量下調。KasIIIa、PAL、C4H、BCKDH E1a、BCAT、ENRa基因在各處理下表達量均降低。GS2、ACS1在各處理下表達量均上升。以上各基因的表達量均與轉錄組測序得到的趨勢一致，確保了測序結果的準確性。

3 討論與結論

辣椒是廣受消費者歡迎的一種蔬菜和調味品，在世界范圍內廣泛種植。辣椒素類物質作為辣椒中的辣味成分，其含量受品種影響的同時還會受到栽培措施和環境因素的制約[17-19]。干旱和鹽堿是新疆制干辣椒栽培過程中面臨的主要環境脅迫因子[3，10，20]。本試驗結果表明，辣椒素含量在土壤含水量為75%時較對照明顯提升，在含水量為45%時顯著減少，并且辣椒素含量在鹽脅迫及旱鹽雙重脅迫下均能得到顯著提升，這可能是由于植株受到較大程度的干旱脅迫后，氣孔關閉，光合下降，碳水化合物的合成不足，從而減少了辣椒素的合成，或者辣椒素在受到鹽脅迫后，產生了較多能為辣椒素提供底物的防御物質。這與彭瓊等[21]、Arrowsmith[22]對辣椒素在干旱、鹽脅迫下的研究結果相似。

辣椒素類物質合成需要在眾多的基因和基因家族的共同參與下才能完成，而目前對辣椒素的合成代謝調控認識有限，還需進一步研究。筆者發現含鹽處理（S1、W1S1、W2S1）在辣椒素代謝通路中的富集程度要高于干旱處理，且辣椒素代謝相關基因在干旱、鹽及旱鹽脅迫中的表達量存在差異。其中，PAL在含鹽處理中的表達量隨水分的減少而降低，說明PAL基因的表達與水分關系密切。有研究表明C4H、ACS、KAS及CCoAOMT基因的表達與辣椒素的積累呈正相關[23-24]，但本試驗中以上幾個基因與辣椒素的積累規律性不強。CCoAOMT基因在脅迫下的表達量均較低，KasI、KasIIIa、KasIIIb在含鹽處理中表達量低或幾乎不表達，說明以上基因受干旱或鹽的影響較大。ENRb、ADT、IPMI、IPMS、IPMDH基因在W1中表達量較高，在W2中表達量較低，說明這些基因對水分較為敏感。HCT、KasI、4CL基因在W2中表達量較高，其余脅迫中較低，說明干旱能刺激基因的表達。SAMSyn、ACS2、pAMT2、PAT、CCR、Fdx-GOGAT、GS2、CPR、ALS、AHRI基因在W2S1中表達量高于其他脅迫，說明在干旱和鹽脅迫的共同刺激下促進其表達。但對這43個基因在干旱、鹽及雙重脅迫下的作用機制有待進一步研究。

綜上所述，辣椒素含量在適度干旱、鹽脅迫或旱鹽脅迫下均能明顯提升，重度干旱抑制其合成。含鹽處理對代謝通路富集更顯著，辣椒素相關基因在干旱、鹽及旱鹽脅迫中的表達模式存在明顯的差異。該結果為農業生產中提高辣椒素含量以及辣椒的栽培管理提供了理論指導。

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