割手密細胞遺傳學研究進展

張靜，趙麗萍，胡鑫，姚麗，昝逢剛，覃偉，劉家勇

（1.云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699；2.云南省農業科學院甘蔗研究所瑞麗育種站，云南瑞麗 678600）

0 引言

甘蔗作為一種糖、能兼用型植物，蔗糖是國家發展必不可少的戰略物資之一。甘蔗產業發展至今，有性雜交仍然是其育種發展的關鍵。然而，現代甘蔗品種大多源于百年前創制的親本以及各品種間的相互雜交，導致親本間遺傳基礎同質化，新品種選育難以實現突破性進展。近年來，意識到早期育種工作中被納入甘蔗育種的無性系遺傳基礎有限[1]，在收集的野生種質資源中還有許多理想性狀，如耐旱、耐澇等尚未被引入商品種內，加上源自甘蔗育種進程緩慢的危機感和對生物能源的興趣，育種家們將越來越多的目光投向了野生種質資源的利用。割手密（Saccharum spontaneumL.）又稱甘蔗細莖野生種，其基因類型多樣，表性差異巨大，遺傳多樣性豐富。割手密地理分布廣泛，在南北緯40°內均有發現，遍及多個氣候區。作為甘蔗屬野生種的一員，其長期經受自然界優勝劣汰的選擇，形成了各種抵抗生物/非生物逆境的優良特性，如根系發達、耐旱、分蘗多、生勢強、宿根性好、抗逆性強等，是最早用于甘蔗雜交育種的資源，也是甘蔗屬中最具價值的野外資源[2-3]。為了更深入了解、掌握國內外對割手密的研究情況，本文對其細胞遺傳學研究方面進行綜述，以便為割手密在甘蔗育種中的進一步開發利用提供參考。

1 割手密在甘蔗育種中的應用現狀

割手密、大莖野生種（Saccharum robustumL.）和熱帶種（Saccharum officinarumL.）被認為是甘蔗屬的3個原始種[4]。甘蔗高貴化育種技術以熱帶種為母本，野生種質資源為父本進行雜交，獲得的后代繼續作父本與熱帶種或栽培種進行雜交，將野生優良性狀引入甘蔗的同時，保留甚至加強了后代中高貴種的高產高糖基因[5-6]。高貴化育種思路提出后，甘蔗育種家們利用該方法選育出了大量優秀的甘蔗品種和一批優秀的親本材料[7-10]?，F代甘蔗品種的高糖來源于熱帶種的高貴血緣，而它們的抗逆性、抗病性和宿根性則是在“高貴化”尤其是和熱帶種回交過程中由割手密基因的滲入帶來的[1，5，11]。

20 世紀前期爪哇和印度育種家們利用熱帶種和割手密雜交，實現了甘蔗育種史上的第一次飛躍式發展[10，12]。據報道，爪哇甘蔗育種場JESWIET以熱帶種和爪哇割手密為親本通過高貴化育種選育出了‘POJ’系列品種和親本材料，其中‘POJ2878’被稱為第一代蔗王；印度哥印巴托甘蔗育種場通過熱帶種、割手密和印度種之間不斷雜交獲得了高產高糖且抗病性良好的‘Co’系列品種[7]。美國路易斯安那州利用割手密選育出了早熟、高糖、耐寒性強的‘CP65-357’[3]。20世紀中后期，我國臺灣利用臺灣割手密育成了‘新臺糖’系列品種[13]。

我國大陸利用割手密進行甘蔗雜交育種，最早是在1954 年，我國海南甘蔗育種場首次利用本土割手密（‘崖城割手密’）與‘POJ2878’雜交，成功獲得高貴化后代‘崖城55-7’[10]。之后通過‘Badila’ב崖城割手密’、‘Crystalina’ב陵水割手密’、‘Badila’ב云南割手密’（‘云南75-2-11’）分別育成了‘崖城58-43’和‘崖城58-47’，‘崖城79-290’、‘崖城82-108’等創新材料。截至2012年，上述材料中‘崖城55-7’已育成3個品種，‘崖城58-43’和‘崖城58-47’育成30 個品種（分別為6 個和24 個）[10，14]。通過‘崖城79-290’ב崖城79-257’獲得了含2 個本土割手密血緣的‘崖城84-153’，育成了‘桂糖24 號’和‘涼蔗2 號’[10]，其中‘涼蔗2 號’含有4 個不同割手密的血緣[15]。云南省農業科學院甘蔗研究所瑞麗育種站利用云南‘蠻耗割手密’育成了第一個含云南野生甘蔗種質血緣的‘云蔗99-155’[16]，而后創制出的含云南割手密血緣的‘云瑞’系列親本也已陸續提供給各育種單位使用。目前在我國蔗區大面積推廣的‘粵糖93-159’、‘云蔗05-51’、‘桂糖42 號’等甘蔗品種或多或少都含有幾種割手密的血緣[12]。

然而，盡管我國對割手密資源的利用已開展多年，獲得了一些含有割手密血緣的優良品種和親本材料，但已選育出生產品種的僅有‘崖城割手密’、‘云南75-2-11’和‘陵水割手密’等少數幾份[10]，相較于豐富的割手密資源（截至2020 年12 月，我國國家甘蔗種植資源圃保存的割手密資源已達961 份[12]），對割手密資源的利用顯然十分有限。

2 割手密的細胞遺傳學研究概況

細胞遺傳學誕生后，研究者們通過多年對多種植物的研究，建立了染色體核型分析、染色體分帶等經典細胞遺傳學技術，為物種的起源、系統分類及植物遺傳改良等提供了細胞學信息[17]。20 世紀60 年代以后，DNA雙螺旋解析、顯微技術和原位雜交等技術的加入使得植物細胞學和分子細胞遺傳學快速發展。

2.1 割手密染色體數目研究

2.1.1 染色體總數

不同類型割手密的染色體數目存在差異，一般在2n=40～128[1，18-19]，染色體數目的不同反映了資源基因的遺傳多樣性。1915 年，KUWADA[20]最先報道了日本一個割手密的染色體數目為2n=68。王水琦[21]和潘世明等[22]對福建省境內搜集到的割手密進行染色體觀察，發現了2n=72～102等7種類型，在國內首次報道了2n=84、88、92、96、102 幾種類型。其中以2n=80、96 兩種類型居多，2n=80 的類型分布最廣，在福建各地均有分布，2n=72 型來自閩北，2n=88、92 大多來自閩西、北，2n=96、102 源自閩東、南。楊清輝等[23]對87 份云南割手密進行染色體數目觀察，發現其有2n=60、64、70和80四種類型，其中60和70類型的割手密是國內首次報道。蔡青等[24]對國家甘蔗種質資源圃中來自9 個省區的247 份割手密進行染色體數目鑒定，得到了2n=60、64、70等共11種不同類型并將其與原生境海拔、緯度以及莖徑這一農藝性狀相關聯，其中2n=104和2n=108兩種類型為首次報道。文建成等[25]觀察了源自云南、四川、福建等6 個省區的106份割手密無性系，發現了2n=60～108的11種類型，以2n=80、64、96為主，分別占據觀察總數的67.0%、11.3%和9.4%。

PANJE 等[26]報道東半球不同地區442 個割手密無性系包含了31 種染色體數目類型，按照地理位置將其分為三類：東部割手密的染色體數為2n=80～112，以80、96、112 為主；中部地區的割手密為2n=40～80，以60、64、72 為主；西部地區為2n=112～128，以112、120、128為主。同時，發現染色體數為8倍數的群體似乎比其它群體具備更高的生存價值。MUTHUMANI 等[27]對印度喀拉拉邦采集的45份割手密進行細胞學研究，除‘IND9-902’為2n=72 型外，其余皆為2n=64 的細胞類型，他們推測2n=72 型可能來源于當地2n=64 和2n=80兩種類型的雜交。JANAKI[28]研究了源自印度、緬甸、東印度不同地域的割手密，從中發現了2n=48、56、64、72、80、96 和112 七種類型。從染色體數目來看，該物種的染色體基數為x=8，2n=56、64 和72 的形式分別為7x、8x和9x，7x和9x類型染色體中存在一些奇特的染色體，按照預期這兩類割手密的減數分裂中會出現單價和多價體，然而，JANAKI 的研究中，來自印度的許多無性系在減數分裂中都有規律地出現了28、32、36 個二價體，基于此，認為這些物種是由x=10和x=6型的物種雜交產生的二元形式。

2.1.2 染色體基數與物種進化

據D′HONT 等[29]的報道，熱帶種和大莖野生種的染色體基數為x=10，而割手密為x=8。ZHANG 等[11]通過研究認為割手密基本染色體數目從10 個減少到8 個，是由2 條祖先染色體的分裂和4 條染色體的易位引起的。GARSMEUR等[30]基于SNP遺傳圖譜提出，與熱帶種相比，割手密染色體基數的變異是由兩對3條染色體重排在2 條染色體上引起的，這一結論在PIPERIDIS 等[31]和MENG 等[32]的研究中被加以證明。PIPERIDIS等[31]利用染色體特異性寡核苷酸探針研究了5 種割手密的染色體結構。結果顯示，割手密‘Coimbatore’和‘Glagah’的染色體數目分別為2n=8x=64 和2n=14x=112，與PANJE 等[26]的研究結果一致；但‘Mo15904’與PANJE的研究結果（2n=80）略有不同，為2n=10x=79，為非整倍體，有兩個尚未確定的染色體發生了易位。首次確定了割手密無性系‘SES186’和‘SES196’的染色體基數為x=9，染色體數目分別為2n=53和54，與PANJE的結果稍有出入，‘SES186’缺少了9號染色體，為非整倍體；‘SES186’、‘SES196’的9條基本染色體有7 條與熱帶種的相同，兩條與染色體基數x=8 的割手密相同，故認為x=9與x=8 的割手密發生了重排，是x=10與x=8的中間步驟。

AITKEN等[33]通過研究提出，高粱和甘蔗兩物種分化后，甘蔗中發生了多次染色體重排事件，其中2次對甘蔗的基本染色體數目產生了重大影響，導致了x=8 割手密的形成。DONG 等[34]基于高粱基因組，從割手密‘SES208’（2n=8x=64）BAC 文庫中篩選出低拷貝BAC 做探針，利用FISH 技術探究了割手密與高粱兩物種間的關系，證明了割手密和高粱間染色體重排事件的發生。MENG 等[35]基于高粱參考基因組成功設計合成了寡核苷酸，并針對高粱的10 條基本染色體制備了10 種特異性染色體寡核苷酸探針，將其用于割手密‘SES208’的FISH 研究，發現每一個探針都可在割手密的8 條染色體中觀察到信號。通過進一步研究，認為染色體重排事件的發生可能是造成染色體基數由高粱的x=10變為割手密中x=8 的原因，基于對單條染色體的精確分析，還首次獲得了同源多倍體割手密的標準核型。

在MENG 等人的另一篇報道中[32]，開發了一套基于割手密（x=8）基因組的寡核苷酸探針，通過FISH 技術同時區分八倍體‘SES208’的64 條染色體，通過FISH，論證了現代甘蔗品種中割手密和熱帶種染色體的重排現象；對割手密導入系‘Nepal-X’進行檢測，發現其是一個染色體基數x=10的四倍體，通過細胞學和DNA 水平分析，證明了其與x=8 割手密關系密切。群體遺傳結構和系統發育關系分析表明，‘Nepal-X’屬于古泛馬來西亞群，x=10四倍體割手密的發現表明染色體基數不同的割手密的基因組和多倍體序列具有平行進化路徑。ZHANG 等[4]在高粱和熱帶種/大莖野生種之間檢測到了71 個染色體間的重排，其中有24 個重排為熱帶種和大莖野生種共有，這些重排發生在兩物種形成之前，通過對2 000多對割手密、熱帶種和大莖野生種基因對的分析，認為熱帶種和大莖野生種的祖先在約76.9萬年前從割手密中分離出來，二者又在38.5萬年前發生了分化。物種譜系發生分化后，3個甘蔗祖親種之間有著獨立的多倍體化進程[4，31，36-37]。

研究者們根據染色體計數和配對觀察，提出割手密染色體基數有x=5、6、8、10 和12 幾種類型，但以x=8和10較為合理，因為染色體數目多為8的倍數，其次是10的倍數[31]。導致x=8 的染色體重排可能由于選擇優勢[31]和/或重排后的染色體被優先傳遞給后代[38]，而存在被定殖于物種中的可能，或是更傾向于進一步多倍體化，從而提高了該物種的適應性，有利于割手密的地域擴展[31]。

2.2 割手密染色體核型

已有的研究表明，不論染色體的總數如何，割手密無性系之間的核型均存在差異。SREENIVASAN[18]研究了22份2n=40～126的8個不同類型割手密無性系的核型，發現了1A、1B、2A三種核型類型，揭示了同一染色體類型內及不同染色體類型之間的差異性和相似性，認為在割手密核型進化過程中染色體形態改變最小，近端著絲點染色體缺乏，中部著絲點染色體占優勢，且染色體數目少的類型有著更短的染色體。MUTHUMANI 等[27]的研究中，45 份印度喀拉拉邦割手密無性系中有5 份符合1A、2A 或2B 核型，4 個無性系中存在衛星染色體；2n=64型的割手密無性系減數分裂基本規整，單價體很少，花粉育性高；而‘IND99-902’無性系（2n=72）的減數分裂過程中出現了單價體、落后染色體和染色質橋等異常行為，花粉不育。王先宏等[39]利用核型分析探討不同基因型割手密無性系間的親緣關系，發現10份材料中有2份為1B核型，7份2B核型，1份2C核型；供試材料中絕大多數染色體為中部著絲點染色體，少數為近中部及正中部，部分具備端部著絲點和近端部著絲點區染色體。王英等[40]采用核型分析方法對‘崖城割手密11 號’進行研究，發現其染色體數為2n=64（58～64），第19、28、30、32號染色體為近中部著絲點染色體，第31號染色體具隨體，屬于2A 核型。

2.3 割手密染色體行為

2.3.1 減數分裂

由于割手密染色體的著絲點大多位于中部，其減數分裂總體上是正常的，主要以二價體的形式出現[18，41-42]，減數分裂正?？梢员ＷC花粉的可育性不受或少受影響[42]。減數分裂的異常行為包括單價體、偽二價體、異形或不等二價體、染色體嵌合現象、二價體二次締合等。SREENIVASAN等[19]研究不同割手密無性系減數分裂中出現的異常行為，在觀察的28 份無性系中有21 個出現了不等二價體，末端或間隙缺失被認為是不等二價體出現的原因；14個無性系在終變期和中期存在不同數量的單價體；在3個無性系中發現了三價體和四價體；14 個無性系的染色體出現了二價體二次締合的現象；僅在無性系‘SES503’中發現了補體分離的現象，在中期22%的花粉母細胞中，二價體被分成兩組或三組，每組都有自己的紡錘體。22份不同類型的割手密中，少數無性系的減數分裂中觀察到的單價體主要源于棒狀二價體的過早分離，多個無性系中觀察到的異形二價體被認為是染色體結構改變的證據；在9個無性系中觀察到B染色體，且同一植物不同細胞中B染色體的數目存在差異，此外在多個無性系中還發現了二價體二次締合的現象[18]。據報道[14，43]，MEBRA等發現印度2n=40、54、56、72、44的割手密減數分裂后期可以觀察到染色體鑲嵌、聯會消失、不集合的二價體及多紡錘體和染色質橋等異常行為，并認為胚組織中染色體鑲嵌是不同細胞型進化的重要因素。

在割手密雜交后代的研究中，割手密（2n=64）×河八王屬的雜交后代中出現了不同數量的單價體、二價體、三價體、四價體以及落后染色體和微核[43]。JANAKI[44]發現，2n=112 的割手密與2n=20 羽蔗茅的雜交F1在減數分裂過程中會出現單、二、三、四價體，其中單價體來自于蔗茅屬基因組，7 個單價體的出現伴隨著一個四價體和一個三價體；同源配對后的各個時期不規則，伴有落后染色體的出現和單價體的消失，偶后出現雙核四分體。

2.3.2 染色體遺傳方式

與經典的細胞遺傳不同，甘蔗有性雜交育種時，親子代之間染色體的傳遞方式多樣，且與雜交親本相關聯[7]。在甘蔗屬與其近緣植物雜交的嘗試中，人們發現，割手密作母本與河八王屬、硬穗屬雜交的后代中，分別會出現n+n、2n+n和n+2n的染色體遺傳方式[43]。割手密（2n=112）與羽蔗茅（2n=20）的雜交F1（2n=66）中，親本染色體以n+n的方式傳遞；對F1單株自交后獲得的F2做細胞學檢查發現，在F2中出現了2n=68～76、104～108 和2n=136 三種細胞類型，分別對應了n+n、2n+n 和2n+2n 三種染色體遺傳方式[44]。LEKSHMI 等[45-46]發現斑茅×割手密的后代‘CYM04-420’中，親本的染色體以n+n 的方式存在。斑茅‘GXA87-36’（2n=60）×割手密‘GXS79-9’（2n=64）雜交后代的染色體數目為2n=62，親本雜交的染色體遺傳方式為n+n[47]。黃玉新等[48]對甘蔗‘GT05-164’×斑割復合體‘GXAS’F1的5 個后代（BC1）及‘GT42’בGXAS’BC1的7 個后代（BC2）進行染色體觀察，結果表明甘蔗和斑割復合體的BC1和BC2代中染色體以n+n的方式傳遞；割手密與斑茅的BC2和BC3中，親本染色體亦是以n+n的方式傳遞[49]。

甘蔗屬種間雜交過程中，D′HONT 等[50]發現甘蔗與割手密的雜交F1中，染色體的遺傳方式為n+n。YU等[51]利用GISH 研究了6個甘蔗與割手密雜交F1的染色體組成，發現二者的雜交后代中出現了2n+n和n+n兩種染色體遺傳方式，以2n+n為主（5個），和‘崖城-409’有著相同親本的‘崖城408’中染色體遺傳方式為n+n。然而，ROACH[52]在報道中指出，n+n 傳遞發生在甘蔗與2n=80 割手密（做母本）的雜交中，而當割手密染色體數2n=64或2n=96的時候，這種遺傳方式很少出現。PIPERIDIS等[53]證明了2n+n的遺傳方式還會出現在熱帶種與割手密的雜交F1和BC1中。在甘蔗高貴化育種中，2n+n的染色體傳遞方式有利于高糖基因的富集，因此選擇此雜交后代將極大地提高甘蔗育種效率[7]。

3 總結與展望

割手密在甘蔗育種中應用培育了大量優良的甘蔗品種和親本材料，有力地支撐了甘蔗產業的發展。然而，長期的栽培種間雜交育種導致甘蔗遺傳背景狹窄，甘蔗育種進程緩慢。作為甘蔗的祖親種之一，割手密血緣的引入曾極大地提高了甘蔗品種的抗逆性和宿根性。為加快對甘蔗屬野生種質資源的利用，提高育種效率，育種家們將越來越多的目光投向了割手密的研究和利用。然而，盡管現有野生割手密類型多樣、分布廣，但都是時空分布、長期自然選擇的結果。所以筆者認為，目前割手密資源的利用存在以下兩個問題：一是豐富的割手密資源利用率不足；二是距離甘蔗第一次飛躍式發展已過去百年，但相較于割手密自然選擇的進程而言，短短百年時間里，割手密基因變異的有無和程度難以定論。

經典細胞遺傳學核心技術為物種的起源、系統分類以及植物遺傳改良等提供了基礎的細胞學信息，且隨著分子遺傳學理論和技術快速發展與不斷滲透，植物細胞遺傳學迅速發展并被成功用于遺傳改良、基因組解析和比較基因組、物種起源進化、染色體生物學等領域。研究表明，染色體數目的增減若引起了基因數量的增減，將引起性狀表達和形態學上的差異[42]，而染色體結構的改變是甘蔗屬無性系遺傳變異的主要來源，其中一些變化可能對形態分化產生影響[19]。將細胞學和分子細胞遺傳學技術用于割手密研究，可以判定割手密形態學分類的準確性，了解割手密的進化程度及途徑，分析染色體數目和結構變異的規律與機制，對于割手密資源優良性狀的挖掘和轉化、割手密群體的改良、甘蔗親本的創制意義重大。