馬齒莧炭炮制工藝優化及其對痔瘡模型大鼠癥狀的改善作用

王炳然 陳晶 李昕曈 蔣常鵬 張淼 馬啟風 高紅梅

中圖分類號 R283.3;R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）05-0592-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.14

摘 要 目的 優化馬齒莧炭的炮制工藝，并探討其對痔瘡模型大鼠的改善作用。方法 采用Box-Behnken設計-響應面法，以鞣質含量、水溶性浸出物含量以及外觀性狀的綜合評分為指標，考察炒制溫度、投藥量、炒制時間對馬齒莧炭炮制工藝的影響，優選出最優工藝參數，并進行驗證。以最優炮制工藝制得的馬齒莧炭（0.8 g/mL）外敷痔瘡模型大鼠，每天給藥1次，連續11 d;末次給藥后，對大鼠肛周病理情況進行評分，并檢測其血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、IL-1β的水平。結果 馬齒莧炭最優炮制工藝為炒制溫度200 ℃、投藥量150 g、炒制時間14 min。最優炮制工藝的驗證實驗結果顯示，馬齒莧炭的綜合評分為92.57，與預測值（96.56）的相對誤差為-4.13%。經最優炮制工藝制得的馬齒莧炭以0.8 g/mL的糊狀外敷，可明顯促進痔瘡模型大鼠創面愈合，顯著減少滲出液量，顯著降低血清中TNF-α、IL-6、IL-β水平。結論 優化后的馬齒莧炭炮制工藝具有可行性;經最優炮制工藝制得的馬齒莧炭對痔瘡模型大鼠癥狀具有良好的改善作用。

關鍵詞 馬齒莧炭;炮制工藝;工藝優化;痔瘡;大鼠

Optimization of processing technology of Portulaca oleracea charcoal and its improvement effect on the symptom of hemorrhoid model rats

WANG Bingran，CHEN Jing，LI Xintong，JIANG Changpeng，ZHANG Miao，MA Qifeng，GAO Hongmei（School of Pharmacy， Changchun University of Chinese Medicine， Changchun 130117， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To optimize the processing technology of Portulaca oleracea charcoal， and to investigate its improvement effect on the symptom of hemorrhoid model rats. METHODS The effects of roasting temperature， dosage and roasting time on the processing technology of P. oleracea charcoal were investigated with Box-Behnken response surface methodology using comprehensive score of tannin content， water-soluble extract content and appearance properties as the index. The optimal process parameters are selected and verified. The hemorrhoid model rats were treated with P. oleracea charcoal （0.8? ? g/mL） prepared by the optimal processing technology， once a day， for 11 days. After last medication， the perianal pathological score of hemorrhoid model rats were performed; serum levels of tumor necrosis factor α （TNF-α）， interleukin 6 （IL-6） and IL-1β were detected. RESULTS The optimal processing technology of P. oleracea charcoal included roasting temperature of 200 ℃， dosage of 150 g and roasting time of 14 min. Results of validation test showed that the comprehensive score of P. oleracea charcoal was 92.57， and relative error of it with predicted value （96.59） was -4.13%. External use of? P. oleracea charcoal 0.8 g/mL prepared by the optimal processing technology could significantly promote the wound healing of hemorrhoid model rats， reduced the amount of exudate， and decreased the levels of TNF-α，IL-6 and IL-β in serum. CONCLUSIONS The optimized processing technology of P. oleracea charcoal is feasible. P. oleracea charcoal prepared by the optimized processing technology has good curative effect on the symptom of hemorrhoid model rats.

KEYWORDS? ?Portulaca oleracea charcoal; processing technology; technology optimization; hemorrhoid; rat

馬齒莧是馬齒莧科植物馬齒莧Portulaca oleracea L.的干燥地上部分，其性寒，味酸，具有清熱利濕、解毒、止血的功效[1]。中醫認為臟腑功能失調、風燥濕熱下迫、氣血瘀滯不行、結而不散、筋脈橫解而生痔[2]，常使用馬齒莧外敷治療痔瘡所導致的出血、紅腫、潰瘍等[3]。制炭作為傳統炮制工藝，既可在一定程度上保留生藥功效，又可增強藥物的收斂、止血作用[4]。馬齒莧經武火炒炭后可增強其收斂利濕的作用，促進創面愈合形成焦痂，減少潰瘍液滲出，且止血效果優于生品[5]。

馬齒莧質地疏松，其炒炭過程大多根據人工經驗進行控制，具體工藝參數不夠明確，無客觀、量化的標準，從而導致馬齒莧炭的質量差異較大，甚至部分容易出現灰化，不利于馬齒莧炭的后續研究及標準化生產。相關研究發現，馬齒莧中的鞣質成分不僅具有止血效果，還具有抗炎、抗過敏的作用，是治療痔瘡和潰瘍的有效成分[6]。同時，馬齒莧及其炭品在《中國藥典》中暫未規定含量測定項，故水溶性浸出物含量可在一定程度上作為衡量其質量的指標。2020年版《中國藥典》（四部）中0213炮制通則規定，制炭應“存性”，即外觀及性狀是控制炭藥質量規范化的重要因素[1]。

Box-Behnken設計-響應面法是一種綜合設計試驗和數學建模的優化方法，通過建立直觀的數學模型來表達因素與響應值的聯系，可精準地預測最優工藝，更好地體現各因素、指標與效應值之間的關聯[7]?；诖?，筆者采用Box-Behnken設計-響應面法，以鞣質含量、水溶性浸出物含量以及外觀性狀的綜合評分為指標，優化馬齒莧炭的炮制工藝，并研究最優炮制工藝制得的馬齒莧炭對痔瘡模型大鼠癥狀的改善作用，以期規范馬齒莧炭的炮制工藝，為治療痔瘡的新藥開發提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有MS-5型炒貨機型炒藥機、101-3BS型電熱鼓風干燥機（常州市金壇邁斯機械有限公司），DE-100型高速萬能高速粉碎機（浙江紅景天工貿有限公司），UV-2550型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司），KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BT25S型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），C22-C503型電陶爐（浙江蘇泊爾股份有限公司），M200PRO型酶標儀[帝肯（上海）貿易有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號Y19M8C36143，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司;磷鉬鎢酸試劑（批號202104031）購自成都艾科達化學試劑有限公司;馬應龍痔瘡膏（批號210216）購自馬應龍藥業集團股份有限公司;大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為202109、202109、202106）均購自上海優選生物科技有限公司;馬齒莧飲片（批號170112）購自哈爾濱祺功堂中藥飲片有限公司，經長春中醫藥大學藥學院蔡廣之教授鑒定為馬齒莧科植物馬齒莧P. oleracea L.干燥地上部分。

1.3 動物

本研究所用SPF級SD大鼠共40只，雌雄各半，體質量180～200 g，購自蘇州西山生物科技有限公司，動物生產許可證號為SCXK（遼）2020-0001。

2 方法與結果

2.1 馬齒莧炭樣品的制備

參照2020年版《中國藥典》（四部）中0213炮制通則項下的炒炭法[1]，取馬齒莧適量，投入已經預熱30 min的炒藥機中，炒至表面焦黑色、內部焦褐色時，取出，晾涼。

2.2 鞣質的含量測定

參考2020年版《中國藥典》（四部）2202鞣質含量測定法[1]進行測定。

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品2.5 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加水定容，搖勻，即得質量濃度為0.05 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取過四號篩的馬齒莧炭粉10 g，精密稱定，置于250 mL棕色量瓶中，加水定容，密塞;避光靜置8 h后，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取15 min，放冷后補足減失質量;濾過，取續濾液20 mL置于100 mL棕色量瓶中，加水定容，即得供試品溶液。

2.2.3 檢測波長的確定 分別精密量取“2.2.1”“2.2.2”項下對照品、供試品溶液各3 mL，分別置于25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸1 mL、水9 mL，再以29%碳酸鈉溶液定容，搖勻，靜置30 min。以相應試劑為空白，于400～800 nm波長范圍內進行紫外全波長掃描。結果顯示，對照品溶液和供試品溶液均在760 nm處有最大吸收，因此本研究選擇760 nm為檢測波長。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸1 mL，再分別加水11.5、11、10、9、8、7 mL，以29%碳酸鈉溶液定容，搖勻;靜置30 min后，于760 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸吸光度（Y）為縱坐標、質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=87.34X-0.052 4（r=0.999 1），表明沒食子酸在0.001～0.01 mg/mL檢測質量濃度范圍內線性關系良好。

2.2.5 含量測定 精密量取供試品溶液3 mL，置25 mL棕色量瓶中，按“2.2.4”項下“加入磷鉬鎢酸……于760 nm波長處測定吸光度”方法操作后，根據標準曲線計算供試品溶液中總多酚的含量（以沒食子酸計）。精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有0.6 g干酪素的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置于30 ℃水浴條件下保溫1 h;取出振搖混勻，放冷，濾過，精密量取續濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按“2.2.4”項下“加入磷鉬鎢酸……于760 nm波長處測定吸光度”方法操作后，根據標準曲線計算供試品溶液中不被吸附的多酚含量（以沒食子酸計）。根據公式計算鞣質含量（鞣質含量=總多酚含量-不被吸附的多酚含量），同時進行空白校正。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取供試品溶液3.0 mL，按“2.2.5”項下總多酚的含量測定方法測定供試品的吸光度，連續測定6次。結果顯示，吸光度的RSD為0.14%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批馬齒莧炭粉末6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法操作，平行制備供試品溶液6份，按“2.2.5”項下方法測定鞣質含量。結果顯示，鞣質的平均含量為0.054 5%，RSD為0.72%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.2.8 穩定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液3 mL，于室溫放置10、20、30、40、50、60 min后，按“2.2.5”項下總多酚的含量測定方法測定供試品的吸光度。結果顯示，總多酚含量的RSD為1.03%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置60 min內穩定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知鞣質含量的馬齒莧炭樣品粉末6份，分別精密加入沒食子酸對照品2.75 mg，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項下方法測定鞣質的含量，結果見表1。

2.3 水溶性浸出物的含量測定

根據2020年版《中國藥典》（四部）浸出物測定法項下熱浸法（通則2201）[1]測定馬齒莧炭水溶性浸出物含量。

2.4 馬齒莧炒炭條件的篩選

“炒炭存性”指藥材在制炭時只可部分炭化，未炭化部分仍應保留其固有氣味[8]?；诖?，筆者參考文獻[9]方法，對馬齒莧炭的外觀性狀進行評分（評分標準見表2），以初步篩選馬齒莧炒炭條件（炒制溫度、炒制時間、投藥量）。

2.4.1 炒制溫度的考察 取馬齒莧飲片約200 g，共5份，投入已經預熱30 min的炒藥機中，分別于180、190、200、210、220 ℃條件下炒制15 min，取出，晾涼，再進行外觀評分。結果顯示，當炒制溫度為200 ℃時，馬齒莧炭的外觀性狀最優，評分為9分。

2.4.2 投藥量的考察 取馬齒莧飲片約100、200、300、400、500 g，分別投入已經預熱30 min的炒藥機中，于200 ℃條件下炒制15 min，取出，晾涼，再進行外觀評分。結果顯示，當投藥量為200 g時，馬齒莧炭的外觀性狀最優，評分為9分。

2.4.3 炒制時間的考察 取馬齒莧飲片約200 g，共5份，投入已經預熱30 min的炒藥機中，分別于200 ℃條件下炒制5、10、15、20、25 min，取出，晾涼，再進行外觀評分。結果顯示，當炒制時間為15 min時，馬齒莧炭的外觀性狀最優，評分為9分。

2.5 Box-Behnken設計-響應面法優化馬齒莧炭的炮制工藝

2.5.1 Box-Behnken設計-響應面法實驗與結果 基于“2.4”項下炒炭條件篩選結果，為更全面地評價馬齒莧炭的質量，筆者以鞣質含量、外觀性狀以及水溶性浸出物含量的綜合評分（參考文獻[10-11]方法，設置上述3個指標的權重分別為40%、40%、20%，然后計算綜合評分，綜合評分=鞣質含量/鞣質含量最大值×40+外觀性狀評分/外觀性狀評分最大值×40+水溶性浸出物含量/水溶性浸出物含量最大值×20）為指標，采用Box-Behnken設計-響應面法綜合評價炒制溫度（A）、投藥量（B）、炒制時間（C）對馬齒莧炭炮制工藝的影響。Box-Behnken設計-響應面法的因素與水平見表3，實驗設計與結果見表4，方差分析結果見表5。

2.5.2 模型分析 通過Design-Expert V8.0.6軟件對各因素回歸擬合后建立多元二次響應面回歸模型，得到多元回歸方程為Z=91.18-10.82A-16.11B-13.02C-19.12AB-15.04AC-9.01BC-17.77A2-15.24B2-17.50C2。根據回歸分析結果作響應面圖和等高線圖（圖1）。根據表5可知，模型組P<0.000 1（具有顯著性），失擬項P=0.086 1（無顯著性），表明該模型具有較好的擬合度和可信度，可精準預測馬齒莧炭的炮制工藝;一次項A、B、C為顯著項，表明各因素對馬齒莧炭的綜合評分均影響顯著;交互項AB、AC、BC為顯著項，表明這3種因素交互作用顯著。相關研究表明，二維等高線圖中心點為橢圓形時，表示兩因素交互作用明顯;三維曲面傾斜程度越強、顏色越深，表明兩因素的綜合影響越大[12]。由圖1可知，A、B、C的三維曲面傾斜程度均強且相似，二維等高線圖中心點均為橢圓，表明3種因素對綜合評分均具有顯著影響且交互作用顯著，這與表5結果一致。

2.6 馬齒莧炭最優炮制工藝的確定及驗證

根據上述方法得出馬齒莧炭最優炮制工藝為炒制溫度200.80 ℃、投藥量150.38 g、炒制時間13.61 min，在此條件下綜合評分理論值為96.56。結合實際操作，擬定最優炮制工藝為炒制溫度200 ℃、投藥量150 g、炒制時間14 min。

分別取馬齒莧飲片3份，每份150 g，投入已經預熱30 min的炒藥機中，于200 ℃條件下炒制14 min，取出，晾涼，計算綜合評分。結果顯示，馬齒莧炭的綜合評分分別為93.44、92.12、92.15，平均分數為92.57，與預測值的相對誤差為-4.13%，表明此工藝具有可行性。

3 馬齒莧炭對痔瘡模型大鼠的影響考察

3.1 馬齒莧炭糊的制備

取150 g馬齒莧于200 ℃條件下炒制14 min，粉碎，過篩，加蒸餾水攪拌成糊狀，制備成質量濃度為0.8 g/mL的馬齒莧炭糊。

3.2 造模、分組及給藥

取SD大鼠40只，適應性飼養3 d后，隨機取10只作為空白組;其余大鼠以生理鹽水清洗肛周，將浸有99.0%醋酸溶液的濾紙片（直徑為6 mm）放至大鼠肛門，并于0.5、1 min時更換1次濾紙片，24 h后大鼠肛周出現白色潰瘍面、腫脹并有滲出性炎癥則表明造模成功[13]。將造模成功的大鼠分為模型組、馬齒莧炭組、陽性對照組，模型組和空白組肛周外涂生理鹽水，馬齒莧炭組在肛周外涂馬齒莧炭糊（1 g/cm2）[14]，陽性對照組在肛周外涂等量馬應龍痔瘡膏;大鼠給藥后單籠飼養，每天給藥1次，連續11 d。

3.3 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;等級資料采用Ridit檢驗。檢驗水準α=0.05。

3.4 大鼠肛周的病理評分

末次給藥1 h后，清洗各組大鼠肛周，并進行肛周病理評分（具體評分標準：較多滲出液Ⅰ分，微量滲出液Ⅱ分，無滲出液Ⅲ分，形成焦痂Ⅳ分，基本愈合Ⅴ分，完全愈合Ⅵ分）[15]。結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠肛周仍有明顯白色潰瘍面及大量滲出液（P<0.01）;與模型組相比，馬齒莧炭組和陽性對照組大鼠肛周的滲出液量顯著減少，創面愈合較好（P<0.01）。結果見表6、圖2。

3.5 大鼠血清中炎癥因子水平的檢測

末次給藥6 h后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心取上清液，并嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-β水平。結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-β水平顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，馬齒莧炭組和陽性對照組大鼠血清中上述指標水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結果見表7。

4 討論

馬齒莧質地疏松，對炮制條件的要求極為苛刻，其中炮制溫度、炮制時間以及投藥量均對其影響較大，特別是投藥量過多時，可使熱量積聚從而導致馬齒莧灰化，因此在實際炮制過程中可考慮采用扣鍋煅法，以防止空氣進入導致的灰化。

本實驗運用Box-Behnken設計-響應面法，確定馬齒莧炭最優炮制工藝條件為炒制溫度200 ℃、投藥量150 g、炒制時間14 min，經實驗驗證后也表明優化后的炮制工藝具有可行性，適用于馬齒莧炭的制備。

外敷法是中醫治療痔瘡的傳統手段之一，使藥物與肛周患處直接作用，從而調節陰陽、扶正祛邪，達到消除癥狀的效果[16]。由于肛周局部面積受限，外用藥物的量效關系并不明顯，一般認為將藥物充分均勻地覆蓋患處即可;另外，由于皮膚對藥物的吸收有限，給藥量的提高僅僅增加了藥物厚度，并不會加強藥物對患處的作用[17]。中藥固體粉末一般加以賦形劑，或采用膠布等工具固定，以確保外敷藥物與患處緊密接觸進而充分發揮療效。痔瘡發病位置特殊，既為患處又為排泄處，長時間用工具固定，會導致排便不暢、肛周破損，加重病情。筆者前期實驗發現，將馬齒莧炭制成質量濃度小于0.6 g/mL的糊狀時，易呈流體狀，難以附著;制成質量濃度大于1.0 g/mL的糊狀時，易呈固體狀，給藥后易脫落?；诖?，為保證馬齒莧炭緊密接觸患處，筆者選用質量濃度為0.8 g/mL的馬齒莧炭糊涂抹于大鼠肛周。進一步進行肛周病理觀察發現，經馬齒莧炭干預后，大鼠肛周的滲出液量顯著減少，創面愈合較好，且血清中TNF-α、IL-6、IL-β水平均顯著降低，這提示經最優工藝炮制出的馬齒莧炭以0.8 g/mL的糊狀外敷，對痔瘡模型大鼠癥狀具有良好的改善作用。

綜上所述，本研究優化了馬齒莧炭的炮制工藝，經最優炮制工藝制得的馬齒莧炭對痔瘡模型大鼠癥狀具有良好的改善作用。

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（收稿日期：2021-09-03 修回日期：2022-01-14）

（編輯：唐曉蓮）

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