牙本質基質蛋白1 糖基化形式在頜骨損傷中的作用

劉 洋 ,李劍奎 ,沙偉君 ,崔立然 ,王 輝 ,徐 浩 ,張懷勝,宋 波,薛 徽?

(1.齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院,黑龍江 齊齊哈爾 161041;2.齊齊哈爾醫學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

頜骨損傷是口腔頜面外科與創傷外科的常見病與多發病,常因直接暴力,間接暴力,腫瘤,炎癥及醫源性損傷等引起[1]。頜骨損傷后主要表現為開口受限,咬合關系錯亂,面部腫脹等臨床特征,因其特殊解剖位置及功能特點,頜骨缺損修復過程近年來備受關注[2-3],如何快速、安全、有效治療口腔頜面部損傷,促進缺損區新骨形成已成為目前亟待解決的科學問題。骨損傷發生后,骨組織內血管斷裂,血小板、纖維蛋白及大量紅細胞自血管內釋放,在損傷區激活凝血系統進而形成血腫[4],與此同時,中性粒細胞,巨噬細胞及淋巴細胞等炎癥細胞迅速募集至骨損傷區,吞噬組織碎片及病原體,釋放大量的趨化因子及炎癥因子[5-6]。來自骨膜及骨髓腔內的間充質干細胞在多種炎癥因子的刺激下,迅速聚集至骨損傷區并向成骨細胞、成軟骨細胞及成纖維細胞分化,進而形成骨痂,最終骨痂在成骨細胞及破骨細胞的共同作用下被板層狀骨取代,骨損傷修復完成[7]。

骨痂在骨組織損傷修復過程中具有維持組織形態、調控損傷區初期穩定性及提供基質礦化空間等重要作用。蛋白聚糖是構成骨痂的重要組成部分之一,能夠有效維持骨痂機械強度,并為損傷組織提供保護性屏障。DMP1-PG 是一類新發現的蛋白聚糖,通過對骨損傷樣本進行高通量測序,我們發現其與骨損傷修復關系密切。DMP1 是在牙本質cDNA 克隆過程中發現的一類酸性細胞外基質蛋白,DMP1-PG 是其糖基化形式[8]。DMP1-PG 在軟骨基質及骨基質中呈高表達,DMP1-PG 缺失后,四肢長骨發育呈現老齡化骨病特征,此外頜骨及顱骨發育異常,表現為顳下頜關節過度磨損及顱骨顱縫早閉特征。然而DMP1-PG 在頜面部骨組織中的損傷修復作用暫無相關研究及報道。

前期研究過程中,通過構建頜骨骨缺損模型,我們發現DMP1-PG 在野生型小鼠頜骨缺損修復組織中大量表達,為進一步探討DMP1-PG 在頜骨缺損修復中的作用,我們構建DMP1-PG 點突變(S89G-DMP1)小鼠,通過對比二者在頜骨創傷修復中的差異,探究DMP1-PG 對小鼠頜骨損傷修復的影響及相關作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗組S89G-DMP1 小鼠,SPF 級,雄性,8 周齡30 只,體重24～26 g,由上海同濟大學口腔醫學院孫瑤教授課題組設計,遼寧長生生物技術股份有限公司[SCXK(遼)2020-001]培育,對照組WT 小鼠為C57BL/6J 品系,SPF 級,雄性,8 周齡30 只,體重24～26 g,購于遼寧長生生物技術股份有限公司[SCXK(遼)2020-001],在齊齊哈爾醫學院實驗動物中心屏障環境[SYXK(黑)2021-013]飼養,上述實驗動物飼養給與12 h 無光/12 h 人工光照飼養環境,飼養溫度22℃～25℃,自由進食與飲水。所有動物相關實驗方案均經齊齊哈爾醫學院倫理委員會批準(QMU-AECC-2021-56)。所有實驗設計及操作均符合動物實驗學“3R”原則。

1.2 主要試劑與儀器

HE 染液(上海生工生物工程有限公司,批號E607318);甲苯胺藍染液(上海生工生物工程有限公司,批號A600962);TRIzol 試劑盒(Invitrogen 公司,批號15596018);anti-DMP1-C 及anti-DMP1-N(愛瑪特醫藥科技上海有限公司);anti-ALP(Abcam公司,批號ab224355);anti-RUNX2(Abcam 公司,批號ab76956);反轉錄試劑盒(TaKaRa 公司,批號PR036A)。

實時熒光定量PCR 儀(Lightcycler 96);Bio-Rad PCR 儀(C1000 Touch);石蠟切片機(Thermo,HM325);倒置熒光顯微鏡(尼康,TS2R);顯微計算機斷層micro-CT 機(SCANCO,Switzerland)。

1.3 實驗方法

1.3.1 S89G-DMP1 小鼠的構建

根據野生型小鼠(C57BL/6J)全基因組序列,構建所有DMP1 蛋白糖基化位點外顯子上、下游6.6 kb 及8.2 kb 基因序列同源重組臂,在DMP1 第6 外顯子下游179 bp 敲入Neo 陽性序列,質粒構建完成后,通過電轉技術,將質粒轉入小鼠胚胎干細胞,后將3 個陽性克隆移植入Balb/c 假孕小鼠子宮內。已獲得5 個嵌合體的雄性小鼠與野生型小鼠(C57BL/6J)雜交,獲取F1 代小鼠。通過雜交獲得的雄性小鼠與 B6.129S4-Gt (ROSA) 26-Sortm1(FLP1)Dym/Rain J 雌性小鼠雜交,確定移除Neo 序列,通過基因型鑒定確定Neo 移除序列的子代小鼠。經鑒定獲得的S89G-DMP1 小鼠在實驗使用時均須經過基因型鑒定。

1.3.2 下頜骨缺損模型構建

根據相關文獻[9]建立下頜骨骨缺損模型。選用8 周齡雄性WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠,作為實驗對象。腹腔注射戊巴比妥鈉(劑量:50 mg/kg,濃度:0.3%),麻醉顯效后,將右側下頜骨表面皮膚備皮并充分消毒,切開下頜表面皮膚,鈍性分離咬肌,暴露下頜骨,使用牙科渦輪機在下頜骨體部構建直徑1.2 mm 的缺損洞形,該缺損洞形需穿通下頜骨。洞形制備完成后生理鹽水局部沖洗,分層縫合咬肌與表面皮膚。術中需注意保護下頜骨骨膜,避免因人為手術因素造成二組之間的差異。術后3 d 內腹腔注射鎮痛藥及抗生素。

1.3.3 Micro-CT 掃描

頜骨損傷模型構建完成后14 d 及28 d 收取樣本,選擇合適管徑的掃描管,掃描精度選取10 μm,掃描功率14 W,掃描電流200 μA,掃描電壓70 kV。

1.3.4 樣本脫鈣,包埋,HE,甲苯胺藍染色及免疫熒光染色

頜骨損傷模型構建后7 d、14 d 及28 d 收取組織樣本,將下頜骨置于4℃濃度為4%的多聚甲醛溶液中24 h 后,放入10%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣14 d。樣本脫鈣完成后置入自動樣本脫水儀脫水、浸蠟,組織包埋機包埋后切片,切片厚度為4 μm。根據HE 及甲苯胺藍試劑盒要求進行相應染色,中性樹膠封片,顯微鏡拍照。

石蠟切片水化后,透明質酸抗原修復,山羊血清封閉處理。將組織切片與以下一抗:anti-ALP(1 ∶500),anti-RUNX2(1 ∶500),anti-DMP1-N(1 ∶500),anti-DMP1-C(1 ∶500)進行共同孵育并4℃過夜,PBS 溶液洗滌三次后與熒光二抗Alexa Fluor 546 IgG(1 ∶1000)室溫孵育1 h,使用DAPI 進行細胞核復染,熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5 RT-qPCR 檢測

下頜骨缺損模型構建完成后7 d 及14 d 收取樣本,將樣本放入含1 mL TRIzol(Invitrogen)溶液的EP 管中,根據試劑盒要求提取損傷樣本RNA,紫外光分光光度儀測量RNA 濃度,使用TaKaRa 逆轉錄試劑盒20 μL 體系將RNA 逆轉錄為cDNA。根據RT-qPCR 試劑盒使用說明書配置10 μL 擴增體系,分析靶基因mRNA 表達水平,引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3.6 細胞培養與ALP 染色

選取8 周齡WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠,提取下頜骨骨髓間充質干細胞(mandible bone marrow stromal cells,mBMSCs)。充分麻醉誘導后,將小鼠下頜骨分離,剪碎,反復沖洗,1200 r/min 分離心5 min 后,將上清液及碎骨片吸出,用含有α-MEM,10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素的普通培養基再次離心重懸,置于培養皿中培養,當細胞密度達到80%以上時進行傳代。P3 代后,將細胞置于含有β-甘油磷酸鈉的成骨誘導培養基中成骨誘導21 d,根據ALP 試劑盒使用說明對其進行ALP 染色,顯微鏡拍照。

1.4 統計學方法

所有實驗樣本應用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統計學分析并繪制條形圖,計量資料通過平均數±標準誤差(ˉx)表示,使用t檢驗進行兩組間數據比較分析,P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 DMP1-PG 在下頜骨損傷區的表達

DMP1-PG 為DMP1 糖基化形式,即DMP1-N 端通過共價鍵與糖胺聚糖鏈連接,通過對組織樣本進行DMP1-N 抗體免疫熒光染色,可觀察DMP1-PG在組織中的表達。首先構建WT 小鼠下頜骨骨缺損模型,在術后14 d 收取樣本,通過對骨缺損樣本進行免疫熒光染色,研究發現DMP1-PG 在缺損組織內及缺損周圍骨組織間大量表達。骨缺損后14 d,提取缺損組織范圍內RNA,結果顯示同未損傷區下頜骨相比,Dmp1 基因表達顯著上調,上述結果表明DMP1-PG 可能在頜骨缺損修復過程中發揮重要的作用,見圖1。

圖1 DMP1-PG 在下頜骨損傷區大量表達Figure 1 DMP1-PG is abundantly expressed in the mandibular injury area

2.2 S89G-DMP1 小鼠基因型鑒定

S89G-DMP1 小鼠構建完成后進行基因型鑒定,組織樣本凝膠電泳結果顯示DMP1-Neo 為260 bp條帶,DMP1-WT 為250 bp 條帶,WT 小鼠顯示為DMP1-WT 250 bp 單條帶,S89G-DMP1 小鼠純合子顯示為DMP1-Neo 260 bp 單條帶,S89G-DMP1 小鼠雜合子顯示為260 bp 與250 bp 雙條帶。根據實驗結果,6 號小鼠為S89G-DMP1 陽性對照,1～5 號小鼠為S89G-DMP1 純合子,見圖2。

圖2 S89G-DMP1 小鼠基因型鑒定Figure 2 Genotypic identification of S89G-DMP1 mice

2.3 DMP1-PG 缺失抑制下頜骨損傷修復

為進一步探究DMP1-PG 在頜骨損傷中的作用,課題組同時構建WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠頜骨缺損模型,在術后7 d、14 d 及28 d 收取樣本,進行組織學染色。結果顯示,頜骨缺損后7 d,WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠骨缺損區域內均未見明顯骨組織生成,損傷區內可見大量纖維樣結構。術后14 d,WT 小鼠頜骨缺損區內可見部分點、片狀骨小梁生成,相較于WT 小鼠,S89G-DMP1 小鼠損傷區骨組織生成能力明顯減弱,損傷區僅可見極少數量的新生骨小梁,新生骨組織細小、散在的分布于頜骨缺損區;頜骨缺損后28 d,WT 小鼠頜骨缺損區內可見大量新生骨組織,主要為骨小梁樣結構,新生骨組織已完整覆蓋缺損區,與周圍組織無明顯界限,骨小梁結構成熟,HE 染色顯示新生骨小梁無明顯淡染,與正常下頜骨組織染色無明顯差異。同WT小鼠相比,S89G-DMP1 小鼠在頜骨損傷后28 d 尚不能完成有效損傷修復,缺損區內新生骨小梁數量較術后14 d 略增加,但仍明顯少于WT 小鼠,骨小梁不能完整覆蓋缺損組織,新生骨組織主要表現為類骨質樣結構,HE 染色表現為明顯的淡染狀態。術后14 d 及28 d 收取樣本,進行Micro-CT 掃描,結果顯示,WT 小鼠頜骨缺損區內新生骨組織量顯著高于S89G-DMP1 小鼠,見圖3。

圖3 WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠下頜骨缺損組織學及影像學差異Figure 3 Histological and iconography differences of mandibular defects in WT mice and S89G-DMP1 mice

2.4 DMP1-PG 缺失抑制成骨蛋白表達

通過使用免疫熒光染色技術,觀察DMP1-PG缺失后對小鼠頜骨缺損區成骨相關蛋白表達的影響。結果顯示,下頜骨損傷后14 d,成骨相關蛋白DMP1-C,ALP 及RUNX2 在WT 小鼠頜骨缺損區表達量較高,表現為染色較深的紅染區,主要分布于新生骨小梁周圍區域。在S89G-DMP1 小鼠頜骨損傷區,上述蛋白表達量明顯減低,尤其在ALP蛋白表達方面,S89G-DMP1 小鼠僅呈現極個別散在點樣紅染。上述結果進一步證實DMP1-PG 缺失后,成骨相關蛋白在骨損傷區生成明顯減弱,見圖4。

圖4 成骨相關蛋白在下頜骨缺損區免疫熒光染色Figure 4 Immunofluorescence staining of osteogenesis-related proteins in the mandibular defect area

2.5 DMP1-PG 缺失抑制小鼠成骨相關因子表達

為進一步探究DMP1-PG 影響頜骨損傷修復的相關機制,應用RT-qPCR 技術對比觀察頜骨損傷后7 d 及14 d 成骨相關基因及蛋白聚糖生成相關基因表達變化情況。結果顯示術后7 d,WT 小鼠與蛋白聚糖生成相關基因(Acan、Bgn、Dcn及Vcan)及骨生成相關基因(Alp、Ocn、Opn及Runx2) 顯著高于S89G-DMP1 小鼠,P<0.05,差異具有統計學意義。術后14 d,Dcn、Alp、Ocn及Opn在WT 小鼠缺損骨組織內表達量高于S89G-DMP1 小鼠,P<0.05,差異具有統計學意義,見圖5。

圖5 WT 小鼠及S89G-DMP1 小鼠下頜骨缺損后相關基因表達變化Figure 5 Changes in the expression levels of related genes after mandibular defect in WT mice and S89G-DMP1 mice

2.6 DMP1-PG 缺失抑制骨髓間充質干細胞分化

骨髓間充質干細胞在骨損傷修復過程中發揮重要的作用,通過提取下頜骨來源的BMSCs,觀察DMP1-PG 缺失后對其成骨分化能力的影響。ALP染色顯示DMP1-PG 缺失后BMSCs 成骨活性降低。此外,來源于S89G-DMP1 小鼠mBMSCs 培養聚集物的成骨及蛋白聚糖相關的mRNA 表達水平較WT小鼠表達明顯降低。S89G-DMP1 小鼠 BMSCs 異常的成骨能力進一步證實了DMP1-PG 在調節頜骨缺損愈合中的重要作用,見圖6。

圖6 DMP1-PG 缺失后骨髓間充質干細胞成骨能力下降Figure 6 Decreased osteogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells after DMP1-PG deletion

3 討論

因多種原因導致的頜骨缺損,不僅對患者的語言、咀嚼及吞咽等功能造成影響,同時也給患者造成極大的心理及社會適應障礙。頜骨缺損發生后,血腫即刻形成同時伴有炎癥細胞浸潤,體內間充質干細胞向成纖維細胞、成軟骨細胞及成骨細胞分化,形成軟骨及硬骨骨痂,最終完成骨組織再生過程[10]。在這一過程中,骨組織細胞外基質成分發揮重要的作用,包括在愈合過程中提供支撐結構,調控成骨細胞行為及功能等[11]。蛋白聚糖是細胞外基質的重要組成部分之一,盡管其在細胞外基質中含量較低,但其參與多種細胞組織活動,包括維持骨礦化基質強度,充填組織細胞間隙,粘附生長因子,調控基質礦化及骨損傷修復[12-14]。

DMP1 是最初在牙本質中被發現的酸性蛋白,在隨后的相關研究中,人們發現其不僅在牙本質中表達,在其他組織包括皮膚、肌肉、乳腺、腦組織及骨組織[15]中均有表達,尤其在骨組織中呈高表達,表達量明顯高于牙本質。DMP1 在體內以四種形式存在:DMP1 全長片段及水解后產物DMP1-C 端,DMP1-N 端,DMP1-N 端尚可以通過共價鍵與糖胺聚糖鏈連接,形成DMP1 糖基化形式,即DMP1-PG。作為一類新發現的蛋白聚糖,DMP1-PG 在肌肉組織[16]、骨組織礦化前沿及軟骨基質中大量表達[17]。相關研究表明,DMP1-PG 缺失可導致小鼠骨脆性增加,骨組織過度衰老。

在前期研究中,我們發現DMP1-PG 在頜骨骨缺損修復組織內及周圍大量表達,Dmp1 基因表達水平在損傷修復過程中顯著上調,上述結果表明DMP1-PG 參與頜骨損傷修復過程。為進一步探究DMP1-PG 調控頜骨損傷修復的重要意義及機制,課題組構建WT 小鼠及DMP1-PG 點突變(S89GDMP1)小鼠下頜骨骨缺損模型,該缺損模型為穩定的頜骨膜內成骨模型。通過對二組小鼠頜骨損傷后7 d、14 d 及28 d 樣本進行組織切片、染色,研究發現,DMP1-PG 缺失后,小鼠成骨能力明顯減弱,WT 小鼠在建模后28 d,新生骨組織幾乎完全覆蓋缺損區,而S89G-DMP1 小鼠僅表現為部分骨組織修復,修復周期明顯延長。上述結果表明DMP1-PG在頜骨損傷修復過程中發揮重要的調控作用。利用RT-qPCR 技術,我們檢測頜骨損傷修復過程中成骨相關基因表達變化,結果顯示損傷后7 d 及14 d,S89G-DMP1 小鼠成骨相關基因表達均明顯低于對照組WT 小鼠,頜骨修復過程中,除成骨相關基因在DMP1-PG 缺失后發生變化,與蛋白聚糖生成相關基因同樣出現表達減低趨勢,這種趨勢在損傷修復早期表現更加明顯。上述結果表明,DMP1-PG 缺失后不僅影響骨組織生成,同樣參與調控其他類型與損傷修復密切相關的蛋白聚糖的合成。

相關研究表明,骨髓來源的間充質干細胞具有較強的修復骨組織缺損的能力[18-20]。間充質干細胞在骨損傷修復過程中可直接向成骨細胞分化,同時可調控組織修復過程中的免疫活動,促進血管生成及其他類型細胞向損傷區募集[21]。本次研究中,我們提取兩組小鼠下頜骨骨髓間充質干細胞并進行成骨誘導,ALP 染色可見S89G-DMP1 小鼠來源的間充質干細胞成骨能力顯著低于WT 小鼠,此外,成骨相關基因及蛋白聚糖合成相關基因表達同樣顯著低于對照組。上述結果表明,在細胞水平,DMP1-PG 可能參與調控干細胞分化能力,進而調控骨組織損傷修復過程。

綜上所述,DMP1-PG 作為一類新發現的蛋白聚糖,在頜骨組織損傷修復過程中發揮重要的正向調控作用,其機制可能與干細胞分化及蛋白聚糖合成有關,本研究為治療頜骨損傷修復提供新的研究方向及治療靶點。