萆薢分清顆粒對阿霉素腎病大鼠足細胞podocalyxin、α-actinin-4 的影響

馬雪莉,魏錦慧,馬鴻斌

(甘肅中醫藥大學附屬醫院,蘭州 730000)

腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是臨床常見的腎疾病之一,病理變化表現為腎小球基底膜通透性增高,電荷屏障受損,以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和不同程度的水腫為主要臨床表現。由于NS 與基因突變、免疫功能紊亂、細胞因子表達異常及足細胞受損等多種因素有關,其發病機制復雜且具體的細胞分子生物學免疫機制尚不明確,故目前臨床上針對NS 的一線用藥方案多以抑制免疫炎癥反應為主,即給予糖皮質激素、細胞毒性藥物及生物制劑等基礎用藥。然而,近年來的臨床實踐證實,免疫抑制劑在帶來療效的同時,尤其糖皮質激素亦會使部分患者產生激素依賴及激素抵抗等問題,加之激素的副作用,嚴重影響患者后期生活質量[1-2]。中醫以“整體調節、辨證施治”為方向,在慢性腎臟病的治療上發揮著獨特的診療優勢,故進一步探索中醫藥對本病的作用機制具有極為重要的臨床意義。

萆薢分清顆粒是導師馬鴻斌教授繼承劉寶厚教授腎病“濕熱不除,蛋白難消”的學術思想,結合現代醫學研究及自身臨床體會,在清代醫學大家程鐘齡所撰《醫學心悟》之古方程氏萆薢分清飲的基礎上加減化裁而來,方由丹參12 g、車前草30 g、茯苓15 g、關黃柏12 g、綿萆薢12 g、續斷12 g、槲寄生12 g、石菖蒲10 g、甘草10 g 組成。全方共奏健脾益腎、清熱利濕之效,使氣虛得復,瘀祛濕利,精微封藏。導師臨床運用此方治療腎虛濕熱之腎疾病均屢獲良效,臨床證實其能減少NS 患者尿蛋白的排泄率,為其常用之驗方。而其具體作用機制尚不明確。因此本研究擬通過觀察萆薢分清顆粒對阿霉素腎病大鼠足細胞相關蛋白podocalyxin、α-actinin-4表達的影響,探討其治療腎病綜合征蛋白尿的具體作用機制,為客觀評價此藥療效提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠60 只,SPF 級,6 周齡,體重(200±20)g,購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心[SCXK(甘)2020-0001],飼養于甘肅中醫藥大學實驗動物中心[SYXK(甘)2020-0009],光照明暗各12 h,每日予以新鮮水及飼料。經由甘肅中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(2021-234;2021-235),實驗操作遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

萆薢分清顆粒(綿萆薢12 g、續斷12 g、槲寄生12 g、茯苓15 g、關黃柏12 g、丹參12 g、車前草30 g、石菖蒲10 g、甘草10 g,以上均選用中藥配方顆粒劑):購于甘肅中醫藥大學附屬醫院制劑中心。醋酸潑尼松片(prednisone acetate,PRE),購自山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司,規格:每片5 mg,國藥準字:H20033023,生產批號: 210122;注射用鹽酸多柔比星(阿霉素Adriamycin,ADR):酷兒化學科技(北京) 有限公司,規格:每支25 mg,國藥準字RE294501,生產批號:HY613701。

α-actinin-4 抗 體(美 國Genetex 公 司,批 號402205);podocalyxin 抗體(美國Genetex 公司,批號822102958);β-actin 抗體(美國Immunoway 公司,批號 B2804);PVDF 膜(Millipore 公 司,批 號IRVH00010);ECL 發光液(上海翊圣生物科技有限公司,批號36208-A/B);蛋白電泳Marker(上海翊圣生物科技有限公司,批號26616);BCA 蛋白定量試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司,批號20210419);RIPA 蛋白裂解液(北京索萊寶生物科技有限公司,批號20210911)。MiniChemi 610 型全自動化學發光成像系統(北京六一生物科技有限公司);5424R 型高速冷凍離心機(德國 Eppendorf);KD-P 組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司);RM2016 病理切片機(上海萊卡儀器有限公司);JB-P5 石蠟包埋機(俊杰電子有限公司);DW-HL528 超低溫冰箱(中科美菱低溫科技公司);iMark 酶標儀(美國Bio Rad 公司);Cobasc701 全自動生化分析儀(瑞士Roche 公司);SK-O180-E 搖床(SCILOGEX 公司);BX43+sc50 顯微拍照系統(奧林巴斯有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備模型、動物分組、給藥與取樣

SD 大鼠適應性喂養1 周后,隨機選取12 只作為空白組,余48 只大鼠為造模組。造模組采用分2次隔周尾靜脈注射阿霉素(0.4+0.1) mg/100 g 的方法建立阿霉素腎病大鼠模型[3],空白組大鼠注射同等劑量的生理鹽水,以尿蛋白定量≥100 mg/24 h提示模型復制成功。

按隨機數字表法將造模成功的大鼠分為模型組、中藥組、潑尼松組、結合組,每組12 只,進行灌胃。依據大鼠的等效劑量相當于人的6.3 倍,中藥組:萆薢分清顆粒成人每天服用125 g/60 (kg·d)。大鼠的等效劑量為125 g/60 (kg·d)×6.3=13.125 g/(kg·d)。制備為2 g/mL 溶液,則需要6.56 mL/kg。潑尼松組:潑尼松成人用量為1 mg/(kg·d),換算后大鼠等效劑量為6.3 mL/(kg·d),配置為濃度1 mg/mL 的藥液,需要6.3 mL/kg。結合組給予中藥量6.56 mL/kg 和潑尼松溶液6.3 mL/kg 灌胃?？瞻捉M及模型組予等體積生理鹽水灌胃。每日灌胃1 次,連續4 周。給藥期間每天測體重并調整灌胃劑量,每2 周檢測1 次24 h-UTP。

干預4 周后,大鼠禁食水12 h 后,麻醉大鼠,心臟采血,靜置30 min 后轉速離心10 min,取上層血清,放于-80℃冰箱保存。取血完畢后,打開腹腔,剝離腎周圍組織,摘取大鼠雙側腎,用0.9%生理鹽水沖洗干凈后,剔除腎被膜,一側置于裝有4%多聚甲醛固定液的小離心管中進行固定,用于HE、Masson 染色觀察。另一側置于凍存管中,液氮速凍后移至-80℃冰箱,用于免疫組化和Western blot檢測。

1.3.2 檢測24 h-UTP 水平

取收集的24 h 尿液,送至甘肅中醫藥大學附屬醫院檢驗科,使用比濁法測定24 h 尿蛋白定量。

1.3.3 生化指標檢測

血TC、ALB,使用全自動生化分析儀,由甘肅中醫藥大學附屬醫院檢驗科生化實驗室檢測。

1.3.4 HE、Msaaon 染色觀察大鼠腎組織病理學改變

4%多聚甲醛固定腎組織,經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片(4 μm)、烤片后分別進行HE、Msaaon 染色處理,光鏡下觀察腎組織病理學變化。

1.3.5 免疫組織化學法(IHC)法檢測大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達

取出4%多聚甲醛固定的腎組織,梯度乙醇洗脫切片,滴加3% H2O2沖洗,配制0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)90℃進行抗原修復。加入一抗(podocalyxin,1 ∶100;α-actinin-4,1 ∶100),4℃孵育過夜,PBS 液洗3 次,每次5 min,37℃孵育二抗1 h,PBS 液洗5 次。DAB 顯色,蘇木素復染、梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。染色結果呈棕黃色顆粒為陽性。使用Image J 計算各張片子灰度值,最終平均光密度值以AOD=IOD/Area(即intDen/area)表示。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達水平

取100 mg 冷凍組織,剪碎,加入1 mL 預冷的生理鹽水,沖洗兩遍,置于低溫勻漿儀中充分勻漿,4℃ 12000 r/min 離心15 min,留上清備用。根據BCA 蛋白定量試劑盒檢測組織總蛋白濃度;上樣、電泳、轉膜。用5%脫脂牛奶封閉后分別用podocalyxin(1 ∶1000),α-actinin-4(1 ∶1500),內參β-actin(1 ∶5000)加入相應的一抗4℃孵育過夜,使用封閉液按1 ∶5000 稀釋二抗,室溫孵育1 h,洗脫,置于化學發光儀中曝光,使用Image 軟件分析相關蛋白表達。

1.4 統計學方法

使用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析,計量資料進行正態性及方差齊性檢驗,滿足正態性和方差齊性時,以平均數±標準差()表示。組間比較采用單因素方差分析,方差齊時,用LSD 檢驗;方差不齊時,用Grames-Howell 檢驗,以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態改變

實驗過程中,空白組大鼠一般狀態良好,精神佳,反應靈敏,皮毛有光澤,進食量正常;模型組大鼠精神差,活動量減少,毛發干枯,反應遲鈍,時有大便質稀,陰囊水腫,部分爛尾,體重增加緩慢;各藥物干預組初期和模型組有相同表現,隨著用藥,后期諸癥逐漸改善,活動量增多,進食量增加,大便形質正常。

2.2 萆薢分清顆粒對阿霉素腎病大鼠24 h 尿蛋白定量的影響

造模2 周末,與空白組比,造模組大鼠24 h 尿蛋白定量升高(P<0.05),提示成功復制模型;灌胃2、4 周時,模型組24 h 尿蛋白水平進一步升高,各藥物干預組比同期模型組不同程度減少(P<0.05),結合組降低趨勢最為顯著(P<0.05),見表1。

表1 不同時間各組大鼠 24 h 尿蛋白定量(ˉx±s,mg/24 h)Table 1 24 h urinary protein in each group at different time

2.3 萆薢分清顆粒對阿霉素腎病大鼠血清TC、ALB 的影響

灌胃4 周末,與空白組比較,模型組大鼠TC 值升高,ALB 下降(P<0.05);與模型組比較,各藥物干預組大鼠TC 值均有不同程度下降,ALB 不同程度升高(P<0.05);與中藥組和潑尼松組比較,結合組大鼠血清TC 值明顯降低,ALB 明顯升高(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠TC、ALB 水平()Table 2 TC and ALB levels of rats in each group

表2 各組大鼠TC、ALB 水平()Table 2 TC and ALB levels of rats in each group

注:與空白組相比,△P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。Note.Compared with the blank group,△P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.

2.4 光鏡下HE、Masson 染色后阿霉素腎病大鼠腎組織的病理變化

經HE、Masson 染色后,使用200 倍光鏡觀察,結果顯示:空白組大鼠腎小球形態結構清晰,基質部未見增生、壞死,小管及間質無明顯病理學改變;模型組腎小球可見局灶節段性瘢痕形成,系膜細胞及系膜基質增生,腎小管空泡變性,管腔內可見蛋白管型,間質纖維細胞增生伴炎性細胞浸潤;各藥物干預組間腎小球及腎小管病變均有所改善,結合組改善最為明顯。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠 HE 染色Figure 1 HE staining of rats in each group

圖2 各組大鼠Masson 染色Figure 2 Masson staining of rats in each group

2.5 免疫組化法檢測腎組織podocalyxin、αactinin-4 的表達

腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白結果顯示,與空白組相比,模型組和各藥物干預組大鼠podocalyxin 表達均明顯降低,α-actinin-4 表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,各藥物干預組podocalyxin 表達均升高,α-actinin-4 表達均有所下降(P<0.05);且結合組podocalyxin 表達高于中藥組、潑尼松組,α-actinin-4 表達低于中藥組、潑尼松組(P<0.05),見表3、圖3、圖4。

圖3 免疫組化法測腎組織podocalyxin 的表達Figure 3 Immunohistochemical staining of renal tissue expression of podocalyxin

圖4 免疫組化法測腎組織α-actinin-4 的表達Figure 4 Immunohistochemical staining of renal tissue expression of α-actinin-4

表3 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達比較(平均光密度,)Table 3 Comparison of podocalyxin and α-actinin-4 protein expression in kidney tissues of rats in each group(Mean optical density)

表3 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達比較(平均光密度,)Table 3 Comparison of podocalyxin and α-actinin-4 protein expression in kidney tissues of rats in each group(Mean optical density)

注:與空白組相比,△P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。Note.Compared with the blank group,△P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.

2.6 Western blot 檢測podocalyxin、α-actinin-4 蛋白的相對表達量

與空白組相比,模型組和各藥物干預組大鼠podocalyxin 表達強度降低,α-actinin-4 表達強度升高(P<0.05);與各模型組相比,各藥物干預podocalyxin、組有達強度均升高,α-actinin-4 表達強度均降低(P<0.05);且結合組podocalyxin、表達優于中藥組、潑尼松組,α-actinin-4 表達弱于中藥組、潑尼松組(P<0.05),見表4、圖5。

圖5 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達Figure 5 podocalyxin and α-actinin-4 protein expression in renal tissue of rats in each group

表4 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達量()Table 4 Podocalyxin and α-actinin-4 protein expression intensity in renal tissues of rats in each group

表4 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達量()Table 4 Podocalyxin and α-actinin-4 protein expression intensity in renal tissues of rats in each group

注:與空白組相比,△P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。Note.Compared with the blank group,△P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.

3 討論

根據病理表現,阿霉素腎病模型可分為急性阿霉素腎病模型與慢性阿霉素腎病模型,急性阿霉素腎病模型病理改變與人類微小病變腎病相似[4]。本實驗根據文獻報道[3]采用分2 次隔周尾靜脈注射阿霉素(0.4+0.1) mg/100 g 的方法制備阿霉素腎病模型。模型組動物在造模后第15 天24 h 尿蛋白定量顯著上升,第28 天出現明顯的組織病理學改變,與空白組比較有統計學意義,表明本次實驗復制阿霉素腎病模型較為理想。

NS 臨床表現為持續大量蛋白尿,而足細胞結構及功能的改變是導致蛋白尿及NS 發病和進展的關鍵環節。長期持續大量蛋白尿可造成腎小球硬化、腎小管損傷和腎間質炎癥細胞浸潤及纖維化,導致足細胞病變,最終腎功能下降,從慢性腎病發展為終末期腎病[5-6]。因此,開展對podocalyxin、αactinin-4 等足細胞蛋白的研究,尋找安全有效降低尿蛋白的方法,防止腎病理損傷的惡化,延遲腎替代治療的時間,逐漸成為治療腎病綜合征蛋白尿的新靶點。

NS 屬于中醫“水腫”、“關格”等范疇。本病病機為本虛標實,虛以肺、脾、腎三臟氣血陰陽虧虛為主,邪實則以濕、熱、瘀為甚,三者相互膠濁,致疾病反復遷延難愈。本研究采用臨床經驗方萆薢分清顆粒進行干預,方中綿萆薢利濕通淋,分清去濁為君藥;車前草通利小便,清膀胱濕熱;續斷補肝腎,強筋骨。二藥合用,補腎清熱利濕,達標本兼治之功,共為臣藥;茯苓利水滲濕健脾;黃柏清瀉下焦濕熱;加用槲寄生以增強續斷補腎之力;石菖蒲交通心腎,化濕通竅;丹參通心竅、清血熱;五藥合用,加強補腎清熱利濕之力,共為佐藥;生甘草一味以調和諸藥亦增清熱解毒之力為使藥;諸藥合而成方,使得此方配伍嚴謹,療效顯著。共奏健脾益腎、清熱利濕之效,使氣虛得復,瘀祛濕利,精微封藏,以調節臟腑陰陽動態的平衡?，F代藥理研究表明,萆薢水提物可通過減少腎組織中TNF-α、MCP-1 和ICAM-1 的表達及血清MCP-1 蛋白合成水平,起到保護腎的作用[7]。車前草有抗氧化和免疫調節作用[8];續斷可增強小鼠非特異性免疫功能[9];茯苓多糖可通過激活PPAR-γ 表達,抑制p38 MAPK 磷酸化,從而延緩db/db 小鼠腎小球硬化,保護腎損傷[10];黃柏中的主要成分黃柏堿可明顯降低大鼠血清中Scr、BUN 含量,抑制炎性因子的釋放,減輕腎的病理損傷,改善腎功能[11]。丹參多酚酸鹽可通過抑制糖尿病腎病小鼠體內氧化應激反應及調控TGF-β1/Smad 信號通路的活化狀態,減輕腎纖維化,延緩腎組織病理學改變[12]。本實驗中,模型組大鼠24 h 尿蛋白定量升高,腎小球可見局灶節段性瘢痕形成,系膜細胞及系膜基質增生,腎小管空泡變性,管腔內可見蛋白管型,間質纖維細胞增生伴炎性細胞浸潤;經萆薢分清顆粒干預后,24 h 尿蛋白、血清TC 明顯下降、ALB 升高,腎組織病理明顯改善,提示萆薢分清顆粒能降低阿霉素腎病大鼠24 h 尿蛋白量、血清TC 值,升高ALB 及減輕腎病理變化進而延緩疾病進展的作用,并且中西醫結合用藥效果顯著。

足細胞是一種附著在基底膜上的高度終末分化上皮細胞,位于腎小球毛細血管壁最外層,由胞體、主突和足突構成。足細胞之所以能在基底膜上穩定附著并發揮其正常功能,主要依賴于足細胞相關蛋白的維持。目前研究較多的是頂膜區蛋白podocalyxin 和骨架區蛋白 α-actinin-4。足細胞podocalyxin、α-actinin-4 與裂孔膜一起構成濾過屏障,共同維持足細胞的形態結構以及足細胞與GBM的功能完整,podocalyxin 的缺失及α-actinin-4 表達改變可引起足突融合,引發蛋白尿。podocalyxin 是一種帶有大量負電荷的CD34 家族的唾液酸蛋白,位于足細胞的胞膜頂端,也是維持腎小球濾過屏障結構和功能正常發揮的最主要物質基礎[13]。臨床研究發現微小病變、IgA 腎病等各種腎小球疾病患者,其腎組織穿刺病理活檢中腎小球足細胞podocalyxin 表達明顯降低,并與蛋白尿嚴重程度相關[14]。實驗研究表明podocalyxin 蛋白與腎小球足細胞關系密切,podocalyxin 的表達減少可引起足突融合,并與蛋白尿產生關系密切[15]。骨架蛋白αactinin-4 是收縮蛋白超家族成員,是維持足細胞骨架和裂隙隔膜功能的重要肌動蛋白相關分子,可將松散的肌動蛋白纖維交聯成可收縮束狀結構[16]。α-actinin-4 特異表達于腎小球臟層上皮細胞即足細胞[17],α-actinin-4 能將細胞骨架與裂孔隔膜分子連接起來,在保持足細胞生理結構中起核心作用。其中,肌動蛋白細胞骨架的改變與α-actinin-4 分子表達和分布的異常密切相關。近年的許多實驗證實足細胞功能及結構的異常,濾過膜的損傷及蛋白尿的出現是由α-actinin-4 的異常表達所導致[18]。本實驗中,模型組大鼠免疫組化結果顯示podocalyxin陽性表達明顯減弱,α-actinin-4 呈強陽性表達;免疫印跡結果顯示podocalyxin 表達強度降低,α-actinin-4 表達強度升高;藥物干預后,各治療組podocalyxin陽性表達增強,α-actinin-4 陽性表達減弱,podocalyxin 表達強度升高,α-actinin-4 表達強度下降。且結合組表現出明顯的優勢。這提示萆薢分清顆粒能通過下調大鼠腎組織足細胞骨架αactinin-4 及上調足細胞頂膜區podocalyxin 表達,修復受損的足細胞,穩定足細胞結構與功能,減少尿蛋白的排泄,延緩慢性腎病的發展。

綜上,萆薢分清顆?？赡芡ㄟ^上調阿霉素腎病大鼠腎組織中足細胞podocalyxin 表達,下調αactinin-4 表達,修復受損的足細胞,減輕大鼠腎病理損傷,減少尿蛋白排泄,延緩腎病綜合征大鼠病情進展。