不同刺激因素誘導的慢性阻塞性肺疾病小鼠模型肺小血管重塑的比較研究

崔莉莉 梅曉峰 盧瑞龍 徐可心 田燕歌

(1.河南中醫藥大學呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心,河南省中醫藥防治呼吸病重點實驗室,鄭州 450046;2.河南中醫藥大學中醫藥科學院,鄭州 450046)

肺血管結構和功能的改變是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的主要病理特征,可損害氣體交換功能、引起肺動脈高壓,影響患者預后[1]。研究發現,在輕度COPD患者或肺氣腫易感的吸煙人群中即出現肺小血管血流異常,且隨疾病進展而惡化[2]。香煙煙霧、細菌等有害物質進入機體,細小顆粒隨氣體交換進入肺小血管,促進炎癥細胞的募集及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的釋放,引起內皮和血管平滑肌增殖,形成肺血管重塑,終致肺動脈高壓、肺源性心臟病[3-6]。通過CT 觀察發現,肺小血管的改變能反映患者肺氣腫程度及是否存在肺動脈高壓,且對于判斷患者預后具有重要意義[7]?？梢?肺小血管改變發生較早,并與COPD疾病進展及預后關系密切。本研究在前期研究基礎上[8],比較了在香煙煙霧、細菌及其聯合的刺激因素下,不同時間點肺小血管重塑情況,以期為深入研究COPD 合并肺血管病變機制及相關治療提供模型依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級BALB/c 小鼠72 只,雄性,體重為20～22 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2021-0006],并飼養于河南中醫藥大學動物實驗中心[SYXK(豫)2021-0015]。本實驗均通過河南中醫藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審查(DWLL202003210),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.1.2 細菌

肺炎克雷伯桿菌(46114)由中國生物制品檢驗鑒定所提供,使用前將細菌濃度調整為5×109CFU/L。

1.2 主要試劑與儀器

紅旗渠牌過濾嘴香煙,由河南中煙工業有限責任公司生產,焦油量10 mg,煙氣煙堿量0.8 mg,煙氣一氧化碳量12 mg。

SABC 免疫組化試劑盒(Boster,批號:16K13E28J0922);DAB 顯色試劑盒(Boster,批號:16K04A27);VEGF 抗體 (proteintech,批號:00062384)。動物肺功能檢測系統(FinePointe,美國);Leica-DM6000B 光學顯微鏡及LAS V4.7 照相系統(Leica,德國);Image-Pro Plus(IPP)6.0 專業圖像分析系統(Cybernetics,美國);CaseViewer(C.V)2.4 切片瀏覽分析系統(3D histech,匈牙利)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及小鼠模型制備

72 只SPF 級BALB/c 雄性小鼠,適應性飼養7 d 后,通過隨機數字法分為4 組:正常組(Normal組)、細菌組(KP 組)、香煙煙霧組(CS 組)、香煙煙霧聯合細菌組(CS+KP 組),每組18 只。CS 暴露方法:使用煙熏系統裝置進行煙霧暴露,使煙霧濃度達到(3000±500)ppm,每次40 min,每天2 次(早晚各1 次);KP 感染方法:每只小鼠鼻腔滴入20 μL KP 稀釋液,每7 d 一次。正常組給予過濾空氣加生理鹽水滴鼻,CS 組給予香煙煙霧暴露及生理鹽水滴鼻,KP 組給予過濾空氣和KP 稀釋液滴鼻,香煙煙霧聯合細菌組,采用上述CS 暴露和反復KP 感染法聯合處理。第1～8 周造模,觀察至第16 周。分別于第4、8、16 周結束后各組隨機選取6 只,進行分批取材。

1.3.2 肺功能測定

第0、4、8、12、16 周末采用全身體積描記系統,檢測小鼠肺功能,觀察呼氣中期流速(50% expiratory flow,EF50)和潮氣量(tidal volume,TV)指標。

1.3.3 肺組織病理改變

左肺經10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片并采用HE 染色。光學顯微鏡下觀察100 μm≤直徑≤300 μm 肺小動脈的形態變化,測量肺血管直徑(vessel diameter,VD)、管壁厚度(wall thickens,WT),血管總面積(total area,TA)、管壁面積(wall area,WA=TA-LA)、管腔面積(luminal area,LA),計算管壁厚度占血管直徑百分比(WT%=WT/VD×100%)、管壁面積占血管總面積百分比(WA%=WA/TA×100%)及管腔面積占血管總面積百分比(LA%=LA/TA×100%)進行量化分析。

1.3.4 免疫組化學檢測血管VEGF 的蛋白表達

肺組織石蠟包埋切片后,進行烤片、脫臘、抗原修復、血清封閉后,加VEGF 一抗(1 ∶5000)4℃過夜,次日滴加二抗、DAB 顯色液、蘇木素復染后,采用Leica-DM6000B 光學顯微鏡及LAS V4.7 照相系統進行觀察VEGF 血管陽性表達并拍照記錄。Image-Pro-Plus6.0 軟件計算光密度并量化比較。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計軟件進行各組數據分析。數據處理結果以平均數±標準差()表示;不同組間采用單因素方差分析,符合正態分布且方差齊者采用LSD 分析,方差不齊者采用Dunnett’sT3 進行分析,以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

實驗觀察期間,正常組小鼠毛色光亮、呼吸均勻、精神良好且食量正常,CS 組從第8 周出現毛發微黃、精神不振且呼吸淺快,KP 組僅第8 周出現精神不振、食量減少,CS+KP 組從第4 周出現毛發干枯發黃、呼吸急促、精神萎頓且食量減少。各組觀察至第16 周,未出現動物死亡現象。

2.2 各組小鼠肺功能變化

第0～16 周,各組小鼠肺功能TV、EF50 隨時間均有升高趨勢,但正常組升高較為顯著,其余組升高緩慢。與正常組比較,CS 組TV 在第8 周顯著降低并持續到第12 周,EF50 在第8 周顯著降低且持續到第16 周(P<0.05);CS+KP 組TV 在第4 周顯著降低并持續到第16 周(P<0.05),EF50 在第8 周顯著降低且持續到第16 周(P<0.05);KP 組無顯著差異。見表1、表2。

表1 各組小鼠不同時間點TV 的比較(,mL/s,n=6)Table 1 Comparison of TV in each group of mice at different time points

表1 各組小鼠不同時間點TV 的比較(,mL/s,n=6)Table 1 Comparison of TV in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.

表2 各組小鼠不同時間點EF50 的比較(,mL/s,n=6)Table 2 Comparison of EF50 in each group of mice at different time points

表2 各組小鼠不同時間點EF50 的比較(,mL/s,n=6)Table 2 Comparison of EF50 in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.

2.3 各組小鼠肺組織病理變化

正常組各時期鏡下觀察肺泡結構完整、間隔均勻,無炎性細胞浸潤。CS 組第8 周肺泡間隔破裂明顯且有炎性細胞浸潤持續到第16 周;KP 組第8 周肺泡出現部分破裂融合且有少量炎性細胞浸潤,炎癥浸潤第16 周仍存在;CS+KP 組第4 周肺泡腔已出現不規則擴張融合、炎性細胞浸潤并持續到第16周。見圖1。

圖1 不同時期各組小鼠肺組織病理變化(HE 染色)Figure 1 Histopathological changes of lung in each group of mice in different periods(HE staining)

2.4 各組小鼠肺組織血管結構變化

正常組各時期鏡下觀察小鼠肺血管未見明顯的病理改變,血管管腔形態及管壁厚度正常,未見明顯的炎性浸潤;CS 組在第8 周,肺小動脈可見中膜增厚、管腔狹窄、周圍炎性浸潤明顯并持續到第16 周;KP 組僅第8 周,肺小動脈出現管壁增厚、管腔狹窄等病理變化;CS+KP 組在第4 周,肺小動脈就已出現中膜增厚且呈肌化、管腔狹窄及大量炎性細胞浸潤并持續到第16 周。

與正常組比較,CS 組WT%在第8 周顯著升高并持續到第16 周,WA%僅第8 周顯著升高、LA%僅第8 周顯著降低(P<0.05);CS+KP 組WT%、WA%自第4 周顯著升高且并持續到第16 周,LA%自第4周顯著降低且持續到第16 周(P<0.05);KP 組WT%僅第8 周顯著升高,LA%僅在第8 周顯著降低(P<0.05);CS+KP 組較CS 組,WT%在第8 周持續顯著升高并持續到第16 周,WA%第16 周顯著升高,LA%第16 周顯著降低(P<0.05);CS+KP 組較KP 組,WT%、WA%在第8 周持續顯著升高且持續到第16 周,LA%在第4 周持續顯著降低且持續到第16 周(P<0.05),CS 組較KP 組,WT%僅第8 周升高、LA%僅第8 周降低(P<0.05)。見圖2、表3、表4、表5。

表3 各組小鼠不同時間點WT%比較(,n=6)Table 3 Comparison of WT% in each group of mice at different time points

表3 各組小鼠不同時間點WT%比較(,n=6)Table 3 Comparison of WT% in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05;與香煙煙霧組比較,?P<0.05;與細菌組比較,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,?P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

表4 各組小鼠不同時間點WA%比較(,n=6)Table 4 Comparison of WA% in each group of mice at different time points

表4 各組小鼠不同時間點WA%比較(,n=6)Table 4 Comparison of WA% in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05;與香煙煙霧組比較,?P<0.05;與細菌組比較,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,?P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

表5 各組小鼠不同時間點LA%比較(,n=6)Table 5 Comparison of LA% in each group of mice at different time points

表5 各組小鼠不同時間點LA%比較(,n=6)Table 5 Comparison of LA% in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05;與香煙煙霧組比較,?P<0.05;與細菌組比較,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,?P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

圖2 不同時期各組小鼠肺血管病理變化(HE 染色)Figure 2 Changes in pulmonary vascular pathology in each group of mice at different periods(HE staining)

2.5 各組小鼠肺組織VEGF 蛋白表達變化

與正常組比較,CS 組VEGF 陽性表達僅第8 周顯著增加(P<0.05);CS+KP 組VEGF 陽性表達自第4 周顯著升高并持續到第16 周(P<0.05);KP 組VEGF 陽性表達無顯著趨勢。見圖3、表6。

表6 各組小鼠不同時間點VEGF 比較(,n=5～6)Table 6 Comparison of VEGF in each group of mice at different time points

表6 各組小鼠不同時間點VEGF 比較(,n=5～6)Table 6 Comparison of VEGF in each group of mice at different time points

注:與正常組比較,#P<0.05;與香煙煙霧組比較,?P<0.05;與細菌組比較,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,?P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

圖3 各組小鼠肺組織VEGF 表達變化(IHC)Figure 3 Changes in VEGF expression in lung tissues in each group of mice

3 討論

COPD 是一種以氣流受限、慢性進行性氣道炎癥為特點的肺部疾病,肺血管病變在COPD 患者中普遍存在[2]。臨床研究發現,約30%～70%的COPD患者存在顯著肺血管病變,加重疾病惡化程度[9]。此外,肺小動脈缺氧性收縮可促進血管內膜增厚、平滑肌增生,導致血管結構改變,最終形成肺動脈高壓[10]。香煙煙霧、環境污染物等多種致病因素可引起肺小血管的改變[11]。香煙煙草中含有大量有毒成分,長期香煙煙霧刺激引起氣道平滑肌細胞增殖的同時,還可通過血小板衍生生長因子誘導肺小動脈平滑肌層的增厚、管腔變窄、增加右心室收縮壓,從而引起肺血管重構,繼發肺動脈高壓[12-13]。細菌感染也是COPD 發生發展的重要致病因素,其中,肺炎克雷伯桿菌為常見的病原菌,可導致支氣管炎癥、氣道重塑及肺小動脈管壁增厚明顯等病理特征,與患者進展和預后密切相關[14-16]。目前,COPD 模型制備方法包括單一因素誘導的模型,例如CS 暴露[17]、細菌感染[18]、病毒感染[19],及復合因素誘導的模型,例如CS 聯合細菌[15,20-21]或病毒感染[8]、CS 聯合脂多糖[22]等。課題組前期比較了香煙、細菌、病毒及香煙聯合細菌或病毒因素建立的COPD 小鼠模型,發現均可引起肺功能下降、肺組織結構損傷[8]。本研究在此基礎上,選取CS、KP 及其聯合三種方法誘導COPD 小鼠模型,以肺血管結構變化為主要指標,觀察不同誘導因素下肺血管的動態變化,為深入探討COPD 血管病變機制、藥物對肺血管的作用及遠后效應評價、藥物作用機制研究提供模型依據。

肺功能下降不僅反映氣流受限程度,還與肺血管重構程度有關,當肺實質破壞和血管管壁發生異常改變時,損害了肺泡腔中氣體交換功能,導致肺功能逐漸下降[23-24]。EF50 作為衡量氣道阻力指標,反映小鼠支氣管阻塞程度,TV 反映肺通氣功能[25-26]。本研究發現,單獨香煙煙霧暴露在第8周,TV 明顯降低,小鼠出現呼吸淺快,在第16 周仍存在;EF50 在第8 周降低,出現明顯氣道阻塞并在第16 周仍存在。單獨細菌感染EF50、TV 降低并不明顯,提示小鼠無明顯氣道阻力,且呼吸無明顯異常。香煙煙霧聯合細菌感染在第4 周,TV 明顯降低,小鼠即出現呼吸淺快,在第16 周持續存在;EF50 在第8 周降低,出現明顯氣道阻力且在第16周仍持續存在。說明香煙煙霧或其聯合細菌感染可明顯降低小鼠肺通氣功能,引起氣道阻塞,且在去除刺激因素(比如戒煙)后難以逆轉。

多種刺激因素導致的缺氧、慢性炎癥,促進血管壁分泌VEGF 等細胞因子,并通過肺血管平滑肌細胞表型轉化,刺激血管病理性生成,破壞血管內皮屏障,從而出現管壁內膜增厚、管腔狹窄甚至閉塞等病理表現,最終導致肺血管結構重塑[27-30]。本研究以管壁厚度、管壁面積、管腔面積為肺血管重塑指標,并選取直徑小于300 μm 的接近于肺小動脈范圍的血管,通過測量分析發現,單獨香煙煙霧暴露在第8 周,出現肺小動脈管壁增厚、管腔狹窄,VEGF 表達明顯增加,第16 周管壁增厚仍存在,而管腔狹窄僅第8 周存在;單獨細菌感染僅第8 周出現管壁增厚、管腔狹窄的病理變化;香煙煙霧聯合細菌感染4 周即出現肺小動脈管壁增厚、管腔狹窄及VEGF 表達明顯現象,并在第16 周仍存在。說明香煙煙霧、細菌及其聯合均可引起肺小動脈重塑,但復合因素誘導的模型肺小動脈重塑發生較早,持續時間較長。

綜上,香煙煙霧、肺炎克雷伯桿菌及其聯合刺激8 周均能誘導小鼠出現肺泡破裂、炎性細胞浸潤、肺血管重塑等COPD 病理特征,但各有特點:單獨香煙刺激8 周出現肺功能下降、肺泡結構斷裂融合,并在第16 周仍存在,但肺血管重塑僅第8 周明顯;單獨細菌感染肺功能下降不明顯,肺組織炎癥細胞浸潤明顯并持續存在,肺泡結構改變及肺血管重塑僅第8 周存在;香煙煙霧聯合細菌感染復合刺激4 周即出現肺功能下降、肺泡結構的破壞及肺血管重塑,第16 周仍持續存在。因此,對于COPD 合并肺血管病理機制及藥物作用機制的研究可選用單獨香煙暴露或者香煙煙霧聯合細菌感染模型,對于藥物作用特點、遠后效應評價的研究選用香煙煙霧聯合細菌感染復合模型較為妥當。