下一代益生菌防治動脈粥樣硬化的研究進展

王夢楠 ,秦合偉 ,郭 寧 ,宋雪梅 ,牛雨晴 ,孫孟艷

(1.河南中醫藥大學,鄭州 450046;2.河南省中醫院康復醫學科,鄭州 450002)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種發生在大中動脈內膜的全身炎癥性疾病,該疾病周期較長,往往始于童年時期,受血糖、血脂、年齡、性別、遺傳等多種因素影響,是腦卒中、冠心病等心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)的主要病理基礎。CVD 是人類健康的頭號殺手,至2020 年我國患此類疾病的人數已超3 億,其發病率及死亡率均居首位[1]。深入研究AS 的發病機制對防治CVD具有重要意義。

隨著高通量測序技術和生物信息學技術的應用,科學家們發現腸道菌群紊亂參與AS 的發生、發展,而維持宿主腸道微生物群的平衡對降低腸道屏障通透性、調節宿主代謝、預防腸道及全身炎癥至關重要。益生菌可以平衡和調節腸道微生物多樣性,與專注于人體腸道健康的傳統益生菌相比,下一代益生菌(next-generation probiotics,NGPs)被視為活體生物藥(live biotherapeutic product,LBP),其研究與開發針對特定疾病。研究表明,嗜黏蛋白阿克曼菌、擬桿菌等下一代益生菌可以協助和參與與腸道微生物相關的各種有益生化途徑從而起到抗AS 作用。本文對下一代益生菌防治動脈粥樣硬化的作用機制和研究進展作一綜述,以期為臨床上防治AS 提供新的研究方向。

1 動脈粥樣硬化與腸道微生物

動脈粥樣硬化是由多種因素引起的慢性炎癥性疾病,始于大中動脈內膜發生的脂肪浸潤及復合糖類沉積,進而內膜呈灶狀纖維化并出現鈣質沉著,形成AS 斑塊,導致血管壁變硬增厚并伴隨管腔狹窄。該過程涉及內膜纖維化、脂肪斑塊的形成、平滑肌細胞的增殖、單核細胞和T 淋巴細胞的趨化、血小板過度活躍和膽固醇積累,其特征是對內源性抗原(如熱休克蛋白)和外源性微生物抗原產生免疫反應[2-3]。目前臨床上采用他汀類藥物對AS 患者進行降脂治療,但該方法會引起肝損傷、肌痛等不良反應,無法滿足所有需求。

人類胃腸道中存在100 萬億(1014)個微生物,包括細菌、古細菌、真菌、原生動物和病毒。作為一種能夠調節宿主代謝的活性器官,腸道微生物已被證明與AS 進展密切相關。與健康人群相比,動脈粥樣硬化患者腸道微生物群中柯林氏菌屬、腸桿菌科、鏈球菌科和克雷伯氏菌屬的豐度較高,而產生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)的真桿菌屬、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬的豐度較低[4]。Szabo等[5]發現與患有亞臨床動脈粥樣硬化的受試者相比,頸動脈內膜中層厚度值正常的人群中普雷沃菌科的豐度更高,且厚壁菌門/擬桿菌門的比例與頸動脈內膜中層厚度呈正相關。腸道微生物的結構成分及其代謝產物包括脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、氧化三甲胺(trimetlylamine oxide,TMAO)、膽汁酸(bile acids,BAs)、SCFAs、馬尿酸鹽、吲哚硫酸鹽等也可通過調控宿主免疫、炎癥反應,影響血管內皮功能和調節脂質代謝等途徑改變動脈粥樣硬化的進程[6]。

2 下一代益生菌

2.1 下一代益生菌的含義

隨著對腸道微生物與疾病關系的深入認識和生物測序技術的快速發展,科學家們提出了新的概念即“下一代益生菌”,是指從健康供體腸道菌群中識別、分離出的有別于傳統益生菌的新型細菌及通過添加、刪除或過表達特定基因而開發的轉基因微生物,它們符合益生菌的定義,但未曾應用于促進人體健康[7-8]。人類胃腸道中細菌密集,可通過比對健康人和患者腸道中的微生物群組成差異來篩選NGPs,分子生物學、宏基因組測序、16S rRNA 高通量測序等尖端測序技術和生物信息學技術能夠對微生物群進行全面的分析,以鑒定、分離出潛在的NGPs,隨后進行成分分析、宏基因組學研究和宿主反應來選擇有效的益生菌,并對選定的新益生菌進行體外細胞系試驗、動物試驗或人體臨床試驗來驗證其功能,以便闡明潛在的分子改善機制。

2.2 下一代益生菌的來源及候選菌群

2.2.1 人類腸道菌群

NGPs 來源于人類腸道和糞便中細菌的不同種屬,大多數來自擬桿菌門和厚壁菌門,較為典型的菌株有霍氏真桿菌、普氏菌、小克里斯滕森氏菌、普拉梭菌以及來自疣微菌門的嗜黏蛋白阿克曼菌[9]。詳見表1。

古細菌又名古生菌、古菌,是除細菌域和真核生物域外的第三大生命領域,一些在人體腸道中自然生長的特定古細菌——產甲烷菌被認為是潛在的下一代益生菌,從大型人類隊列的宏基因組分析中推斷出產甲烷菌約占腸道微生物總量的1.5%[31]。詳見表2。

表2 腸道古生菌中的下一代益生菌候選者Table 2 Next-generation probiotic candidates in intestinal archaea

2.2.2 設計型益生菌

NGPs 還包括通過添加、刪除或過表達特定基因的設計型益生菌,涉及新陳代謝、技術壓力耐受性、在人類腸道中的生存能力及治療和預防分子的粘膜定向遞送,以確定對宿主的一種或多種健康益處,從而衍生出用于防治各種疾病的“活體生物藥”概念[8]。使用基因組編輯工具可以對現有的益生菌進行進一步的修改與探索,如轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN) 技術與鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)技術能夠完成一系列遺傳學編輯修飾操作,近些年出現的CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技術可以完成RNA 導向的DNA 識別和編輯,且更易于操作,為基因組編輯提供了一個更好的平臺。

2.3 下一代益生菌的局限性

由于NGPs 發現歷史短暫且未進行過大規模發酵,大部分NGPs 的安全性尚未明確。此外,大多數NGPs 候選者對需氧條件高度敏感,現有的工業廠房設計和工藝流程不能創造適宜的厭氧環境,一些細菌和古細菌在腸道中也無法長時間定殖;并且培養NGPs 的具體營養需求尚未闡明,已知的經過充分研究的NGPs 則需要復雜的營養需求,這需要實驗室規模的粘蛋白、瘤胃液、血紅素肉湯等,這些技術因素成為了大規模開發及生產新益生菌的障礙[8]。另一方面,微生物組的功能取決于其結構和多樣性,這在多因素的影響下在個體中是高度獨特的,將新的微生物引入腸道需考慮其有效性和不同個體之間的差異性反應。新的微生物是否會對已建立的腸道菌群結構帶來意想不到的結果,對宿主產生不可控的有害影響,是下一代益生菌廣泛應用于臨床前需解決的重要問題[34]。

3 下一代益生菌防治動脈粥樣硬化的作用機制

3.1 改善腸道屏障通透性

腸道屏障是抵御病原微生物和有毒物質入侵人體的第一道防線,由粘液層、上皮層和固有層組成,若腸道屏障的通透性增加導致革蘭陰性菌外膜上的LPS 進入血液,就會促進炎性細胞因子表達和泡沫細胞形成,從而加速AS 進程。腸道屏障的粘液層主要由上皮層杯狀細胞分泌的黏蛋白(mucoprotein,MUC)組成,A.muciniphila的黏蛋白降解能力可刺激MUC 的產生,增加粘液層的厚度,改善內毒素血癥[20]。研究顯示下一代益生菌R.intestinalis、Parabacteroides、Oscillospira、R.bromii、C.minuta、F.prausnitzii、C.butyricum及無毒的B.fragilis等菌株能夠有效改善腸道屏障功能,可能是這些菌株能夠產生SCFAs 丁酸鹽,丁酸鹽被證明能夠下調促炎細胞因子的腸道轉錄水平并增加MUC和上皮層緊密連接(tight junction,TJ)蛋白的表達量,保護屏障的完整性,而丁酸鹽可通過脂肪酸氧化為機體提供能量并增加氧氣的消耗和缺氧誘導因子的穩定性,增強上皮屏障功能[10,21,23,27,30,35]。功能性免疫反應參與調節腸道屏障的完整性,R.intestinalis的結構成分鞭毛蛋白與Toll 樣蛋白受體5 (toll-like receptor,TLR5)相結合能夠調節免疫反應,提升TJ 的表達[23]。A.muciniphila和Clostiridumgenus產生的色氨酸代謝產物吲哚-3-丙酸(indole-3-propionic acid,IPA)同樣能夠改善腸道屏障功能,當動脈粥樣硬化發生時,IPA 的合成減少[36-37]。

腸道屏障在預防、阻止腸道及全身炎癥的過程中發揮重要作用,丁鹽酸的供能、抗炎、抗氧化作用幫助維持正常的腸道屏障功能,低膳食纖維會使丁酸鹽的產生減少,而富含纖維的飲食可以提高腸道中產丁酸鹽細菌的豐度。到目前為止,直接使用產丁鹽酸的菌株作為益生菌補充劑仍面臨許多技術挑戰,因為大多數丁酸鹽生產者都是高度厭氧的,而創造適宜這些菌株生存的無氧環境仍受到許多技術因素限制。

3.2 調節膽固醇合成與代謝

脂質沉積于人體大中動脈內膜是AS 形成的關鍵步驟。部分來自毛螺菌科和瘤胃菌科的NGPs 能夠產生SCFAs 丙酸鹽進而抑制膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)的活性,減少膽固醇合成;SCFAs 還可以上調肝臟膽固醇調節元件結合蛋白2(sterol-regulatory element binding protein 2,SREBP2)mRNA 的表達,激活低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)受體,進而增強循環LDL 的清除[38]。BAs 是膽固醇的下游代謝產物,腸道菌群可以參與BAs 的代謝,包括水解初級結合膽汁酸和將游離的初級膽汁酸暫時脫羥基轉化為重吸收效率較低的次級膽汁酸,從而影響肝中膽固醇向BAs 的轉化,調節血漿膽固醇水平,參與上述過程的菌屬有擬桿菌屬、梭菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬和真桿菌屬等[2,39]。除此之外,小克里斯滕森氏菌新菌株C.minutaDSM33407也能夠促進初級膽汁酸的去結合進而增加次級膽汁酸的合成[21]。而Parabacteroides豐度與血漿膽固醇水平和小鼠主動脈斑塊大小呈負相關,其中的P.distasonis同樣具有廣泛的膽酸轉化功能,可以將多種結合型膽酸水解,并使其轉化為次級膽酸,進而激活腸道FXR 信號通路,緩解高脂血癥[17-18]。Kashtanova 等[28]發現血液中高水平的極低密度脂蛋白和中密度脂蛋白膽固醇與內膜中層增厚有關,且此二者含量分別與F.prausnitzii與P.copri的豐度呈負相關;但也有研究表明,P.copri和LDL 呈正相關,其高豐度與胰島素抵抗、肥胖、高血壓及非酒精性脂肪肝有關[40]。

3.3 影響血漿TMAO 水平

高膽堿飲食中的營養物質經腸道中多種微生物酶復合物代謝產生三甲胺(trimetlylamine,TMA),TMA 進入門靜脈,經過肝中宿主酶進一步代謝產生TMAO;血漿TMAO 濃度升高會激活巨噬細胞流入膽固醇,導致泡沫細胞形成,還會使血小板過度活躍并促進內皮細胞衰老、血管老化和氧化應激反應從而加快AS 進展。TMAO 水平與光崗菌屬、脫硫弧菌屬、梭桿菌屬、普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌科等13 種糞便菌群豐度顯著相關[41]。減少TMA 的合成或將其轉化為惰性化合物可限制后續產生的不良影響,研究表明,一些人類腸道的古細菌——嗜溫產甲烷桿菌可以使用TMA 作為末端電子受體,氫氣作為電子供體,通過三甲胺甲基轉移酶(MttB)產生甲烷,以此來減少TMAO 的合成,如MethanomassiliicoccusluminyensisB10,而以二氧化碳作為末端電子受體產生甲烷且不具備MttB 基因的M.smithii也可以降低小鼠血漿中TMAO 濃度[31-32]。在產甲烷古菌的甲胺甲基轉移酶中發現的由終止密碼子UAG 有義編碼生成的吡咯氨基酸(pyrrolysine,Pyl)是MttB 的必要成分,對大腸桿菌進行工程改造以正確編碼和合成Pyl 能夠促進腸道中MttB 的原位合成和遞送,從而促進TMA 向甲烷轉化,減少TMA 擴散至肝的量[33]。

TMAO 是腸道菌群失調和血管病變之間的主要介質,目前臨床常使用TMA 裂解酶抑制劑3-3-二甲基-1-丁醇(3,3-dimethyl-1-butanol,DMB) 來減少TMA 產生,進而降低血漿TMAO 水平,而對產甲烷菌及重組益生菌的深入研究讓我們認識到該問題的新的解決方法。隨后可將研究焦點聚集在消除產甲烷菌的最終產物甲烷帶來的不良影響,如食物通過腸道的速度減慢;以及利用設計型益生菌減少腸道中TMA 的表達,從而發揮穩定的降TMAO作用。

3.4 調節氨基酸代謝

氨基酸代謝失調會影響葡萄糖和脂質代謝及巨噬細胞、泡沫細胞形成,在AS 中起到重要作用。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)作為蛋氨酸和半胱氨酸的中間代謝產物,是一種毒性氨基酸,可通過損傷血管內皮細胞,促進血管平滑肌細胞增殖及誘發炎癥和氧化應激反應等途徑引發AS。研究表明,Bacteroides成員B.thetaiotaomicron、B.xylanisolvens、B.dorei和B.uniformis可產生葉酸并促進其代謝,葉酸的代謝產物5-甲基四氫葉酸能夠為Hcy 提供甲基,使之重新轉化為蛋氨酸[12,14]。支鏈氨基酸(branched chain amino acids,BCAAs)循環水平升高會出現胰島素抵抗,促進炎癥反應和活性氧的生成導致內皮功能障礙,還會增加血小板活性致使血栓形成,用B.thetaiotaomicron灌胃可降低血液中BCAAs 的濃度并減輕飲食引起的小鼠體重增加和肥胖[42-43];但Cho 等[44]學者的研究卻表明該菌株會增加小腸中脂肪酶活性,促進脂質消化吸收和體重增加,并加重代謝紊亂。Clostridium、Bacteroides、A.muciniphila等菌屬參與腸道中芳香族氨基酸(aromatic amino acids,AAAs)如色氨酸代謝為吲哚及其衍生物的過程,這些產物與芳香烴受體(aromatic hydrocarbon receptor,AhR)相結合可有效抑制腸道炎癥并降低CVD 風險因素[45-46]。

越來越多的研究關注Hcy 與AS 的相關性,高同型半胱氨酸血癥已被認為是CVD 的獨立危險因素,補充葉酸和維生素B6、維生素B12是臨床常用的下調機體Hcy 水平的方法,應注意的是葉酸的補充劑量因人而異,不要在一段時間內大劑量使用,以免導致哮喘、皮疹。適當應用NGPs 使其在宿主腸道內原位合成葉酸可能成為降低血漿Hcy 水平,減輕高同型半胱氨酸血癥及其并發癥的主要研究方向。

3.5 改善腸道微生物多樣性

下一代益生菌可以通過平衡和調節腸道微生物的多樣性及豐度來影響AS 的發生與發展。如C.minutaDSM33407 的長期給藥顯著減少了高脂飲食誘導的微生物易位,改善了遠端結腸的微生物多樣性,還恢復了接種肥胖者糞便微生物群的個體中厚壁菌門/擬桿菌門的比例[21]。除此之外,克里斯滕森菌科成員在發酵過程中可以產生大量的氫氣,從而促進某些氫營養產甲烷菌如M.smithii的腸道定殖,并向其他丁酸鹽生產者提供乙酸鹽來塑造腸道微生物的組成,B.thetaiotaomicron也已被證明能夠支持M.smithii的生長,在無菌小鼠體內同時接種上述兩種微生物,可增加果聚糖的發酵,促進M.smithii生長代謝,從而改善宿主的腸道功能[22,47]。

腸道菌群失調與動脈粥樣硬化之間存在緊密的關聯,通過飲食干預、糞菌移植或服用益生菌、益生元等方式調整腸道菌群結構使腸道保持健康、穩定狀態能夠有效延緩動脈粥樣硬化進程。NGPs 的發展與特定疾病密切相關,利用NGPs 來定向重塑腸道微生物群結構是一種防治AS 的新方法,但要注意不能盲目干預患者的腸道菌群結構,以免造成胃腸道紊亂等諸多不良后果。

3.6 其他

動脈粥樣硬化病變的免疫組織化學研究表明,腸道中存在R.intestinalis定殖的小鼠的巨噬細胞數量減少但膠原蛋白水平增加,表明該菌株促進了AS斑塊的穩定性;同時在這些小鼠體內檢測到了較高水平的酮體β-羥基丁酸酯,它可以通過抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)的激活和釋放來抑制慢性炎癥過程[24]。表達靈芝8 蛋白(lingzhi 8 protein,LZ8)的重組乳酸乳球菌可以降低主動脈中 IL-1β 的基因表達,減少主動脈內膜厚度和內皮下泡沫細胞數量,從而表現出對AS 的改善作用[48]。Deshpande 等[3]對恥垢分枝桿菌進行基因改造,使其成為表達載脂蛋白B、熱休克蛋白60 和肺炎衣原體外膜蛋白的三肽多抗原重組分子,重組的恥垢分枝桿菌具有免疫原性,在口服給藥時激活樹突狀細胞并產生持久的記憶T 細胞,促進調節性免疫反應發生,減緩了小鼠模型中AS 的發展。

4 總結與展望

通過操縱腸道共生菌來影響宿主的各項生理功能進而改善健康或治療疾病目前已成為醫學學科的熱門研究領域。本文闡述了NGPs 對動脈粥樣硬化產生的積極作用,提示NGPs 可能成為調節機體代謝、免疫等功能的新趨勢。但由于技術因素限制和缺乏先驗知識,許多微生物菌群仍然無法在體外培養;除此之外,很多實驗研究成果未得到驗證,還不能指導個人健康、公共衛生及臨床實踐,大眾對服用經過基因編輯的微生物的接受度如何目前也沒有定論。腸道菌群是一個復雜的生態系統,迄今為止,科學家們尚未完全揭示各菌株之間和菌群與宿主之間的相互作用機制,這是腸道菌群所需研究的焦點內容,同時全面了解NGPs 的有效性、安全性、藥物敏感性模式、潛在的毒力因素及利用NGPs防治疾病的生理學、基因組學和代謝組學特征也是不可或缺的。