高校實驗動物中心動物質量控制研究與創新實踐

張志妮 ,楊力衡 ,嚴 楚 ,蔡衛斌?

(1.中山大學實驗動物中心,廣州 510006;2.廣州市白云區畜牧獸醫站,廣州 510550)

實驗動物作為“活的精密儀器”,是生命科學研究中必須具備的四大基本條件之一,涉及疾病機制研究、治療方法研究、疫苗研究與評價等多個領域。截止至2019 年7 月,在過去30 年里,涉及實驗動物論文中,PubMed 論文數據庫論文154 萬篇,占生物醫學論文的79%,藥學尤其是毒理、安全性評價論文 占85%,Nature、Science、Cell、Nature Medicine、Nature Genetics、Nature Cell Biology、Nature Biotechnology、Jouranl of Experimental Medicine 等國際一流學術雜志有22 萬篇、占77%,而我國在2013～2015 年間則有32844 篇、占7%,從1901～2018 年的81 年度(占頒獎年度的75%)諾貝爾生理學或醫學獎涉及25 種動物,被應用了168 次[1]。

實驗動物質量直接關系著研究和評價數據的準確性、可靠性和可重復性,動物感染烈性傳染病后極易集體死亡、實驗中斷,且攜帶人畜共患傳染病菌動物不僅威脅實驗人員健康,一旦擴散還將產生嚴重的公共衛生安全。如實驗室源性感染事件有2019 年某研究所布魯氏菌感染、2011 年某高校教學山羊布氏桿菌感染[2],實驗動物獲得性病原感染事件有2006 年某高校流行性出血熱感染[3]、2004年實驗室人員感染流行性出血熱[4]、20 世紀末全國各地實驗大鼠和工作人員流行性出血熱高陽性率[5]等。

高校實驗動物中心,為集教學、科研及生產三位一體的公共服務性平臺,支撐了學校及附屬醫院的醫學、藥學、生命科學、化工、農學、材料等多學科教學和科研的重要技術服務。隨著新技術、新研究方法的不斷發展,基因修飾動物亦被作為重要、常用的研究對象,多從不同國家、研究機構引入。動物來源復雜,高?？蒲卸鄬W科、多方向,實驗類型復雜,實驗時間不確定性,學生為主體的實驗人員流量大、流動性強等等,均易造成病原菌的傳入、交叉感染和傳播擴散[6]。本研究旨在總結和探討近年來的病原控制制度和檢測工作成效和心得。

1 建立了病原控制制度

建立并執行了《實驗動物準入制度》,從制度方面加強實驗動物來源管理和質量控制,規范實驗動物進入動物設施。具體措施如下。

1.1 規范動物來源

切斷傳染源,是傳染病控制最有效措施,安全、可靠的動物來源,是實驗動物病原控制的源頭和關鍵。據監測病原檢出率將動物來源分等級:一級(最高級):即至少連續暗檢3 次,病原檢測均為陰性的生產設施動物來源;二級:不滿足一級、三～五級來源的生產設施動物來源;三級:自檢、暗檢、抽檢和常規檢疫中出現非人蓄共患病病原、非動物烈性傳染病病原、一般為條件致病菌陽性的生產設施動物來源,動物退出設施,6 個月內不接收相同來源動物;四級:動物烈性傳染病病原陽性的生產設施動物來源,1 年內禁止該來源動物進入設施;五級:人蓄共患病病原陽性的生產設施動物來源,按國家相關法規法律處理。

進入動物設施的常規動物(含突變系),需提供實驗動物質量合格證明,銷售清單、送貨單/簽收單、近3～6 個月內的實驗動物質量檢測報告(包含實驗動物國家標準要求的相應等級單位病原檢測項目,結果均為合格),境外來源需提供來源機構的獸醫報告(標明病原檢測項目及結果)和海關認可的入關隔離檢疫場所隔離檢疫報告;基因修飾動物原則上均需通過生物凈化(一般是經典的剖宮產代乳凈化技術或體外受精及胚胎移植技術)達SPF級,或達國標清潔級+SPF 級必須檢測和必要時檢測病原檢測合格(以下稱“活檢”) 的相關證明材料[7-9]。

1.2 動物實驗設施功能分區和檢疫管理

高校動物中心可能因歷史原因、不同校區的需求、轉基因動物繁育保種、科研多學科和多方向、實驗類型和來源復雜、學生流動性大等情況,動物設施分布于不同校區、不同樓宇,可按功能進行分區并執行針對性管理措施:

1.2.1 屏障環境繁育區

繁育區使用于基因修飾動物的保種繁育,不涉及動物實驗。進入該區的基因修飾動物必須執行生物凈化或活檢(動物不適用于活檢時,可用同籠飼養至少30 d 以上的哨兵動物活檢替代);進入該區的野生型動物,一級來源的常規動物(含突變系)需經檢測證實監測病原為陰性(監測病原項目詳見表1,每年綜合檢測成本、病原菌的致病性、對常見動物實驗的干擾程度及過往檢測數據,及時持續更新監測病原譜。);二級來源動物則執行活檢。其余情況執行“1.1 規范動物來源”的內容。

表1 2018～2021 年大、小鼠監測病原譜Table 1 Objective monitoring pathogen genealogy of rat and mouse form 2018 to 2021

1.2.2 屏障環境實驗區

該區僅開展動物實驗,禁止繁殖。執行“邊檢疫、邊實驗、重防范”原則,動物進入該區前,一級來源動物需經檢疫期的健康觀察;二級來源動物經檢測證實監測病原為陰性。其余情況執行“1.1 規范動物來源”的內容。

1.2.3 普通環境實驗區

該區僅開展動物實驗,禁止繁殖。進入該區的動物需經檢疫期的健康觀察。其余情況執行“1.1規范動物來源”的內容。

1.2.4 暫養區

該區執行屏障設施的硬件及管理要求,僅用于動物經影像檢測、手術、行為學觀察或其他屏障外操作后,需短期飼養、但又無法返回屏障設施的情況,管理人員嚴格把控實驗動物的飼養規模和周期。

1.3 在養動物的病原監測

1.3.1 病原監測

繁殖區采用哨兵動物監測(臟墊料法)[10-12],監測現行國標清潔級+SPF 級病原,增添國內外流行且對動物實驗影響較大的病原,如小鼠諾如病毒、牛棒狀桿菌等,據監測結果,提供快速預警從而控制病原微生物感染和擴散,并為檢疫期監測病原譜的更新提供數據支持;其他區域主要執行個性化的獸醫護理[13]。

1.3.2 獸醫護理

在獸醫指導、培訓下,每位飼養工作人員、設施管理人員執行日常獸醫護理、巡房工作,觀察動物日常健康狀況,發現異常動物及時上報獸醫,經檢測診斷后執行相應的防控、處理措施。獸醫則對設施進行定期的巡視檢查、獸醫護理工作現場指導、病原控制和動物福利措施的落實情況監督等[13]。

1.4 實驗動物的“點對點”運輸

1.4.1 動物進入設施

因動物來源復雜、實驗者流動性大等情況,動物的運輸除符合國標要求外[9],執行“點對點”動物轉運管理制度,即實驗者聯系供應商訂購動物后,供應商與待進入設施的管理人員執行實驗動物交接,實驗者與設施工作人員將動物接收入設施內。

1.4.2 動物離開設施

屏障設施內待移出的動物,應滿足包裝規范、保障生存環境、有專用通道、不被周圍人群直視等要求,用專用包裝盒,在屏障設施內包裝后方可移出,普通環境移出的動物,需于運輸籠具上覆蓋透氣遮布[9]。

1.5 動物相關用品的監測

應根據國標要求,需定期監測的項目可有:設施環境技術因子、動物相關用品如動物飲用水和墊料、高壓爐的滅菌效果和飼料等[9,14]。

2 病原檢測工作

2018 年以來,在檢測了1481 批次非活體檢實驗動物樣本中,包括動物糞便、皮膚拭子、鼻咽拭子、血清、毛發等,有106 批次病原陽性,其中的15批小鼠肝炎病毒(Mousehepatitisvirus,MHV)陽性小鼠立即撤場,動物執行安樂死后經高壓滅菌器滅菌,動物尸體裝入專用尸體袋存放于尸體冷藏柜,集中作無害化處理。檢疫飼養區域處理如下:管制進出,封閉送風、排風口;使用殺滅病原菌濃度的消毒 液(如 0.13～ 0.26 mol/L 過氧乙酸按0.008 L/m3)對飼養空間、角落、縫隙和物品表面進行噴霧消毒,密封24 h 后,開啟送風、排風口;移出的動物籠具、相關物品及廢棄物等先行高壓滅菌或殺滅病原菌濃度消毒液浸泡消毒后,執行實驗廢棄物相關規定處理;管制進出至少3 個月,重新啟用前,封閉送風、排風口執行區域凈化處理,空氣潔凈度和落下菌數合格后方可投入使用。同時,嚴密監控飼養區域的其他動物,并一年內禁止同來源的實驗動物進入;檢測了395 份活體動物樣本,其中38例病原陽性,檢疫期病原檢測陽性動物均立即退出了設施。非活體動物樣本的監測病原陽性批次比例至2021 年達17.72%,說明動物入場前的病原監測是非常必要的?；铙w檢測的陽性率自2019 年出現下降,則主要是部分基因修飾動物執行了生物凈化。具體情況詳見表2。

表2 2018～2021 年病原檢測Table 2 Pathogen detection form 2018 to 2021

從動物來源方面看,2018 年監測的動物來源有12 家,2021 年已達27 家,呈逐年上升趨勢,動物來源愈趨復雜、多樣,動物質量良莠不齊,但總體質量水平有所提高。詳見表3。

表3 2018～2021 年供應單位來源Table 3 Supply units form 2018 to 2021

3 討論

在上述實驗動物的病原檢測和質量控制過程中,我們發現病原監測是保障實驗動物質量的有效防線。首先,能有效地切斷傳染源,通過設施的功能分區,不同功能區域執行了不同的檢疫制管理度、監測病原譜的及時更新、動物相關用品等的定期檢測,杜絕了攜帶陽性病原的動物和動物用品的進入,使得設施規避了污染風險;檢疫期嚴密監控小鼠肝炎病毒,將數批陽性動物排除在設施之外,哨兵動物的檢測結果也證實了此舉的必要性;鞭毛蟲為陽性檢出率較高的寄生蟲之一,而檢疫期的檢測排除、哨兵動物的監測、在養動物的糞便排查和抽查工作,也是控制該寄生蟲的有效措施;動物飲用水的定期無菌檢測、高壓爐滅菌效果和環境技術因子的定期監測,為設施的水機和高壓爐使用效果是否合格、維護措施是否得當、日常消毒管理工作是否到位等做出客觀的數據支持。其次,陽性病原的檢出,為設施消除了病原傳播隱患,中心曾在老舊設施的動物糞便中,檢出MHV、鞭毛蟲陽性,爾后返回至其飼養區域進行合并樣本排查,發現陽性后,對陽性樣本的覆蓋區域的課題組信息梳理、歸類后,進行課題組合并樣本檢測或單籠檢測,均發現病原陽性動物集中于某一課題組、甚至于同一品系,經綜合分析后考慮,病原為課題組違規操作攜帶進入設施所致。隨之進行的全面排查、定點抽查和哨兵動物監測結果均提示,該病原陽性動物轉入設施的時間較短,發現及時,均未造成擴散傳播?？梢娪行У牟≡瓩z測措施,在阻止病原于設施內的傳播隱患方面效果顯著。

隨著時代的發展,各領域基礎研究突飛猛進,產業發展異常迅猛,各學科交叉融合,國內實驗設施呈井噴狀建設,實驗動物需求量更是暴增,高校實驗動物中心作為重要的基礎性支撐服務平臺,保障實驗動物質量和生物安全防控是平臺核心工作,通過有效的病原控制、優質的科研服務,以期為學?！半p一流”建設和國家相關學科領域發展做出更大的貢獻。