竹子基因資源和應用技術研究進展

徐丹丹，李新林，鄧偉芬，蔣思媛，任慧敏， 王安可，杜旭華，柳參奎，亓果寧*

(1.浙江農林大學 林業與生物技術學院 亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300； 2.龍泉市林業事務中心，浙江 麗水 323700； 3.國家林業和草原局竹子研究開發中心，浙江 杭州 310012)

竹子是多年生禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物，世界上擁有80多屬1 600多種竹類植物，多生長在氣候溫暖濕潤的地區。當前世界竹林面積約2 200萬hm2，而我國擁有其中四分之一左右的竹林面積[1]，因此竹類植物在我國素有“第二森林”之稱。竹子作為我國最重要的經濟林木之一，具有生長快、產量高、用途廣等特點。竹林還具有很強的固碳能力，能穩定大氣中二氧化碳含量，是我國碳中和的重要載體[2]，竹子因此具有重要的經濟價值和生態價值。但是在竹子研究生產的過程中發現竹子開花發育不穩定，導致其遺傳改良進展緩慢。目前在眾多竹種中，只有毛竹(Phyllostachysedulis)和麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)公布了染色體級別的基因組圖譜[2-3]，其余竹種的基因組仍在開拓研究中，加之竹子遺傳轉化體系的建立十分緩慢，很大程度上限制了竹子種質資源的創新。

近年來，國內外許多學者在竹子基因組、再生和轉化體系等方面進行了深入研究，并取得了一定的進展，基于此，該文對竹子基因組、功能基因、組織培養、遺傳轉化和應用前景等進行綜述，總結了目前研究存在的問題，并提出可能的解決方案，為現代竹子種質創新提供參考。

1 竹子組學研究進展和關鍵功能基因的挖掘

1.1 竹子組學研究進展

基于竹子重要的經濟效益和生態效益，通過組學方法解析其生物學特性的研究結果也在日益增加。2013年Peng Z H等完成了對毛竹的基因組測序，該測序結果公開了1個高質量的毛竹基因組序列草圖，2.05-Gb的基因集覆蓋了95 %的基因組區，95%以上區域的高質量序列由毛竹基因組150倍覆蓋率的原始序列組裝，組裝scoffolds N50長度超過328 kb，其中包含32 000個約占毛竹基因總數90%的基因[3]。2017年，Zhao H S等啟動了竹和藤基因組圖譜(Genome Atlas of Bamboo and Rattan，GABR)項目，GABR的核心項目之一是Bamboo-T1K(1 000種竹子的轉錄組)，通過采集不同國家不同區域的竹子和藤樣本并對其進行測序，最終生成了大規模的組學數據，以此推動基礎分子生物學研究到應用基因工程的竹藤基因組研究。截止目前已經采集了從馬來西亞、加納、肯尼亞、埃塞俄比亞、巴西和中國的許多地方約340種竹子和2種藤樣本。其中有超過300種竹子和2種藤將被測序[4]。Zhao H S等在2018年將毛竹基因組完善至高精度的染色體水平，提供了毛竹染色體水平的從頭基因組組裝scoffolds N50長度達到79.90 Mb，約為之前版本的243倍的基因組數據。除此之外，還鑒定出51 074個結構完整的高質量蛋白質編碼位點。在對26個具有代表性的竹子組織進行轉錄組測序后，發現在25 225個選擇性剪接(Alternative Splicing，AS)基因中鑒定了266 711個獨特的AS事件，從而提供了1個全面的AS圖譜。研究發現，在竹類植物中，AS作為1個重要的生物過程，AS基因集中在更保守的基因中，這些基因具有更高的轉錄水平，組織特異性差異較大[5]。在2021年，Zhao H S等從覆蓋15個代表性地理區域的427毛竹個體的全基因組重測序中獲得545萬個單核苷酸多態性位點(SNPs)，以此獲得了毛竹基因組變異圖譜，并對9個重要的性狀、形態學特征、物理(密度)和機械性能相關性進行全基因組關聯分析，以識別候選基因[6]。Yu X L等通過定量蛋白質組學確認了毛竹10 376個預測編碼基因，蛋白質組分析還揭示了1 015個預測長非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)的蛋白質編碼潛力，占注釋lncRNA的51.03%。因此，基于質譜的蛋白質組學為基因注釋提供了可靠的方法[7]。

除毛竹外，研究學者還對麻竹開展了研究，早在2011年Gao Z M等已經以麻竹幼葉為材料構建歸一化cDNA文庫，共獲得9 574個高質量表達序列標簽(Expressed Sequence Tags，ESTs)，其中unigenes 5 317個，contigs 1 502個，singletons 3 815個[8]。2012年Liu M Y等對麻竹進行了從頭轉錄組測序，建立了1個完整的數據集，測序產生了15 138 726個reads，將它們組裝到103 354個scaffolds后共鑒定到68 229個unigenes，這些麻竹特有的基因有助于更好地了解麻竹的基因多樣性[9]。Zhao H S等則在2013年獲得了麻竹的11 513 607個原始序列reads，鑒定出了81個新miRNAs，獲得了162個潛在靶點，這些靶點是植物生長發育中發揮重要作用的轉錄因子，通過對miRNAs的鑒定為麻竹及相關物種的研究提供了理論基礎[10]。Guo Z H等還構建了1種六倍體麻竹的高密度遺傳連鎖圖譜[11]。Tu M等對麻竹愈傷組織芽器官發生的5個階段的組織樣本進行測序，獲得了73 209個高質量的非冗余性轉錄本亞型，長度主要在1 000～3 000 bp之間。同時還預測了72 576個編碼序列(CDSs)，N50值為1 176 bp，相關蛋白序列為68 269個，該數據為后續麻竹的基礎研究和應用研究提供有價值的資源[12]。Zheng Y S等在2022年首次破譯并組裝獲得染色體水平的六倍體麻竹分型基因組，大小為2 737 Mb，contig N50和scoffolds N50分別為2.57和4.5 Mb。該研究將麻竹組裝成3個分型亞基因組(AABBCC)，共注釋了135 231個蛋白質編碼位點，發現兩套分型染色體之間存在大量單核苷酸變異(SNVs)和插入缺失標記(InDels)，該結果為深入研究亞基因組的進化關系及等位基因特異性表達奠定了基礎。這一高質量的六倍體基因組和全面的鏈特異性轉錄組數據集將為以麻竹為模式物種進行竹子研究奠定基礎[2]。

Li W等在2021年發布了高質量的二倍體草本竹子(Raddiadistichophylla)589 Mb全基因組草圖，測序共產生了253.94 Gb的短測序reads，contigs和scoffolds的N50長度分別為86.36 kb和1.81 Mb，共注釋了30 763個基因，平均轉錄本大小為2 887 bp，該竹子基因組序列將為全球竹子物種的生物研究、種質保護等提供新的見解[13]。

基于目前數個竹種基因組數據的公布，研究學者們在此基礎上不斷開展對竹子基因家族鑒定和特性研究，比如細胞壁生物合成關鍵基因家族HCT(hydroxycinnamoyl-CoA, shikimate/quinate)和 CCR(cinnamoyl CoA reductase)[3]、萌發延遲(Delay of Germination1，DoG)家族[14]、 泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，UBP)等基因家族[15]。竹子基因家族的鑒定與研究為竹子品種創新提供了候選基因和理論支撐，有利于推動竹子種質資源的發展。雖然目前有了毛竹和麻竹的基因組數據，但對龐大的竹子家族而言竹子的基因組學仍需要不斷地研究和完善，隨著新測序技術的不斷更新，基因組學相關研究實現快速發展，以高通量測序技術為基礎的各種組學研究廣泛應用于竹子等植物的各個領域。測序技術的成熟加上測序成本的降低，越來越多的竹子品種的基因信息被破解。而竹子的全基因組測序工作仍需繼續推進，毛竹等竹種的功能基因組學研究遠不及水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等農作物，因此建立1種包含基因組、轉錄組、蛋白組等相關數據的綜合性數據庫顯得尤為重要。

1.2 竹子關鍵功能基因

基于毛竹和麻竹基因組數據的公布，在其各自生長發育過程中發揮重要作用的關鍵基因陸續被鑒定出來，以下針對已有的相關研究進行總結。

1.2.1毛竹莖竿快速生長相關基因 竹子具有生長快、產量高和材性好等諸多特性，是可快速補充的可再生資源，可作為木材的良好替代品。作為速生樹種，竹子具有比普通樹種高35%的吸收二氧化碳和釋放氧氣的能力，對環境保護至關重要，在實現碳達峰碳中和中具有至關重要的作用。為了更好地運用竹子的生長優勢，該文整理和總結了近年來竹子快速生長方面的研究成果。根據前人研究可知竹子的快速生長與光合作用、油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)生物合成和苯丙素生物合成有關。大多數竹種都有木質化的高大莖竿，竹子木質莖的快速生長可視為竹子的重要特性。Jin G H等在毛竹的進化過程發現竹系特有的1 622個基因，這些基因被稱作“孤兒基因(特有新基因)”，“新基因”與表達分化的全基因組加倍(WGD)基因都在莖竿快速生長模塊中高度表達，說明毛竹的快速生長受到這些基因的影響[16]。天門冬氨酸蛋白酶(Aspartic proteases，APs)是一類天門冬肽酶，Wang X Q等研究發現毛竹中的AP基因(PhAPs)表現出組織特異性表達模式，并可能通過整合光和赤霉素等環境信號影響毛竹快速生長，包括細胞程序性死亡、細胞分裂和伸長[17]。Huang B等發現PeLBDs基因在竹筍快速生長過程中表達，PeLBD20、PeLBD29、PeLBD46、PeLBD10、PeLBD38和PeLBD06的表達與竹筍的快速生長發育呈正相關。其中正相關性關系最顯著的是PeLBD20和PeLBD38，推測它們在毛竹快速生長期起著重要的生物學作用[18]。Zhang Z J等發現PeDoG基因家族也與毛竹早期枝條的快速生長有關[14]。Huang B等發現毛竹的熱休克轉錄因子(Heat shock transcription factor，HSF)PeHsfs在芽快速生長過程中特異表達[19]。Niu L Z等以蕓香竹(Boniaamplexicaulis)作為研究對象，揭示了DNA甲基化在調節竹筍快速生長中的重要性，并表明DNA甲基化與木本竹的發育時間或年齡有關。Guo X Q等從毛竹中分離出了9個酸性轉化酶(Acid invertases，INVs)，包括7個細胞壁酸性轉化酶(PhCWINV1—7)和2個液泡酸性轉化酶(PhVINV11、PhVINV12)。酶活性分析發現INV活性在快速生長的組織，如莖節間的延伸部位顯著升高，且分別在持續表達PhCWINV1、PhCWINV4和PhCWINV7的轉基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)中其株高明顯高于對照植株，說明INVs能促進植株株高的生長，因此猜測INVs在竹子的快速生長方面也發揮著一定作用[20]。同源異型盒轉錄因子KNOX(KNOTTED1-likehomeobox)通過調控靶基因來維持分生組織中的激素，在毛竹莖竿的快速生長中發揮著重要作用。劉青等克隆了麻竹DlKNOX基因，發現DlKNOX在節部的表達豐度最高，為日后進一步研究DlKNOX在麻竹莖竿發育中的功能奠定了基礎[21]。Wei Q等通過轉錄組和qPCR分析發現在孝順竹(Bambusamultiplex)中糖分可能通過抑制蔗糖非發酵-1基因(sucrose non-fermenting 1，BmSnf1)的表達來促進節間的快速生長[22]。以上研究，為后續深入探索毛竹快速生長的分子機制奠定了基礎，同時為培育竹子新品種提供了候選基因。此外，單堿基甲基化分析揭示全基因組DNA甲基化的動態變化和木本竹子莖部的快速生長具有相關性[23]。

1.2.2毛竹木質化相關基因 木質素屬于次生細胞壁結構的重要組成部分，羥基肉桂酰輔酶a(hydroxycinnamoyl-CoA，shikimate/quinate，HCT)和肉桂酰輔酶a還原酶(cinnamoyl CoA reductase，CCR)家族蛋白作為關鍵酶可以催化苯丙素途徑產物轉化為木質素[3]。Wang J L等認為在毛竹中，苯丙素中間體可能通過苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)或者4-香豆酸輔酶a連接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase ，4CL)的催化作用轉化為木質素或類黃酮。推測PAL和4CL可能在該轉化過程中發揮著重要作用[24]。NAC(NAM，ATAF和CUC)轉錄因子已被證實在許多生物學過程中發揮重要作用，包括芽頂端分生組織的形成和維持、激素信號、細胞分裂，尤其是調控次生細胞壁(Secondary Wall，SCW)的合成[25]。Shan X M等通過對毛竹NAC家族的研究，發現了毛竹PeNAC8、PeNAC36和PeNAC73作為轉錄激活因子可能通過調控細胞次生壁合成參與木質化過程[25]。Que F等研究發現PeTALEs(Transcription Activator Like Effectors，TALE)在毛竹次生細胞壁的生長發育中起著重要的調控作用，該基因家族PeBLH11、PeKNOX11、PeKNOX13、PeKNOX2、PeKNOX3、PeKNOX5、PeKNOX7和PeKNOX9可能參與了快速生長階段次生細胞壁木聚糖合成的調控[26]。Yang Y等研究發現尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(Uridine diphosphate glucose dehydrogenases，UGDHs)是毛竹細胞壁合成的關鍵酶，該酶的編碼基因是PeUGDH4[27]。毛竹木質化的研究，為進一步探究竹子快速生長與細胞壁結構代謝過程的相關性提供參考。

1.2.3竹子花發育相關基因 竹子開花期不穩定，頻率低，且大多數竹子開花后集體枯萎，這會導致竹林面積減少，竹子產量降低，造成嚴重的經濟損失和生態環境破壞。因此，研究參與竹子開花發育的關鍵基因十分必要。在該文中我們對目前已有的相關研究進行總結。張穎研究發現毛竹PheDof-1(DNA binding with one finger，Dof)在花發育的早期具有很高的表達，其中PheMADS-14在毛竹花器官中表達最為明顯[28]。Peng Z H等發現在開花基因網絡中，開花關鍵基因CONSTANS和花途徑整合因子(Floral Pathway Integrator，FPI)的調控序列中發現插入片段，導致其表達量降低，毛竹長時間營養繁殖導致花發育遲緩[3]。Dutta S等發現bZIP家族BtFD1參與了花和營養發育，而且對開花具有正向調控作用。BtFD1的組成型表達導致植株矮化，花梗長度和花/植株數明顯減少，表明BtFD1基因的及時表達可能是其在植物中發揮程序性發育作用的關鍵[29]。Hou D等從綠竹(B.oldhamii)中鑒定到1個SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1 (SOC1)基因過表達抑制子BoMADS50，BoMADS50在成熟葉片和花原基形成時期高表達，BoMADS50與BoAP1蛋白在調控綠竹開花過程中具有協同作用。與此同時，還發現BoMADS50和BoMADS50-1/2/3/4可能是該竹重要的正開花調節因子[30]。Dutta S等發現毛竹中可能存在CONSTANS(CO)-FLOWERINGLOCUST(FT) CO，FT基因拷貝數的增加和表達差異的增加在光周期介導的竹子開花過程中起著重要作用[31]。Zhang Y T通過對毛竹的MADS-box基因在花器官和葉片中的表達分析發現PeMADS5作為開花激活因子，參與了毛竹的開花過程[32]。Huang B等發現PeLBD12、PeLBD44、PeLBD30和PeLBD22在毛竹圓錐花序中顯著高表達，提示它們可能參與了毛竹花的發育。除此之外，還發現了在花中特異表達基因PeLBD25[18]。Huang B等基于熱休克轉錄因子(Heat shock transcription factors，HSF)在毛竹不同組織中的表達譜，發現許多PeHsfs在穗部表現出較高的表達水平，這些PeHsfs基因可能參與了毛竹穗部發育[19]。在麻竹中，高志民等發現麻竹DlMADS18可能參與其開花時間的調控[33]。陳東亮研究發現DlAP2可能具有促進麻竹開花的功能[34]。Fan H J等則通過轉錄組分析發現DlFT1在麻竹中表達顯著上調，而DlFT1的表達受DlCO1調控，提示麻竹中可能存在CO-FT調控模塊，這些結果表明DlFT1是1個具有促花功能的候選基因[35]。Cheng Z C等人發現毛竹Phe-miR159通過調控AtMYB33表達，負向調節花藥內皮層次生增厚相關基因表達，最終影響花藥開裂[36]。以上研究對未來竹子花發育相關的關鍵功能基因挖掘提供了研究方向。

1.2.4竹子生長發育相關基因 生長調節因子(Growth-Regulated Factors，GRFs)在植物整個生長發育過程中有著重要作用。Shi Y N等從毛竹基因組中鑒定了18個GRF基因，并從中篩選出了在不同組織中表達水平較高的基因PeGRF11[37]。Guo Z H等在木本竹子中發現類SOC1基因的缺失/故障、PRR(Pseudo-Response Regulator)基因的正向選擇以及GA(Gibberellin)通路關鍵酶編碼基因的拷貝數變異共同調控了木本竹子的營養生長期[11]。在毛竹的整個生長發育過程中，細胞分裂在毛竹生長前期發揮關鍵作用，細胞伸長則在生長后期起著主要作用。Li L等研究發現在毛竹生長發育過程中，E2F/DP轉錄因子對細胞周期的表達起著調控作用，并且當毛竹受到非生物脅迫時，PheE2F/DPs的表達水平顯著升高，說明毛竹可能通過轉錄調控響應非生物逆境[38]。泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-Specific Proteases，USPs)是去泛素酶中最大的一類，調控植物的發育和脅迫反應。Wu R H等發現在毛竹葉片PeUBP大部分基因出現高表達，說明PeUBP可能參與了葉片的生長發育[15]。Huang B等研究發現毛竹HSF在穗和嫩枝中大都有很高的表達，說明它們可能在毛竹的生殖生長和嫩枝的快速生長中發揮著重要作用[19]。磷脂酰-乙醇胺結合蛋白(PEBP)家族對毛竹地上分枝和地下側芽的發育均有調控作用[19]。Zhao J W等研究后發現PheTFL9、PheTFL2和PheTFL8可能通過激活休眠芽而促進毛竹生長發育[39]。

隨著麻竹基因組數據的公布，調節麻竹生長發育的關鍵基因也有所研究。Qiao G R等通過對麻竹基因共表達網絡分析，發現EXPB3和TCP可能在細胞分裂和分化中起調節作用[40]。赤霉素(Gibberellic Acid，GAs)在植物生長發育的整個過程中發揮著調控作用。目前已經從麻竹中成功分離獲得GAs 信號轉導途徑中的關鍵基因DlmDELLA[41]。之后Jin K M等在麻竹基因組中鑒定到66個編碼TCP轉錄因子的基因，并在DlTCPs的啟動子區發現了與生長發育和應激反應相關的順式作用元件，而且DlTCPs在嫩枝和葉片中表達較高。進一步研究發現DlTCP12-C是OsTB1的同源基因，是側芽出芽的關鍵節點基因，對腋芽發育和側枝生長發揮負調控作用[42]。

1.2.5其它關鍵功能基因 對于竹子而言，它們的生長發育受到多種因素的影響，例如溫度，水分和生物脅迫等。Cheng X R等在毛竹中鑒定到35個三螺旋轉錄因子(Trihelix Transcription Factors，TTFs)，其中PeTT19和PeTT35在葉片中均有高表達，推測這2個基因與氣孔或光合作用相關；PeTTF27表達受SA、ABA和MeJA顯著誘導；部分PeTTFs在干旱和鹽脅迫下表達變化明顯，暗示這些基因在毛竹響應非生物脅迫反應中發揮著關鍵的調控作用[43]。Ma R F等發現毛竹鋅指轉錄因子PeYABBYs含有大量的激素響應元件和應激響應元件，包括GA響應元件(GAREs)、厭氧響應元件(ARE)等，說明PeYABBYs基因可能參與植物激素的響應過程。研究發現在毛竹生長發育過程中YABBY高度富集并參與植物葉片發育[44]。Jin K M等發現所有的膨脹蛋白PeEXs都有ABA響應元件，尤其是PeEXPA1、PeEXPA20、PeEXPB5和PeEXLA4，這些基因在非生物脅迫下可能積極參與相關信號通路的調控，其中PeEXPA19與ABA響應密切相關[45]。Wang T T等發現PeGATAs與毛竹非生物脅迫有關，可能對赤霉素和脫落酸有響應，PeGATA9與竹子根莖細胞生長呈負相關，而側芽的細胞生長則受到PeGATAs的負向調節作用[46]。Wu M等對毛竹WRKY轉錄因子家族成員進行了全基因組鑒定，發現PeWRKY83是通過調控脅迫誘導產生的ABA合成在耐鹽性中發揮積極作用[47]。PheWRKY72-2可能通過作為氣孔關閉的正向調節因子來增強植物對脅迫的耐受性[48]。在PeLBDs啟動子中含有MYB結合位點，參與干旱、高鹽和低溫反應的誘導[18]。Zhang Z J等發現PeDoGs作為bZIP轉錄因子可能通過調控Polarlike1 (PL1)基因的表達在毛竹中發揮疾病應答作用[14]。Wu R H等對所有PeUBP基因的啟動子進行分析，發現了許多與ABA、MeJA和SA相對應的順式調控元件，表明PeUBPs在植物發育和脅迫響應中發揮作用[15]。擬南芥在茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)處理下可導致在植物防御中發揮重要作用的硫代葡萄糖苷(glucosinolate)水平的升高。PeIQDs在PEG和MeJA處理下均被增加或抑制，推測毛竹IQD基因在抵御食草性昆蟲和干旱脅迫方面可能具有類似的生物學功能[49]。Huang B等對PeHsf啟動子順式元件進行分析，發現毛竹HSFs的表達受植物發育過程和非生物脅迫響應相關順式元件的調控，熱響應是PeHsf蛋白的主要功能，PeHsf轉錄因子還參與大分子生物合成、RNA生物合成、氮化合物代謝、細胞生物合成、初級代謝以及RNA代謝過程的調控[19]。Xiang M Q等對麻竹的研究發現過表達玉米leafcolor(Lc)基因，可以獲得花青素水平顯著提高的麻竹轉基因株系，從而提高了麻竹對低溫和干旱脅迫的耐受性[50]。

2 竹子組織培養和遺傳轉化體系研究現狀

2.1 竹子組織培養研究

竹子組培研究起步始于1968年，但研究進展相對遲緩，直到20世紀80年代國外學者才較為系統地進行了竹子組織培育研究的工作。通過組培方式進行竹子培育, 被認為是中國加快發展竹子生產的一個新途徑[51]。近年來，叢生竹類竹子組織培養的研究成果約占90%，散生竹和混生竹也有不少研究報道。該綜述以不同竹種為研究對象，對現有竹子組織培養的科學研究工作進行了總結，進一步革新了竹子培育技術和優化竹子培育方法, 為后續竹子再生和遺傳轉化體系的完善提供參考，為竹子的合理利用提供理論基礎，以更好地實現竹子的生態、社會價值和效益[52]。

研究者們目前已經建立了包括以筍用為主的筍用竹[53]、常綠小喬木多花山竹子(Garciniamultiflora)[54]、混生竹類矢竹(Pseudosasajaponica)[55]；散生竹類黃甜竹(Acidosasaedulis)[56]、毛竹[57]、雷竹(Ph.violascens‘Prevernalis’)[58]、佛肚毛竹(Ph.edulisf.ventricosa)[57]；叢生竹類曙箣竹(Sasaversicolor)[59]、馬來甜龍竹(D.asper)[60]、糯竹(Cephalostachyumpergracile)[61]、孝順竹[62]、慈竹(B.emeiensis)[63]、巨龍竹(D.sinicus)[64]、版納甜龍竹(D.hamiltonii)[65]等竹種完整的再生體系。以上研究大大推動了竹子的培育進程。

2.2 竹子組織培養影響因素

竹子再生是無性繁殖的過程[66]。該文從不同方面歸納總結了不同竹種的組織培養再生體系，包括竹子外植體的選擇、培養基種類、生長調節劑與添加物和抑制褐化方式等。

(1)外植體：外植體的選擇是開展竹子組織培養的第一步，已有研究表明，種子、播種苗枝條、以芽繁芽、胚培養、芽尖、根等許多組織或器官都可以作為竹子進行組織培養的外植體。不同的竹種選取的外植體種類不同，多數采用幼嫩莖段、成熟的種胚和嫩芽為再生的材料，它們具有快速長成根狀莖或者迅速再生的優勢。此外，有一些竹種采用其它材料作為外植體，如王曙光對巨龍竹開展研究后發現種胚和小穗莖節更合適作為外植體誘導愈傷組織[64]。喬桂榮以麻竹花藥為外植體，成功誘導出了體胚并直接分化成苗[67]。以上研究表明了不同竹種組織培養選擇外植體不同，合適的外植體能快速促進愈傷組織的誘導發育。

(2)培養基：植物組織培養的培養基是影響再生體系是否成功的重要因素之一。目前，大多數竹子組培的基礎培養基為MS(Murashige and Skoog)培養基，也有一些竹種采用1/2 MS和3/4 MS培養。唐磊研究發現以圣音竹(Ph.edulisf.tubaeformis)當年生嫩芽為外植體時，最適合的基礎培養基為3/4 MS，新萌發嫩芽則采用1/2 MS[68]，江濤研究發現毛竹幼芽在MS1培養基上擴繁和分化效果最好[69]。覃和業等對麻竹生根培養基的研究發現，1/2 MS為基礎的培養基誘導的生根苗移栽成活率均在80%以上，總體上優于MS培養基[70]。

(3)生長調節劑與添加物：生長調節劑是影響植物愈傷組織生長發育的重要因素之一。通過對已發表的竹子整個組織培養過程的研究和歸納，發現IBA、2,4-D、NAA等生長素使用廣泛，6-BA、KT是常用的細胞分裂素。竹子不同的組織培養時期，培養基使用的生長調節劑和添加物也不同。以黃甜竹為例，王舒對不同時期組織培養基的成分進行研究，發現添加2,4-D、6-BA、KT的培養基是最適宜的愈傷組織誘導培養基，而叢生芽誘導的培養基添加6-BA、KT、TDZ、NAA，叢生芽增殖和再生植株生根的生長調節劑也有所不同[56]。江濤研究發現毛竹在MS+3 mg·L-1NAA條件下愈傷組織生根比率最高，達到(47.71±3.98)%[69]。徐振國等為了提高麻竹的扦插生根率，在基礎培養基中添加泥炭，激素選擇為NAA，激素濃度處于40～80 mg·L-1時扦插苗各指標最佳；泥炭+生根粉ABT+80 mg·L-1NAA為最佳處理組合[71-72]。

(4)褐化：褐化是影響組織培養效果的重要影響因素之一，嚴重的褐化會導致組培材料的死亡。因此，研究學者對如何減少褐化問題開展了許多研究，發現抑制褐化可以采用抗氧化劑、改變光照和溫度等方法。不同的竹種抑制褐化采取的措施不同，趙康對佛肚毛竹防褐化研究中發現接種前用100 mg·L-1的半胱氨酸浸泡種胚，在培養基中添加10 mg·L-1抗壞血酸后置于黑暗環境培養能有效地抑制褐化現象[57]。而唐磊對圣音竹的研究發現，在培養基中同時添加100 mg·L-1PVP和40 mg·L-1Vc后可以有效地抑制褐化，使褐化率降低到16%[68]。

總體來說，竹子組織培養體系已經越來越完善，但是依然存在一些難以解決的問題，如組培材料的污染是最常見的問題，在外植體初培養階段最容易污染，造成的原因可能是材料帶菌，也有可能是接種污染，因此組織培養的第一步就需要做到盡可能無菌。褐化和玻璃化也是組培過程中常見的問題，造成褐化的原因有很多，包括非酶促褐變和酶促褐變，“玻璃化”是組織培養過程中特有的1種生理失調或生理病變[52]，為了解決這類問題還需進一步改善培養基的配方。

2.3 竹子遺傳轉化研究

隨著毛竹基因組和麻竹基因組數據的公布，與竹子重要經濟性狀相關的候選基因陸續被挖掘，建立完善高效的遺傳轉化體系對于研究竹子關鍵基因的生理功能顯得尤為重要。隨著不同竹種組織培養技術體系的不斷完善，目前已經有許多研究學者發表了竹子遺傳轉化體系，推動竹子種質資源的創新研究。植物遺傳轉化最常見的技術為農桿菌介導法，例如麻竹[73]、馬來甜龍竹[60]等大多數竹種已經建立農桿菌介導轉化體系。諸葛菲通過農桿菌介導法成功培養了具有花青素合成相關調節基因的馬來甜龍竹芽尖愈傷組織[60]。張寧采用農桿菌轉化版納甜龍竹抗性愈傷組織獲得了轉基因的白化苗，愈傷組織和再生苗通過檢測證明GUS基因已經成功轉入版納甜龍竹[65]。張玲等利用農桿菌介導法獲得表達codA基因的麻竹轉基因植株，提高了麻竹的耐低溫能力[73]。但是農桿菌轉化受到眾多因素的影響，比如菌株侵染時間、共培養時間等。為了構建更加高效穩定的竹子遺傳轉化體系，研究學者探索出了新的方法并通過實踐得以驗證。諸葛菲采用基因槍介導法將綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)導入馬來甜龍竹芽尖愈傷組織中[60]。CRISPR/Cas9等第三代基因編輯技術是1種高效的基因位點特異性編輯技術，但在竹子中的應用少之又少。葉善汶完善了毛竹的瞬時轉化相關體系，成功驗證CRISPR/Cas9體系可以應用于毛竹原生質體[74]。之后Ye S W等對竹子原生質體中的CRISPR/Cas9系統進行了優化，利用玉米UBI作為啟動子驅動Cas9表達構建了UBI-Cas9/OsU6b-sgRNA，應用于麻竹內源基因編輯。利用CRISPR/Cas9技術對六倍體麻竹進行了基因改造，在第一代轉基因株系中獲得了純合子突變，得到一株株高改變的竹子突變體。2022年Huang B Y等首次建立了毛竹的遺傳轉化體系，以毛竹未成熟胚為外植體誘導不定芽和愈傷組織分化，在此基礎上，利用PeU3.1 snRNA啟動子驅動sgRNA表達，在毛竹中實現了基于CRISPR/Cas9的基因組編輯，這些技術體系將有利于毛竹重要基因的生理功能驗證[75]。以上這些證明CRISPR/Cas9在竹子中的適用性，一定程度上促進了未來竹子功能基因的研究和育種[76]。隨著生物技術的發展，竹子轉基因體系也不斷更新和進步，但不同竹種遺傳轉化體系的建立仍存在許多難題。目前最新獲得的毛竹遺傳轉化體系以胚作為外植體材料，存在如果胚齡過小，幾乎透明，沒有明顯的芽點，而高成熟度胚難以從硬胚乳和種皮中分離出來等問題[75]。雖然麻竹、毛竹等竹種的遺傳轉化體系已經建立，但仍有大部分竹種的遺傳轉化體系還在探索中，研究學者也在尋找除了傳統的遺傳轉化方式之外的新方法。對于難以再生的竹種，可根據竹子體細胞胚誘導率高低的類型構建再生植株；也可以通過優化轉基因技術以及人工培養條件采用基因編輯技術等構建竹子的遺傳轉化體系，竹子原生質體—原生質體融合—原生質體復壁成細胞團—植株再生的實驗路線，也是有效改進竹子遺傳育種技術的手段[66]。綜上所述，竹子組織離體培養再生的過程既受到外部環境的影響，又受到竹子自身條件的制約。如何不斷完善竹子遺傳轉化體系，為竹子種質資源的創新提供更多高效途徑是未來研究的重點。

3 應用與展望

如今，竹子的基因組和關鍵功能基因的挖掘越來越多，但仍存在欠缺，包括至今只有毛竹、麻竹有發布相關基因組，其余很大一部分竹種還在探索中，未來需要不斷完善已公布的竹種基因組和研究發現新的竹種基因組，這將會是一項巨大的工程。其次，對竹子關鍵基因的挖掘還需進一步拓展，某些關鍵功能基因還未被發現和驗證，而竹子功能基因的驗證需要運用遺傳轉化體系，目前已經有許多研究學者開展了新的植物轉基因技術研究，包括采用竹子花葉病毒、納米材料和花粉等遺傳轉化的方法。關于納米材料和花粉以及花葉病毒的應用已經有研究學者在其它物種中開展研究，且已發表了系統的文章和方法。Kwak S Y等在擬南芥中實現了用納米顆粒介導的葉綠體轉基因的方式，葉綠體轉化不存在外源基因向雜草親屬擴散的問題，可以作為成熟植物的一種轉化方式[77]。Li S J等發表了1種運用納米孔的方法來確定大豆基因中插入玉米Ds轉座子，這種方法同樣適用于其它生物體，該方法還可以用靶向單個轉基因的探針定位植物體內插入的轉基因，是一種有效的轉基因方式[78]。Lv Z Y等報道了1種新的轉基因方式，通過花粉轉染，將外源基因成功地轉入了玉米自交系，并成功表達，其后代同時還具有高度的遺傳穩定性，為以胚芽進行基因編輯育種材料的遺傳轉化提供了借鑒[79]。Zhao X等利用磁場轉染花粉，將外源DNA附在具有磁性的納米顆粒上，通過磁場傳遞到花粉中進行授粉，獲得轉基因植株使得后代帶有目標基因，該方法對新品種的育種有很大的參考意義[80]。Bouton C等研究出利用狐尾花葉病毒(Potexvirus)作為載體，在插入目標基因后GFP可以在小麥和玉米中瞬時表達[81]。隨著轉基因技術的發展和進步，未來有望將這些新技術應用到竹子遺傳轉化中。

因此，在前人研究的基礎上，我們可以通過借鑒和參考，推動為竹子種質創新研究的新發展。提高測序技術和分子生物學技術、建立系統完善的組織培養體系、創新轉基因技術以及探索現代竹子應用新方向是今后的研究重點。竹子是目前研究的熱門植物，未來對于竹子種質創新的研究將會越來越進步和完善。