MTSS1可抑制鼻咽癌細胞的轉移能力

蔡豐 徐露 徐洪波 周燕 汪庚明

摘要：目的研究MTSS1對鼻咽癌轉移能力的影響;方法首先通過建立裸鼠鼻咽癌肺轉移模型觀察移植瘤與轉移瘤中MTSS1的表達差異，進而在細胞水平通過transwell實驗檢測過表達MTSS1后細胞的侵襲轉移能力改變;結果裸鼠實驗發現MTSS1在肺轉移瘤中的表達較移植瘤低，細胞實驗發現過表達MTSS1后鼻咽癌細胞的轉移能力降低;結論：MTSS1抑制鼻咽癌的侵襲轉移，可抑制鼻咽癌細胞的轉移能力。

關鍵詞：MTSS1;鼻咽癌;裸鼠;肺轉移模型

【中圖分類號】 R766.3 【文獻標識碼】 A ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）06--02

ABSTRACT：objective：to study the effect of MTSS1 on the metastasis of NPC and its possible mechanism.Methods：The expression of MTSS1 in the transplanted tumor and the metastatic tumor of NPC in nude mice was observed，at the cellular level，Transwell Assay was used to detect the expression of MTSS1 in lung metastatic tumors.Results：The expression of MTSS1 in lung metastatic tumors was lower than that in transplanted tumors in nude mice，conclusion：MTSS1 can inhibit the invasion and metastasis of NPC cells and inhibit the metastasis of NPC cells.

在我國，鼻咽癌是發病率最高的頭頸部腫瘤之一，且死亡率高、預后差，患者確診時多已發生的頸部淋巴結轉移[1];因次，闡明導致鼻咽癌疾病進展和轉移的機制至關重要[2]。MTSS1基因最初在轉移性膀胱癌中被鑒定[3]，隨后在食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌中均被證實表達上調[4-6]。而在鼻咽癌中研究較少，故我們探索了MTSS1在鼻咽癌轉移過程中的作用及可能的分子機制。

1 材料與方法：

1.1主要試劑

DMEM、胎牛血清購自HyClone公司，逆轉錄及PCR試劑盒購自Thermo scientific，qPCR試劑盒、嘌呤霉素購自廣州復能基因，胰蛋白酶購自GIBCO公司，MTSS1基因引物、GADPH內參引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，MTSS1過表達載體由廣州復能基因構建合成，脂質體2000（購自Invitrogen，USA），

1.2細胞株

人鼻咽癌細胞株SUNE1-6-10B購自中科院上海生命科學研究院

1.3裸鼠

BALB/c-nu雌性裸鼠，年齡8周，購于南京斯科瑞生物科技有限公司。合格證號：SCXK（蘇）2011-0003

1.4裸鼠培養及成瘤模型建立

由BALB/cA近交系產生的BALB/c-nu裸鼠，胸腺未正常發育，抵抗力差，所以飼養環境要求較高，且易感染死亡，常用于研究腫瘤化療藥物。本實驗的裸鼠食用的飼料、飲用水均通過高壓蒸汽滅菌。

由于腋下血供豐富易于成瘤，注射操作相對簡單易行，將總量為0.1ml的1×106/mL的鼻咽癌（SUNE1-6-10B）細胞株注射于裸鼠腋下。黃劍等[7]將鼻咽癌細胞接種于裸鼠皮下，并建立了自發性高淋巴道動物轉移模型;韓春等[8]也用5-8F鼻咽癌細胞株成功建立肝轉移動物模型。此方法已在多數學者的研究中用到。

將鼻咽癌上皮樣細胞的濃度調整到1.0×106個/mL，用24號注射器皮下注射0.1 mL到8周齡大小無胸腺裸鼠的腋下組織，當裸鼠出現厭食、消瘦、腹水、活動能力下降等情況后處死。裸鼠處死后立即解剖取腋下移植瘤與肺組織的轉移瘤常規固定和石蠟包埋，切片并對其進行HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織形態，確認為癌組織。

1.5免疫組化檢測MTSS1在肺轉移瘤與移植瘤中的表達

組織化學方法：采用EnVision法免疫組織化學技術行MTSS1染色。a石蠟切片常規脫蠟至水，PBS洗3×3 min。0.3%H2O2抑制內源性過氧化物酶室溫下20 min。PBS洗3×3 min。兔抗人MTSS1多克隆抗體工作濃度1：100 37℃1 h。PBS洗3×3min。Envsion試劑37℃30 min。PBS洗3×3min。DAB顯色8～12 min。蘇木素襯染，熱水藍化。吹干后，樹脂封片后電鏡下觀察。

1.6過表達MTSS1的SUNE-1-5-8F細胞株建立

將50萬個細胞接種于6孔板中，向每孔中加入含2ug慢病毒載體的脂質體2000（Invitrogen，USA），培養48小時后，加入終濃度為2ug/ml的嘌呤霉素培養2周，采用無線稀釋法篩選出穩定抗嘌呤霉素的細胞株，然后常規培養于終濃度為2ug/ml的嘌呤霉素培養液中。

1.7 Transwell小室試驗檢測leti-MTSS1對鼻咽癌細胞侵襲能力的影響

實驗中采用無血清的DMEM1∶4稀釋Matrigel膠，取80μl平鋪于Transwell小室的底部，在37℃的培養箱中培養30min后凝固成膠，取出培養的細胞，重懸細胞調整細胞濃度為50×104個/ml，取250μl接種于24孔板小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的培養液600μl。常規培養40h后取出小室，加入4%多聚甲醛固定20min，加入結晶紫30min后，輕輕擦去上室面的細胞，顯微鏡下分別取10個不同視野計數并拍照。

2.0統計學分析

計量資料數據均采用均數±標準差，采用SPSS19.0統計軟件處理實驗數據，兩組數據比較采用t檢驗。使用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1、建立鼻咽癌裸鼠肺轉移模型

腫瘤的轉移模型可分為自發性兩種轉移模式與誘發性轉移模式。此次實驗使用的自發性轉移模式，使用的濃度為1×106/mL的SUNE1-6-10B細胞株，每只裸鼠分別在腋下種植0.1ml的細胞。實驗建模比較成功，成功率達66%。

3、RT-PCR比較肺轉移灶與皮下移植瘤MTSS1mRNA的表達差異

肺轉移灶組織和皮下移植瘤組織中均可在凝膠成像儀下見到擴增的MTSS1條帶（288bp處），但腫瘤組織的較對照組組織稍清楚，并同時用電泳GAPDH內參（576bp處）和DNA標準分子量標記物（DNA Marker）作為參照和標尺。經過凝膠成像分析儀掃描后，對兩種組織MTSS1mRNA/GAPDH電泳條帶吸光度比值（mRNA水平相對值一目的條帶吸光度值/內參GAPDH條帶吸光度值），進行統計學分析，肺轉移灶組織和皮下移植瘤組織的MTSS1mRNA表達量差異明顯，具有統計學意義（P<0.05）。

4、我們通過transwell實驗檢測過表達MTSS1后SUNE-1-5-8F細胞的侵襲轉移能力

Transwell小室實驗的結果發現，在40h時，過表達MTSS1的細胞侵襲能力較對照組明顯減弱（P<0.05），而正常組和陰性對照組細胞的侵襲能力變化無統計學意義（P>0.05）。

討論

多項研究報道指出，MTSS1高表達可抑制腫瘤細胞的轉移、侵襲，而低表達得患者預后差【9】。也有報道認為，MTSS1可使乳腺癌、非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤轉移和侵襲能力增強【10】。本實驗，我們通過免疫蛋白印記分析和PCR研究發現，MTSS1基因的表達與鼻咽癌的轉移和侵襲能力負相關。學者王艷良[11]等的研究顯示，乳腺癌的轉移、增殖等生物學功能受MTSS1的影響。學者楊波[12]等的研究顯示，MTSS1在胃癌組織中表達下調，抑制胃癌細胞的侵襲和轉移。

綜上所述，MTSS1在鼻咽癌細胞中過表達，能夠抑制鼻咽癌細胞的增殖和轉移，本實驗從分子水平探討了鼻咽癌的發生及遠處轉移等相關問題，豐富了這一領域的相關文獻，本實驗結果均來自細胞培養，仍需下一步再體實驗，為鼻咽癌的進一步研究提供新的方法和思路。

參考文獻：

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[4]XIE F，YE L，CHEN J，et al.The impact of Metastasis Suppressor-1，MTSS1，on oesophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance[J].J Transl Med，2011，9（1）：95.

[5]黃劍，唐慰平，姚運紅，等.人鼻咽癌自發性高淋巴道轉移模型的建立及生物學特性研究.中華醫學雜志.1998，78（10）：725.

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[7]LEE Y G，MACOSKA J A，KORENCHUK S，et al.MIM，a potential metaslasis suppressor gene in bladder cancer.Neoplasis，2002，4（4）：291-294.

[8]MERTZ K D，PATHRIA G，WAGNER C，et al.MTSS1 is a metastasis driver in a subset of human melanomas[J].Nat Commum，2014，5：3465.

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[12]楊波，何小彬，等.腫瘤轉移抑制基因-1與腫瘤關系的研究進展[J].世界華人消化雜志，2014，22（34）：5291-5297.

項目名稱蚌埠醫學院自然科學基因面上項目（BYKY1777）