溫敏型細胞培養皿的生物學研究及其對細胞生長的影響

摘要：目的 觀察溫敏型細胞培養皿生物學研究以及對于細胞生長指標的影響，為貼壁型易損傷細胞在體外擴增和細胞治療等醫療應用方面提供安全依據。方法 采用內毒素試驗、溶血試驗和細胞毒性試驗觀察溫敏型細胞培養皿的生物安全性，另外通過細胞貼壁生長匯合度和細胞溫敏脫落率觀察溫敏細胞培養皿對于細胞生長的影響。結果 溫敏細胞培養皿在凝膠法細菌內毒素試驗條件中濃度小于0.25 EU/mL;在體外溶血試驗中溶血率<5%;細胞毒性反應級別為2級;細胞貼壁生長匯合度和細胞溫敏脫落率均>80%。

關鍵詞：溫敏細胞培養皿;醫療器械;內毒素;溶血;細胞毒性

【中圖分類號】 R197.39 【文獻標識碼】 A ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）06--02

Abstract： Objective To observe the biological research of temperature-sensitive cell culture dish and its effect on cell growth indexes， and to provide a safe basis for the medical application of adherent vulnerable cells in vitro expansion and cell therapy. Methods Endotoxin test， hemolysis test and cytotoxicity test were used to observe the biosafety of temperature-sensitive cell culture dishes. In addition， the effect of temperature-sensitive cell culture dishes on cell growth was observed by cell adherent growth confluence and cell temperature-sensitive shedding rate. Results The concentration of temperature-sensitive cell culture dishes was less than 0.25 EU/mL in the gel method bacterial endotoxin test conditions; the hemolysis rate in the in vitro hemolysis test was less than 5%; the cytotoxic reaction grade was grade 2; Cell adherent growth confluence and cell temperature-sensitive shedding rate were both >80%.

Key words： Temperature-sensitive cell culture dish; Medical device; Endotoxin; Hemolysis; Cytotoxicity

隨著臨床治療的發展，一個新的治療方式——細胞治療，慢慢進入人們視野。這種治療方式是在體外培養的健康干細胞，隨后移植到患者體內，植入人體的健康干細胞通過自身的分化和增殖起到修復或替換人體原有的受損細胞或組織來達到治愈的目的。但是，干細胞本身十分脆弱，因此其在體外培養的條件也十分苛刻。為了保證干細胞在培養和傳代過程中盡可能保證完整性和減少損失，一般選用溫敏細胞培養皿進行體外干細胞的培養。溫敏細胞培養皿因對溫度敏感的特性，其聚合物涂層能夠隨著外界溫度的變化將溫敏表面從疏水轉向親水，從而獲得具有高活力和完整表面蛋白的貼壁干細胞，避免細胞受外力或蛋白酶水解的損傷，并最大程度保留細胞表面蛋白。本研究通過對溫敏細胞培養皿的內毒素含量、溶血率和細胞毒性[1]的生物學研究以及細胞貼壁生長匯合度和細胞溫敏脫落率的生長指標研究，觀察溫敏細胞培養皿的性能，為其在醫療器械制造以及應用方面提供安全依據和建議。

1.材料與方法

1.1材料 小鼠成纖維細胞 L-929（美國菌種保存中心（ATCC）），細菌內毒素檢測用水（湛江博康海洋生物有限公司），鱟試劑（TAL，靈敏度0.25 EU/mL，規格0.1mL）（湛江博康海洋生物有限公司），細菌內毒素工作標準品15EU/支（湛江博康海洋生物有限公司），MEM培養基（Hyclone），胎牛血清（Clark），青鏈霉素（Gibco），胰蛋白酶（biosharp），PBS（Gibco），MTT（Solarbio），異丙醇（Rhawn），0.9 %氯化鈉注射液（廣西裕源藥業有限公司），高密度聚乙烯（Hatano Research Institute. FDSC），DMSO（Macklin）。

1.2儀器 電熱恒溫干燥箱（上海精宏），紫外分光光度計（INESA），CO2 培養箱（Thermofisher Scientific），電子天平（賽多利斯），恒溫水浴鍋（Crystal），潔凈工作臺（蘇凈安泰），低速自動平衡離心機（湖南湘儀），Multiskan? Sky酶標儀（Thermofisher Scientific），倒置顯微鏡（含成像）（NIKON）、 立式單門雙層恒溫振蕩箱（Crystal）

1.3實驗動物 新西蘭兔3只，健康、初成年、雌性未產且無孕，試驗初體重2.3～2.8 kg，來源于無錫恒泰實驗動物養殖有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2015-0004，每天供應無錫恒泰實驗動物養殖有限公司的實驗兔全價顆粒飼料。飼養環境溫度為18-26 ℃，相對濕度30 %-70 %。

1.4方法

1.4.1內毒素試驗 將所有玻璃器皿和其他熱穩定材料在250℃的溫度下脫熱至少30min去除外源性內毒素，被測物品的內毒素限值：L≤20EU/件，鱟試劑靈敏度：λ= 0.25 EU / mL，浸提介質體積：V= L/ λ。取同批次3件樣品，將溫敏細胞培養皿在無菌內毒素檢查用水中浸提，于37 ℃條件下孵育1小時。準備細菌內毒素標準品2支，按《細菌內毒素工作標準品使用說明書》配制2λ內毒素標準溶液以及2λ測試樣品溶液。取12支0.1mL/支的鱟試劑，開瓶后先在每支安瓿瓶中各加入0.1mL檢查用水溶解鱟試劑粉末，之后三個平行樣品的每2支各加入0.1mL測試樣品浸提液作為測試樣品管（A），2支加入0.1mL含有2λ的測試樣品浸提液作為樣品陽性對照管（B），2支加入0.1mL含有2λ的檢查用水作為陽性對照管（C），2支加入0.1mL檢查用水作為陰性對照管（D）。將試管中液體輕輕混勻并用封口膜封閉管口，垂直放入37℃恒溫水浴鍋中。60分鐘后將試管輕輕取出，緩慢倒轉180°。若試管內容物呈緊實凝膠，不變形，不從管壁滑脫為陽性，記錄為（+）;不呈凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫為陰性，記錄為（-）。在試驗有效情況下，如果測試樣品管兩個平行管均為陰性，判定測試品內毒素含量小于藥典規定限值。

1.4.2溶血試驗 將溫敏細胞培養皿按照按照0.2 g/mL的比例浸沒在0.9%氯化鈉注射用水中，于37℃恒溫水浴鍋中浸提。新西蘭兔心臟采血10 mL至一次性使用真空采血管（EDTA-K2管）混勻，按照新鮮抗凝兔血：氯化鈉注射液為8mL：10mL比例稀釋。浸提結束后，每支試管內按照10 mL浸提液：0.2 mL稀釋后的兔血比例加入稀釋后兔血，輕輕混勻，繼續放置于37℃水浴鍋中60分鐘。保溫結束后倒出管內液體，以2500 rpm離心5分鐘，吸取上清液于比色杯中，空白比色杯調零，在545 nm波長處測定吸光度值，計算平均值和溶血率。溶血率% =（供試品組吸光度-陰性對照組吸光度）/（陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度）×100%。溶血率小于5%時判定合格。

1.4.3細胞毒性試驗 全程在超凈臺內操作，保證無菌操作過程。將溫敏細胞培養皿按照0.2 g/mL的比例浸沒在含血清的培養基中，于37 ℃浸提24小時。生長至對數生長期的L-929細胞用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化，消化后將細胞懸浮液離心（1000 rpm，5分鐘），棄去上清，用MEM培養基重懸細胞，計數得到1×104個/mL 細胞懸液。將細胞懸液以每孔100 μL 接種于96孔板中，并在細胞培養箱（37 ℃，5% CO2，>90%濕度）中培養，鏡下觀察細胞形態。待孵育24小時后棄去96孔板內原培養基，在96孔板相應孔內各加入100 μL浸提液，空白對照（含血清培養基），陰性對照（按3cm2/mL浸提的高密度聚乙烯）和陽性對照（0.1% ZDEC）。將96孔板置于細胞培養箱中培養72小時，每組設置六個復孔。培養72小時后取出96孔板，在顯微鏡下觀察細胞形態，然后去除液體，每孔加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液，置二氧化碳培養箱中培養。4小時后去除上清，每孔加入150 μL異丙醇溶解結晶，在酶標儀上測定570 nm和630 nm 波長下的吸光度值，計算其細胞毒性。細胞活力%=試驗（或陰性及陽性）樣品組OD570 /空白對照組OD570×100%。根據表2分級標準判定。陰性對照組的級別應≤1級，陽性對照組≥3級。供試品分級不大于2級時判定為合格。

1.4.4細胞貼壁生長匯合度試驗 全程在超凈臺內操作，保證無菌操作過程。生長至對數生長期的細胞用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化，消化后將細胞懸浮液離心（1000 rpm，5分鐘），棄去上清，用MEM培養基重懸細胞，計數得到2×106個/mL 細胞懸液。接種10 mL細胞懸液至溫敏細胞培養皿，并在細胞培養箱（37 ℃，5% CO2，>90%濕度）中培養48小時，倒置顯微鏡下觀察細胞匯合度。

1.4.5細胞溫敏脫落率試驗 取L-929細胞生長匯合度良好的溫敏細胞培養皿，置于4℃冰箱，低溫放置20分鐘后用移液槍均勻吹打培養皿表面20次，收集脫落細胞并計算脫落細胞總數，再用胰酶消化培養皿中未脫落的細胞并計數。計算收獲細胞總量，并計算細胞脫落率。脫落率=/（溫敏脫落收獲的細胞數+胰酶消化收獲的細胞數）×100%。

1.5統計方法 數據表示為mean±SD。

2. 結果

2.1細菌內毒素試驗 陰性對照管結果均為陰性，陽性對照管結果均為陽性、測試樣品陽性對照管結果均為陽性，測試樣品管結果均為陰性。在凝膠法細菌內毒素試驗條件中濃度小于0.25 EU/mL。

2.2溶血試驗 陰性對照組吸光度平均值為0.004，陽性對照組吸光度平均值為0.601，測試樣品吸光度平均值為0.013，見表3，溶血率=（0.013-0.004）/（0.601-0.004）×100%=1.51%。因此試驗樣品在體外溶血試驗中溶血率<5%，無溶血反應。

2.3細胞毒性試驗 試驗樣品浸提液在與細胞接觸72小時后在顯微鏡下均可見胞漿內離散穎粒，無細胞溶解和細胞增殖下降情況。細胞存活率分別為71.2%，細胞分級為2級，無潛在的細胞毒性，見表4。

2.4細胞貼壁生長匯合度試驗 L-929細胞在溫敏細胞培養皿中培養48小時后細胞形態完好，細胞匯合度大于80%。

2.5細胞溫敏脫落率試驗 溫敏細胞培養皿在4℃冰箱放置20分鐘后用移液槍均勻吹落細胞總數為6.5×108個，用胰酶消化培養皿中未脫落的細胞總數為1.5×108個，因此脫落率=6.5×108個/（6.5×108個+1.5×108個）×100%=81.25%。

3. 討論

隨著干細胞研究的不斷深入，通過體外培養細胞進行人體疾病治療的方法也逐漸成為一種新型的治療方式。這種治療方式對于神經方面、免疫方面疾病以及其他內科或外科疾病都有良好的治療效果，并且由于它的自我更新和多向分化的潛能[2]，在病人體內也能起到造血支持和免疫調控的作用。但是干細胞非常脆弱，其在體外的培養通常會受到許多因素的影響，如干細胞生存所需的養分、培養基的pH值、培養環境的溫度、氧氣和二氧化碳的含量等。細胞制備作為細胞治療的重要環節，為了保證其在臨床治療上的有效性，必須盡可能從細胞培養介質上收獲無損傷、高活性且功能完好的貼壁細胞。傳統的方式是利用胰蛋白酶進行消化，但這種方式對于細胞治療來說存在很多缺點。由于胰蛋白酶會降解細胞膜蛋白和細胞外基質，導致細胞活力降低甚至某些功能的喪失[3，4]，最終影響臨床治療時細胞質量。此外，胰蛋白酶的來源一般是動物衍生的蛋白質，由于種屬的不同在治療時可能會存在疾病傳播風險[5]。溫度作為對環境敏感的聚合物系統中使用最廣泛的一種刺激方式，相比于其他因素來說其變化更容易控制，因此溫敏細胞培養皿適合用于細胞的培養與收獲，避免了培養過程中細胞由于外力或蛋白水解的損傷，是目前最有應用前景的細胞培養材料。溫敏性聚合物材料存在最低臨界溶解溫度[6]，當溫度處在最低共溶溫度時溫敏性聚合物發生從無規卷曲形式到塌陷或球形形式的相變，溫敏表面從疏水轉向親水，而使貼壁細胞能夠輕易脫落，獲得表面蛋白完整且活力高的貼壁細胞。

宋克東[7]等發現在制備的溫敏性玻璃微載體上骨髓間充質干細胞能夠保持粘附并具有良好的生長曲線，降溫收獲細胞后再培養也能保持良好的生長活性。此外，溫敏型殼聚糖支架與誘導后的脂肪干細胞復合后不會影響干細胞表型和功能的變化，可作為干細胞植入的可注射性載體材料[8]。因此，利用溫敏細胞培養皿能夠滿足生物醫學和組織工程中對于高質量細胞的需求。在本研究中也發現溫敏細胞培養皿在培養細胞過程中細胞生長匯合度良好，對細胞生長無不良影響，且能夠依據溫度變化收獲>80%的貼壁細胞，發揮其溫敏特性保持細胞的完整性。同時，作為細胞治療中的醫療器械，在生物學試驗中內毒素含量合格，且無溶血反應和細胞毒性反應，體現出良好的生物學特性。因此，研究溫敏型細胞培養皿的特性能夠為貼壁型易損傷細胞在體外擴增和細胞治療等醫療應用方面提供安全依據。

[1]GB/T 14233.2-2005醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分：生物學試驗方法

[2]Pegtel D M and Gould S J. Exosomes [J].Annu Rev Biochem， 2019， 88： 487-514.

[3]Dey S， Kellam B，Alexander MR， et al. Enzyme-Passage Free Culture of Mouse Embryonic Stem Cells on Thermo-Responsive Polymer Surfaces[J]. Journal of Materials Chemistry， 2011， 21（19）： 6883.

[4]Yang H S， Jeon O， Bhang S H， et al. Suspension Culture of Mammalian Cells Using Thermosensitive Microcarrier That Allows Cell Detachment without Proteolytic Enzyme Treatment[J]. Cell Transplant， 2010， 19（9）： 1123-1132.

[5]Nakajima K，Honda S， Nakamura Y， et al. Intact Microglia Are Cultured and Non-Invasively Harvested without Pathological Activation Using a Novel Cultured Cell Recovery Method[J]. Biomaterials， 2001， 22（11）： 1213-1223.

[6]Plate N A， Lebedeva T L， Valuev L I. Lower Critical Solution Temperature in Aqueous Solutions of Yv-Alkyl-Substituted Polyacrylamides[J]. Polymer Journal， 1999， 31（1）： 21-27.

[7]宋克東，楊延飛，武爽，李麗穎，閆新宇，劉天慶. BMMSCs在溫敏性玻璃微載體上的培養及收獲[J]. 高?；瘜W工程學報，2016，30（03）：633-640.

[8]文天用，李放，葉超群，劉連江. 脂肪干細胞與溫敏型支架構建人工髓核的體外研究[J]. 中國康復理論與實踐，2010，16（04）：335-338.

作者簡介：王霄彤，1994年6月，女，江蘇蘇州，助理工程師，中檢華通威國際檢驗（蘇州）有限公司，醫療器械生物相容性檢測