基于微生物轉化法制備雄甾-4-烯-3,17-二酮羥化物的研究

于歡 江勝 李悅

（河北達瑞生物科技股份有限公司（河北省甾類醫藥中間體技術創新中心） 河北保定 071000）

甾體化合物即類固醇化合物，是微生物及動植物體內普遍存在的物質，母核呈環戊烷合并多氫菲結構。依據母核側鏈的差異，可以將甾體化合物分為甾醇類藥物、甾體生物堿、甾體激素類藥物和強心苷類藥物等，其中，甾體激素類藥物對人體具有強大的調節作用，主要用于治療風濕病、心血管病、膠原性病、皮膚病、內分泌失調疾病等，成為排名位于抗生素之后臨床廣泛使用的第二大類藥物［1］。

微生物轉化法制備甾體化合物是指以微生物代謝產生的酶系作為催化劑，通過與添加的底物相互作用，使其結構發生改變或進行修飾，進而生成具有潛在藥理活性的目標化合物過程，包括“篩選菌種→培養孢子或菌絲體→添加甾體化合物→產物提取分離純化”。傳統化學合成方法制備甾體化合物，具有成本高、污染大、生產工藝復雜、產率低、副產物多等諸多缺陷。而采取微生物轉化法制備甾體化合物，具有生產工藝簡單、催化反應條件溫和、步驟少、周期短、成本低、污染少、收率高、副產物少、區域性、選擇性、專一性強等優點，正好可以彌補化學合成方法的不足。

微生物轉化法制備甾體化合物主要涉及羥基化、環氧化、支鏈降解、脫氫反應等幾種催化反應類型，其中，羥基化是應用最為廣泛的一種催化反應類型，因為在甾體化合物母核的任一碳位上都可以引入羥基，生成不同的甾體羥化物［2］。目前，微生物轉化法制備甾體化合物研究，主要體現在新藥開發、有機合成、哺乳動物藥物代謝體外模型實驗等幾個方面。

1952年，美國的Murray和Peterson以孕酮為底物，用黑根霉轉化制備11α-羥基孕酮，轉化率高達90%，拉開了甾體激素類藥物工業化生產的序幕。1958年，中國黃鳴龍院士以16α，17α-環氧孕酮為底物，用黑根霉轉化制備11α-羥化物，為我國運用微生物轉化法制備甾體化合物夯實了基礎［3］。11α-羥化物是合成抗炎類甾體藥的重要中間體，通過C11α-羥化反應，用以改變或修飾底物母核結構，從而增加藥效，減少副作用，提高藥物商業價值和臨床應用價值。目前，用于甾體11α-羥化反應的微生物以霉菌為主，包括黑根霉、黃曲霉、赭曲霉、少根根霉、球孢白僵菌、諾卡氏菌、綠僵菌、放線菌、青霉等，其中，赭曲霉和綠僵菌都存在不同的缺陷，如特異性不明顯、活性不穩定、目的產物分離純化困難等，因此，工業生產中應用最廣的還是用黑根霉轉化制備11α-羥化物。但是，縱觀我國采用微生物轉化法制備甾體化合物的醫藥制造企業，目標產物普遍收率較低，究其原因主要是受到微生物形態結構、甾體化合物水溶性、微生物細胞膜或壁的通透性、底物添加量和產物堆積等因素的影響。因此，迫切需要通過改進轉化技術以提高目標產物的收率［4］。

4-AD 又名雄烯二酮，分子式為C19H26O2，可以以4-AD為底物，采用微生物轉化法制備雄激素、孕激素、糖皮質激素、蛋白同化激素等甾體激素類藥物。目前，市場上以4-AD 為主要原料制備的甾體激素類藥物已經達到100 多種，給臨床藥物治療提供了更多新的思路。4-AD 作為一種制備甾體激素類藥物的重要中間體，在母核結構不同點位上都可以引入羥基，如C-5、C-6、C-7、C-9、C-11、C-14、C-15、C-16、C-17等，合成不同品種的甾體激素類藥物。11α-OH-4-AD 是合成高血壓、心臟病、利尿劑等甾體激素類藥物的重要原料或中間體，由其合成的依普利酮屬于醛固酮受體拮抗劑，通過調節腎素—血管緊張素—醛固酮系統來治療心血管疾病，尤其對于充血性心衰治療效果更好，而且副作用?。?］。雖然目前利用4-AD轉化合成11α-OH-4-AD 的研究不少，但同時滿足添加底物量大、目標產物收率高的轉化體系還很少，還需要從篩選菌種和優化轉化工藝入手，以其提高11α-OH-4-AD的收率。

1 實驗

1.1 實驗材料

（1）實驗試劑。分析純包括4-AD、柱層析硅膠、羧甲基纖維素鈉、薄層層析硅膠、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、尿素、硝酸銨、硫酸銨、磷酸氫二鈉、吐溫-80、硫酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、氯化鈉、二甲基亞砜、乙酸乙酯、甲基-β-環糊精、丙酮、石油醚、無水乙醇、無水甲醇；生物試劑包括蛋白胨、瓊脂、酵母膏、牛肉膏、L-天冬氨酸、麥芽糖、D-木糖；工業級包括麥芽糊精、玉米粉、豆粕水解液；色譜純包括無水甲醇。

（2）實驗儀器。GNP-9050 隔水式恒溫培養箱、DLHR-Q250 恒溫振蕩器、BSC-1100IIA2-X 生物安全柜、BCD-219L3C 冰箱、MJ-78A 高壓蒸汽滅菌鍋、X-5精密顯微熔點測定儀、DPX-400超導核磁共振儀、2F-20D暗箱式紫外分析儀、PHS-3C酸度計、OSB-2100旋轉蒸發儀、SHB-3循環水多用真空泵、DHG-9000電熱恒溫鼓風干燥箱、SYU-7-200DTD 超聲波清洗機、AUY220 分析天平、OLYMPUS CH-BI45-2 顯微鏡、LOC-1m 冷凍干燥機、Nicolet i S10 紅外光譜儀、Arktik PCR 儀、DYY-8C 電泳儀、Q-Tof Mico TM 高分辨電噴霧質譜儀、250×4.60mm色譜柱、Waters e2695高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

（1）菌種篩選與鑒定。菌種篩選的過程也是菌種培養的過程，因此，需要明確各階段菌種培養對應的培養基組成。轉化培養基組成同富集培養基（mg/mL）：葡萄糖30、酵母膏1、蛋白胨12、磷酸二氫鉀0.9、pH 值4.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min后備用。固體培養基組成同分離培養基（mg/mL）：葡萄糖30、酵母膏1、蛋白胨12、瓊脂30、磷酸二氫鉀0.9、pH 值4.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min 后備用。初篩培養基（mg/mL）：瓊脂30、硫酸鎂6.7、硫酸銨0.5、硫酸亞鐵0.05、磷酸氫二鈉3、磷酸二氫鉀1.5、氯化鈉0.25、4-AD 1，121℃高壓蒸汽滅菌20min后備用。

為了得到轉化能力強的菌種，公司將自藏的不同地區采集的土樣各取1.0g，在恒溫振蕩器中進行微生物菌液富集培養2d，在隔水式恒溫培養箱中進行初篩培養4～7d，在分離培養基中進行分離純化，初篩以后獲得12 株菌種，依次命名從MH-14 到MH-25。將初篩菌株先在隔水式恒溫培養箱中培養4d，再置于恒溫振蕩器中培養2d，最后向裝有轉化培養基的錐形瓶加入0.1g用甲基-β-環糊精溶解的4-AD轉化4d，用乙酸乙酯濃縮萃取，并進行TLC 檢測，結果MH-14、MH-18、MH-19等3株菌種對底物4-AD轉化的總收率均超過40%，說明都具有較好的轉化能力，其中，MH-18 菌株轉化11α-OH-4-AD 的基礎收率達到48.50%，是所有轉化產物中收率最高的，因此，將MH-18 菌株作為4-AD 轉化為11α-OH-4-AD 的研究對象。將MH-18菌種置于固體培養基中培養4d，觀察菌落顏色變化和光學顯微鏡下的形態結構，菌落正面顏色逐漸由白色變為深黑褐色，分生孢子呈球形或近球形，初步判定屬于曲霉屬。然后采用超聲法進行DNA測序，通過提取MH-18 的總DNA、檢測DNA 的濃度和質量、擴增ITS序列的PCR、擴增產物瓊脂糖凝膠電泳、測序、序列分析等，結果表明，MH-18 菌株與泡盛曲霉（Aspergillus awamori）同源，符合率高達100%。

（2）MH-18 轉化4-AD。首先，從固體培養基取出1 支MH-18 菌種放于生物安全柜中，然后將適量菌體分別接種到裝有轉化培養基的8 瓶錐形瓶中，置于恒溫振蕩器中培養2d。其次，將用甲基-β-環糊精溶解的4-AD 分裝到8 瓶錐形瓶中，每瓶裝含有0.2g 甲基-β-環糊精包埋分散好的0.2g4-AD，置于恒溫振蕩器中培養4d。再次，將發酵液經減壓抽濾、有機相與濾液合并、減壓濃縮、飽和碳酸氫鈉溶液脫色、飽和氯化鈉溶液洗滌、無水硫酸鎂干燥、減壓蒸餾等步驟得到轉化產物。最后，將轉化產物經柱層析分離，乙酸乙酯與石油醚的比例是1∶3，主要得到7α-OH-4-AD、11α-OH-4-AD、14α-OH-4-AD 這3 種產物，其中，11α-OH-4-AD的轉化率為84.02%，比初始轉化率提高35.52%。

2 討論

微生物轉化法合成甾體化合物包括菌株培養和甾體底物轉化兩個過程，相應工藝優化也主要包括培養條件優化和轉化條件優化兩個方面。以4-AD 為底物，利用泡盛曲霉菌株MH-18 轉化目標產物11α-OH-4-AD，其基礎轉化率可達48.50%，轉化率相對較高，對其培養條件和轉化條件分別進行優化，以進一步提高目標產物11α-OH-4-AD 產率，為我國醫藥制造企業采用微生物轉化法制備甾體化合物提供更多理論指導。

2.1 MH-18菌株生長曲線測定

以時間和菌體干重分別為橫坐標和縱坐標，按12h 取樣1 次，繪制MH-18 菌株生長曲線，結果發現，菌體生長可以分為遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期4個階段，對應的時間段分別為12～24h、24～48h、48～72h和72h 后，因此底物4-AD 添加時間為MH-18 菌株生長48h。

2.2 培養條件優化

（1）保持初始轉化培養基其他組成成分固定不變，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖、糊精、淀粉作為碳源，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率糊精最高，因此選擇糊精作為碳源。然后分別以12.5mg/mL、22.5mg/mL、32.5mg/mL、42.5mg/mL、52.5mg/mL、62.5mg/mL、72.5mg/mL 作為糊精添加濃度，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率在糊精濃度為32.5mg/mL 時最高，因此選擇糊精濃度為32.5mg/mL。

（2）保持初始轉化培養基其他組成成分固定不變，分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米粉、豆粕水解液、硝酸銨、尿素、L-天冬氨酸作為氮源，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率玉米粉和牛肉膏相對較高，而玉米粉成本較低，因此選擇玉米粉作為氮源。然后分別以5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL 作為玉米粉添加濃度，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率在玉米粉濃度為10mg/mL 時最高，因此選擇玉米粉濃度為10mg/mL。

（3）保持初始轉化培養基其他組成成分固定不變，分別以硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀作為無機鹽，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率磷酸二氫鉀最高，因此選擇磷酸二氫鉀作為無機鹽［6］。然后分別以0.3mg/mL、0.6mg/mL、0.9mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2.1mg/mL 作為磷酸二氫鉀添加濃度，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率在磷酸二氫鉀濃度為1.2mg/mL時最高，因此選擇磷酸二氫鉀濃度為1.2mg/mL。

（4）保持初始轉化培養基其他組成成分固定不變，分別以3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5作為初始pH值，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率在pH 值為4.5 時最高，因此選擇的pH值為4.5。

（5）對培養基組成的響應面進行實驗優化，以糊精、玉米粉、磷酸二氫鉀、pH 值4.5 作為影響因素，以11α-OH-4-AD 轉化率作為響應值，然后利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面分析實驗和參數優化，結果確定的最優培養條件為糊精33.6mg/mL、玉米粉10.5mg/mL、磷酸二氫鉀1.2mg/mL、pH值為4.5。

2.3 轉化條件優化

（1）固定優化后的培養基組成成分，分別以28℃、30℃、32℃、34℃、36℃作為轉化溫度，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率在32℃時最高，因此選擇的轉化溫度為32℃。

（2）固定優化后的培養基組成成分，分別以140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min作為搖床轉速，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率在200r/min時最高，因此選擇的搖床轉速為200r/min。

（3）固定優化后的培養基組成成分，分別以60mL、80mL、100mL、120mL、140mL 作為裝液量，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率在100mL 時最高，因此選擇的裝液量為100mL。

（4）固定優化后的培養基組成成分，分別以吐溫-80、甲醇、甲基-β-環糊精、乙醇、丙酮、二甲基亞砜作為底物4-AD助溶劑，結果甲基-β-環糊精作為助溶劑時，目標產物11α-OH-4-AD轉化率最高，因此選擇甲基-β-環糊精作為助溶劑。

（5）固定優化后的培養基組成成分，分別以0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L 作為底物4-AD 濃度，結果4-AD濃度為1g/L時，目標產物11α-OH-4-AD轉化率最高，因此選擇的4-AD濃度為1g/L。

（6）固定優化后的培養基組成成分，分別以24h、48h、72h、96h、120h、144h 作為轉化時間，結果目標產物11α-OH-4-AD 轉化率在96h 時最高，因此選擇96h作為轉化時間。

最終確定的最優轉化條件為轉化溫度32℃、搖床轉速200r/min、裝液量100mL、助溶劑甲基-β-環糊精、4-AD添加濃度1g/L、轉化時間96h。