GAB2在卵巢癌組織中的表達及其與預后的相關性

尹翼 歐朝陽 何愛琴

卵巢癌是女性生殖系統腫瘤中常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年增加[1-2]。由于疾病早期缺乏特異性癥狀，大多數患者發現時已處于晚期或發生遠處轉移[3]。臨床上卵巢癌的標準治療是腫瘤細胞減滅術聯合以鉑類為基礎的化療，盡管治療后可達到完全緩解，但仍有約60%的卵巢癌患者會在5年內復發[4]，而且大多數患者最終會發展為鉑類耐藥[5]。目前為止，卵巢癌的發生發展機制尚不清楚。因此，研究與卵巢癌惡性行為相關的分子調控機制并尋找新的治療靶點至關重要。

GABs蛋白家族是一種高度保守的支架蛋白[6]。該家族結構具有同源性，包括N端PH結構域(N-terminal pleckstrin homology domain)、中央富含脯氨酸結構域和多重酪氨酸殘基[7]。目前，許多證據表明GABs蛋白在多種癌癥中異常表達，并參與多種細胞進程，如增殖、遷移和侵襲[8-9]。據報道，在乳腺癌細胞中GAB2的高表達增強了細胞的侵襲能力[10]，卵巢癌細胞SKOV3和HO-8910中GAB2敲低后，腫瘤細胞的增殖能力顯著下降，說明GAB2在卵巢癌發生發展中可能發揮了重要作用[11]。但是GAB2在卵巢癌組織中的表達及其與預后的關系尚不清楚。因此，本研究旨在評估卵巢癌組織中GAB2的表達及其預后價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月—2016年1月在南通大學附屬腫瘤醫院手術切除的119例卵巢癌患者的癌組織及其癌旁組織(經病理證實未被癌累及的卵巢組織或輸卵管組織)制成組織微陣列。收集這些患者的臨床資料、血清腫瘤指標、影像結果和病理結果。119例標本包括101例漿液性癌、10例粘液性癌、2例子宮內膜樣癌、3例透明細胞癌和3例其他類型卵巢癌。所有標本都由2位高年資的病理科醫師重新閱片。本研究已獲得南通大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準。

1.2 免疫組織化學染色法

采用免疫組化(SP)法對組織標本進行染色，切片厚度約4 μm，85℃烘箱烤片30 min，二甲苯脫蠟，乙醇脫水。堿性修復液高壓加熱進行抗原修復，冷卻至室溫，過氧化物酶阻斷劑室溫封閉20 min，一抗4℃過夜[GAB2(ab235932)，稀釋濃度為1∶50]。次日，復溫至室溫，DaKo免疫組化二抗室溫孵育20 min，每個步驟之間用PBS緩沖液清洗 3次，每次5 min。DAB顯色2 min，蘇木素染色30 s，乙醇脫水，二甲苯脫蠟，中性樹膠封片。

1.3 結果判定

GAB2染色陽性標準為胞漿著色，陰性標準為無胞漿著色，不論胞膜和胞核是否著色。按胞漿著色程度分為未著色、淡黃色、黃色、棕色或深棕色，所對應染色強度分別為-、+、++、+++，評分分別為0、1、2、3分。陽性細胞百分比<20%、21%～50%、51%～75%、>75%，評分分別為1、2、3、4分。綜合評分為兩項指標乘積?；诰C合評分，根據受試者工作特征曲線(ROC)及約登指數計算最佳截斷值，分為GAB2低表達組(<4)和高表達組(≥4)。

1.4 隨訪

所有患者在初始治療結束后1年內每月隨訪1次，2年內每3個月隨訪1次，3～5年每4～6個月隨訪1次，5年以上者每年隨訪1次。根據病人對鉑類化療藥物的敏感性，以初次治療(達到臨床緩解)停藥后6個月為界，將復發性卵巢癌分為鉑耐藥性復發和鉑敏感性復發，鉑敏感性復發定義為發生在停藥后6個月以上的復發，鉑耐藥性復發定義為發生在停藥后6個月以內的復發?？偵嫫?Overall survival，OS)定義為從治療開始至死亡或隨訪截止日期的時間。隨訪截止時間為2020年12月。中位隨訪時間74個月(60個月～81.24個月)，隨訪結束后存活57人，死亡62人。

1.5 Nomogram預后預測模型

運用R 4.1.1中的survival和rms兩個程序包構建Nomogram預后預測模型。使用Cox風險比例模型分析卵巢癌患者的獨立預后因素并繪制列線圖(Nomogram)；根據不同危險因素對卵巢癌患者3年和5年生存率的影響程度，計算相應得分，根據總得分評估每個患者的生存率。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0統計學軟件，計量資料以均值±標準差表示，組間比較采用配對t檢驗。使用配對卡方檢驗分析癌與癌旁組織中GAB2的表達差異。使用卡方檢驗和連續性校正卡方檢驗分析GAB2表達與臨床病理特征的關系，采用Kaplan-Meier生存曲線和Cox比例風險模型分析GAB2表達與卵巢癌患者預后的關系，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌組織和癌旁組織中GAB2的表達情況

利用免疫組織化學染色法檢測組織芯片中119例癌組織及其癌旁組織中GAB2的表達情況。免疫組化染色結果顯示，73例癌組織中GAB2高表達，43例癌旁組織中GAB2高表達，結果提示，GAB2在卵巢癌組織中表達上調(圖1，表1)。

表1 GAB2在癌組織和癌旁組織中的染色情況

2.2 GAB2表達與卵巢癌患者臨床病理特征的關系

基于GAB2在癌組織中的染色評分，利用ROC曲線及約登指數計算出最佳截斷值為4，分為GAB2高表達組(≥4)和GAB2低表達組(<4)。GAB2表達量與FIGO分期、初診時CA125水平和鉑耐藥性復發密切相關(P<0.05)(表2)。

圖1 GAB2在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達差異Figure 1 The expression of GAB2 in ovarian tumor tissues and adjacent tissuesNote：A.The high expression of GAB2 in ovarian cancer tissues.B.The low expression of GAB2 in adjacent tissues.C.The statistical analysis of GAB2 expression in ovarian tumor tissues and adjacent tissues.***P<0.001.

表2 GAB2表達與臨床病理特征的關系

2.3 GAB2表達與卵巢癌患者預后的關系

GAB2高表達卵巢癌患者的中位OS為20個月(95%CI：16.28～24.15)，GAB2低表達卵巢癌患者的中位OS為49.5個月(95%CI：43.75～52.25)。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，與GAB2低表達組比較，GAB2高表達的卵巢癌患者的OS較差(χ2=69.692，P<0.001)。然后，根據分期情況將119例患者分為FIGO Ⅰ～Ⅱ期亞組和FIGO Ⅲ～Ⅳ期亞組，分層分析結果顯示，FIGO Ⅰ～Ⅱ期亞組中，GAB2表達量與OS無相關性(χ2=1.315，P=0.252)。而FIGO Ⅲ～Ⅳ期亞組中，GAB2高表達與卵巢癌患者不良預后相關(χ2=53.991，P<0.001)(圖2)。

2.4 Cox比例風險模型分析影響卵巢癌患者預后的危險因素

單因素Cox分析結果顯示，GAB2表達量、分期、初診時CA125水平、鉑耐藥性復發可能與卵巢癌患者OS相關(P<0.05)(表3)。多因素Cox回歸分析結果表明，GAB2表達量、鉑耐藥性復發是影響卵巢癌患者OS的獨立危險因素(P<0.05)(表3)。

2.5 Nomogram預后模型預測卵巢癌患者5年生存率

為了更準確的預測卵巢癌患者的生存率，本研究在Cox比例風險模型的基礎上構建了Nomogram預后模型來預測患者的3年和5年生存率(圖3)。結果顯示，Nomogram預后模型能較準確的預測卵巢癌患者3年和5年生存率(C指數為0.801，95%CI：0.781～0.822)，并且該預后模型的預測能力較好(3年AUC=0.927，5年AUC=0.809)。

表3 單因素和多因素Cox比例風險模型預測影響卵巢癌患者OS的危險因素

圖2 Kaplan-Meier曲線分析GAB2表達與卵巢癌患者預后的關系Figure 2 Kaplan-Meier curves were used to analyze the relationship between GAB2 expression and prognosis of ovarian cancer patientsNote：A.Overall survival curves of GAB2 in the high expression group and low expression group；B.Survival curves of GAB2 in the high expression group and low expression group as well as FIGO I-II and FIGO III-IV subgroups.

圖3 Nomogram預后預測模型Figure 3 The Nomogram prognostic modelNote：A.Nomogram prognostic model；B.Calibration curve；C.ROC curve.

3 討論

在女性生殖系統腫瘤中，卵巢癌發病率次于宮頸癌和子宮體癌，但是死亡率卻居首位。據統計，2020年全球卵巢癌新增病例313 959例，死亡207 252例[12]。由于卵巢癌的發病隱匿、高轉移性和治療后易發生化療耐藥[13]，使卵巢癌的治療成為一個難點。因此，監測卵巢癌預后和尋找新的治療靶點就顯得尤為重要。

GAB2位于人染色體11q13.4-q13.5，分子量97～100 kD[14]。GAB2作為一種支架蛋白，不僅參與信號傳遞，在腫瘤的發生發展中也發揮了重要作用。GAB2主要通過兩種信號傳導途徑促進腫瘤發生發展。在GAB2-SHP2介導的RAS/ERK途徑中，酪氨酸磷酸酶(SHP2)是GAB2下游的重要效應蛋白。GAB2與SHP2相互作用后激活下游RAS，繼而促進腫瘤發展[15-16]。據報道，GAB2過表達激活了SHP2-RAS-ERK途徑，增強了神經母細胞瘤的誘導，并增加了腫瘤的滲透性[17]。GAB2參與信號轉導的另一條通路是PI3K/AKT信號通路。GAB2在細胞因子作用下發生磷酸化，磷酸化后的GAB2作用于PI3K的p85亞基，誘導PI3K的激活，繼而發揮促癌的作用[18]。Tian等[19]報道GAB2通過PI3K/AKT途徑促進前列腺癌的增殖、侵襲和上皮-間質轉化(EMT)。也有研究證實，大腸癌組織中GAB2表達上調與VEGF水平呈正相關。GAB2高表達促進結直腸癌細胞的增殖和克隆形成，而沉默GAB2則抑制其增殖和克隆形成[20]。Duckworth等[21]研究證明，在GAB2缺陷的裸鼠模型中，GAB2的缺失能抑制腫瘤細胞增殖、血管生成和腹膜腫瘤生長。同時，也有研究報道，GAB2表達與卵巢癌患者預后的關系，GAB2的高表達與卵巢癌中較短的無進展生存率有關[22]。為了進一步探索GAB2與卵巢癌患者預后的關系，本研究在組織芯片中比較了119例卵巢癌組織和癌旁組織中GAB2的表達差異，并分析了其表達水平與卵巢癌患者預后的關系。結果顯示，與癌旁組織相比，GAB2在卵巢癌組織中表達水平顯著升高，并且，GAB2的表達水平與FIGO分期、初診時CA125水平和鉑耐藥性復發均有顯著相關性。Kaplan-Meier生存曲線分析結果也表明，與GAB2高表達組的患者相比，GAB2低表達組的患者生存明顯較長。Cox比例風險模型分析結果表明，GAB2表達水平是卵巢癌患者的獨立預后因素。

本研究首次在組織芯片中分析GAB2在卵巢癌組織中的表達及其與預后的關系。但是，在Cox回歸模型分析過程中，我們發現分級與患者預后之間無明顯相關性，這似乎與臨床不符。我們分析這可能是由于制作組織芯片前我們篩選的病人存在偏倚所造成，所納入的病人中低級別8例，高級別111例。因此，GAB2與卵巢癌患者臨床特征及預后的關系仍需要更大樣本量的研究。

綜上所述，GAB2在卵巢癌發生發展中可能起到促癌作用，并且GAB2表達與卵巢癌患者的預后相關，可作為影響卵巢癌患者預后的獨立危險因素。這些都提示GAB2有望成為臨床上監測卵巢癌患者預后的有效指標，為卵巢癌的治療提供新的靶點。