一株鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定

李春來 王利麗 劉勃興 史秋梅

摘要 為對河北省張家口赤城縣某肉鵝養殖場的雛鵝死亡病原進行檢測，剖檢雛鵝進行初步診斷后采用常規方法分離細菌病原，并對分 離菌進行鑒定試驗以及藥物敏感性試驗。結果表明，分離菌經鑒定為鴨疫里默氏桿菌，對雛鵝具有較強致病性，分離菌對慶大霉素、卡那霉素和大觀霉素等 8 種抗生素表現耐藥，僅對阿莫西林表現敏感。

關鍵詞 鵝;鴨疫里默氏桿菌;分離鑒定

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌 （riemerella anatipestifer，RA）引起的接觸性傳染病，是制約世界各國鴨、鵝、火 雞等家禽的健康養殖的重要疾病[1，2]。家禽感染鴨疫里默氏桿菌后，臨床表現為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等纖維素性炎癥。雛 鵝感染疫里默氏桿菌發病率極高，病死率在 10%～40%，最高可達 90%[3]。近年來，在我國有關鵝源鴨疫里默氏桿菌分離鑒定的報道 日益增多，并對我國鵝的健康養殖造成影響。

2019 年 6 月，河北省赤城縣某家鵝養殖場雛鵝大量死亡，1 周 內發病率為 20%（1，000/5，000），病死率高達 90%（900/1，000），筆 者對該肉鵝養殖雛鵝死亡病因進行檢測以及藥物敏感性試驗，以 期為該地區鵝鴨疫里默氏桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

河北省赤城縣某鵝養殖場送檢發病雛鵝。

1.2 試驗動物

15 日齡雛鵝，購自赤城縣某養鵝場，試驗前試驗室飼養 1 周。

1.3 方法

1）雛鵝發病及剖檢 詢問并記錄養殖戶雛鵝發病情況，剖檢送檢的病死雛鵝。

2）細菌的分離純化 無菌采集病死雛鵝肝臟，用高壓滅菌后的 棉拭子采集肝臟內部細菌，涂布于鮮血瓊脂平板，參考文獻中的方法將平板放置于燭缸中進行培養[4]。挑取優勢菌株在小牛血清體積 分數為 0.05 的 TSB 培養基進行純化培養，并對分離菌進行革蘭氏 染色，鏡檢。

3）分離菌的生化鑒定 參照生化反應管說明書對分離菌進行生化鑒定，并參照說明書統計試驗結果。

4）分離菌的 16S rDNA 序列分析 提取分離菌 DNA 作為模板， 16S rDNA 通 用 引 物 （序 列 為 16S-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，16S-R：GGTTACCTTGTTACGACTT）進 行 PCR，隨 后進行產物測序，用 Lasergene 軟件上的 Megalign 功能建立進化 樹和同源性分析。

5）分離菌的致病性試驗 參考文獻中的方法制備菌液濃度為 1× 108cfu/mL 的分離菌菌液[5]。試驗分為試驗組和對照組，每組 5 只雛鵝。試驗組雛鵝肌肉注射 0.5mL 調整濃度后的菌液。對照組每 只雛鵝注射 0.5mL 無菌的 PBS，觀察雛鵝狀態，并將病死雛鵝進行 剖檢，分離病死雛鵝內臟細菌并鑒定。

6）分離菌的藥物敏感性試驗 按照美國臨床和試驗室標準協會 （CLSI）的 K-B 紙片擴散法操作標準進行分離菌的藥物敏感性試驗。

2 結果

2.1 雛鵝臨床癥狀及病理變化

該養殖場共飼養雛鵝 5，000 只，發病雛鵝 1，000 只，發病率為 20%，病死率 90%。發病雛鵝精神倦怠，不食，排黃綠色稀糞，運動 失調。對病死雛鵝進行剖檢，發現其心包膜以及肝臟表面有明顯纖 維素性滲出物。

2.2 菌落與細菌形態

在鮮血瓊脂平板上，菌落呈露珠狀，表面光滑，濕潤。半透明， 直徑約為 1mm。分離菌為革蘭氏染色陰性小桿菌，大部分單個散落存在。

2.3 分離菌的生化鑒定

試驗結果顯示，分離菌不發酵葡萄糖、果糖、蔗糖，VP 試驗、硫化 氫產生、尿素分解、硝酸鹽還原、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽利用和靛基質試驗均為陰性。將試驗結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）中鴨 疫里默氏桿菌的生化特性比較，符合鴨疫里默氏桿菌的生化特性。

2.4 分離菌 16S rDNA 序列分析

結果顯示，分離菌與 NCBI 中的鴨疫里默氏桿菌參考菌處于同 一分支，與大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌與巴氏桿菌的不處 于同一分支。同源性分析結果顯示分離菌與 NCBI 中的鴨疫里默氏桿菌參考菌同源性在 99%以上。上述結果表明分離菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.5 致病性試驗

分離菌感染雛鵝后，雛鵝出現精神萎靡，站立障礙、不食、腹瀉等癥狀，96h 后全部死亡。觀察對照組雛鵝連續 2 周，未出現病征 以及死亡。剖檢病死雛鵝，其心包膜與肝臟表面有明顯纖維素性滲 出。從人工感染后病死雛鵝肝臟、心臟等臟器同樣分離出鴨疫里默氏桿菌，對照組未分離出該菌。表明分離到的鴨疫里默氏桿菌對雛 鵝具有一定的致病性。

2.6 藥物敏感性試驗

試驗結果顯示，分離菌僅對阿莫西林表現敏感，對青霉素、氨 芐西林和新霉素等 7 種抗生素表現中敏，對慶大霉素、卡那霉素和大觀霉素等 8 種抗生素表現耐藥。表明分離菌具有多重耐藥性。

3 討論

鴨疫里默氏桿菌病是在雛鵝養殖過程中的常見疾病之一，并 且在雛鵝養殖過程中有較高的發病率及死亡率[6]。近年來，從雛鵝 上分離到鴨疫里默氏桿菌的報道日益增多，江蘇、四川、山東、上海 等省市均有鵝感染鴨疫里默氏桿菌的報道[3，5，7-10]，并且分離菌株具 有較高的致病性。本次研究從河北省赤城縣的某肉鵝場病死鵝體 內分離到 1 株鴨疫里默氏桿菌，并采用肌肉注射的方式感染雛鵝， 該方法是目前臨床研究中較常見的鴨疫里默氏桿菌的感染方式， 結果顯示分離菌株可致雛鵝死亡，表明分離菌株具有一定的致病性，因此，在鵝養殖過程中，鴨疫里默氏桿菌病的防治應得到重視。目前細菌病主要通過抗生素類藥物進行治療[11]。試驗的 6 類 16 種 藥物中（其中諾氟沙星、氧氟沙星為農業部公告的禁用獸藥，僅用 于研究），分離菌僅對阿莫西林表現敏感，對慶大霉素、卡那霉素等 8 種藥物表現為耐藥，具有多重耐藥性，并且對同一類的不同藥物 敏感性差異較大，這可能與該場在送檢前應用抗生素類藥物治療有關。將藥物敏感性試驗結果反饋該養殖場，該場應用阿莫西林治療病鵝，2d 后，雛鵝發病情況得到控制。姜安安等[7]、楊永勝等[8]、趙 寶華等[10]的研究表明，從安徽、四川、揚州分離 RA 菌株對 β - 內酰 胺類藥物敏感性最高，而且本次研究與趙寶華等[10]的藥物敏感性 試驗中發現阿莫西林的抑菌效果最佳，但該現象是否普遍存在需 進一步研究。本次分離到的 RA 與其他報道菌株相比，耐藥性更強， 這可能與地方用藥以及治療情況不同有關。

本次研究從河北省赤城縣某發病鵝場的雛鵝分離到 1 株鴨疫里默氏桿菌，并對分離菌進行致病性試驗和藥物敏感性試驗，發現 分離菌對雛鵝具有一定的致病性和多重耐藥性。

參考文獻：

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