外源脫落酸緩解UV-B脅迫對牛皮杜鵑氣孔及光合特性的影響

李悅 張慶怡 董佳偉 徐洪偉 周曉馥

摘要：為探討外源脫落酸（abscisic acid，簡稱ABA）緩解紫外線-B（UV-B）脅迫對植物氣孔及光合特性的影響。本試驗以牛皮杜鵑（ Rhododendron chrysanthum ?Pall）為試驗材料，共設PAR、UV-B、 ABA+PAR及 ABA+UV-B等4組處理，測定氣孔、花青素（anthocyan）含量以及葉綠素熒光參數，并進行對比分析。結果表明，UV-B脅迫使牛皮杜鵑氣孔特征、花青素含量、 F? m、 F? v/ F? m、 F? v′/ F? m′、 F? v/ F? o、 q? P顯著降低（ P <0.05）， q? P快速光響應曲線下降幅度增大， ABA預處理顯著提高了花青素的含量、 F? m、 F? v/ F? m、 F? v′/ F? m′、 F? v/ F? o、 q? P（ P <0.05），且使 ?q? P、NPQ快速光響應曲線呈現出最佳狀態。這些結果證實了外源ABA能緩解UV-B對牛皮杜鵑光合系統造成的損傷，提高了其光合能力，從而提高了牛皮杜鵑對UV-B的耐受能力。

關鍵詞：牛皮杜鵑;UV-B;外源脫落酸;花青素;葉綠素熒光參數

中圖分類號： S685.210.1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0145-07

收稿日期：2021-07-09

基金項目：吉林省科技發展計劃（編號：20190301059NY）;中央指導地方科技發展資金吉林省基礎研究專項（編號：202002016JC）。

作者簡介：李 悅（ 1998—），女，吉林白城人，碩士研究生，研究方向為植物遺傳學。E-mail：13194363751@163.com。

通信作者：周曉馥，博士，教授，博士生導師，主要從事植物分子生物學研究。E-mail：zhouxiaofu@jlnu.Edu.cn。

牛皮杜鵑（ Rhododendron chrysanthum ?Pall），別稱牛皮茶，是一種具有重要觀賞和藥用價值的瀕危物種，是我國長白山的特有物種，也是研究植物耐逆性的重要植物資源[1]。長白山環境惡劣，空氣稀薄，太陽輻射強烈，其中紫外線-B（UV-B）輻射是該地區主要的非生物脅迫因子[2]。

UV-B脅迫會對植物的生理代謝造成影響[3]。孟凡來等都指出，UV-B輻射脅迫可造成葉綠體結構的破壞或使葉綠素發生光氧化，從而導致葉綠素含量的下降[4-5];徐超群表示，UV-B輻射會導致葉綠素和類胡蘿卜素上的雜環與共軛雙鍵產生活性氧，進而破壞細胞穩態，與此同時，類胡蘿卜素的含量在UV-B的輻射下，也會發生顯著變化[6]。研究顯示，類胡蘿卜素分子所含有的共軛雙鍵既能參與光能的捕獲又可耗散過剩光能，能夠防御光氧化對葉綠素的不利影響，同時也導致了自身含量的減少[4-5，7]。

脫落酸（abscisic acid，簡稱ABA）具有引起休眠、抑制生長、促進脫落的生理作用。研究證明，ABA在植物遭受干旱、低溫、鹽漬等不良環境脅迫時可快速做出響應，其含量的增加能很好地增強植物的防御能力，因此又稱ABA為“脅迫激素”[8-9]。王娟通過研究發現，外源ABA可以改善在干旱條件下的煙草幼苗的葉黃素循環，從而耗散了過剩的激發能，在一定程度上提高了煙草幼苗的抗旱性[10]。劉曉龍發現，外源 ABA 預處理顯著抑制了堿脅迫導致的根系活性氧（ROS）過量積累，提高抗氧化酶活性并緩解堿脅迫導致的水稻根系損傷和幼苗死亡[11]。目前，對外源ABA增強牛皮杜鵑抗UV-B脅迫能力的研究還比較少。

氣孔作為植物體和外界進行H 2O和CO 2交換的重要介質，當植物遭受脅迫時會通過調整氣孔的開度等特征來抵御損傷，這也是植物對于脅迫耐受能力的體現。McAinsh等發現，脫落酸能夠通過Ca2+依賴和Ca2+非依賴途徑調節氣孔大小，適應外部逆境[12-13]。然而，目前有關外施脫落酸對逆境脅迫下作物苗期葉片氣孔特征和光合性能的研究還鮮見報道。通常外施脫落酸能夠誘導氣孔關閉和氣孔密度，降低氣孔導度，從而影響光合速率。

類黃酮（flavonoids）是植物中再生代謝產物的主要類型，它主要以糖苷的形式存在于植物液泡中，莫運才通過研究發現，在低UV-B輻射下，植物會誘導類黃酮合成，隨著UV-B輻射強度的增加，植物會消耗類黃酮以抵御損傷[14]。

葉綠素熒光參數已經被認為是衡量植物受 UV-B 輻射傷害及植物抗性的重要指標。本試驗采用PAM熒光計進行測量葉綠素熒光的各項參數，試驗主要研究的參數如表1所示。

本研究以牛皮杜鵑為材料，探究外源ABA對牛皮杜鵑在UV-B脅迫下氣孔、花青素含量以及葉綠素熒光參數所受影響的緩解效應，以期為ABA對植物的抗輻射功能提供理論支持，同時為外施ABA以增強植物耐受性與抗性提供可行方案與指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛皮杜鵑采自長白山（40.10° N、100.10° E），用 1/4 MS 培養基置于吉林師范大學吉林省植物資源科學與綠色生產重點實驗室模擬高山植物智能人工氣候室中正常培養[光暗周期為14 h/10 h;白天/夜晚溫度為18 ℃/16 ℃;光子通量密度為 50 μmol/（m2·s）]。本試驗選取 8 個月大且長勢一致的牛皮杜鵑組培苗為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 選用相同生長狀態的牛皮杜鵑組培苗作為試驗材料。共設4組處理，分別記為PAR、UV-B、ABA+PAR、ABA+UV-B，每組處理均設置3次生物學重復。第1組與第2組采用空白處理的1/4 MS培養基對牛皮杜鵑進行移栽，第3組與第4組采用另添加ABA（100 μmol/L）的1/4 MS培養基對牛皮杜鵑進行移栽，移栽后置于人工氣候室培養6 d后，將第2組與第4組植物于UV-B輻射（2.3 W/m2）下脅迫8 h/d，UV-B輻射處理2 d后進行各項指標的測定。本試驗利用人造UV-B輻射燈管進行UV-B輻射，燈管的波長發射范圍為280～320 nm。于進行UV-B處理的牛皮杜鵑上方放置295 nm濾光片（Edmund，Filter Long 2IN SQ，USA）以排除干擾;于不進行UV-B處理的牛皮杜鵑上方放置400 nm濾光片（Edmund，Filter Long 2IN SQ，USA）以過濾輻射。

1.2.2 牛皮杜鵑氣孔特征的測定

取牛皮杜鵑葉片中部靠葉脈處2 mm×2 mm 小塊，將透明指甲油均勻涂抹于葉片背面分別采集葉片氣孔，制成臨時裝片，每個處理制作 3 張臨時裝片，每張臨時裝片里隨機選擇 5 個視野，利用顯微攝像系統（Model C-SHG 1，Nikon Corp，日本）進行觀察和拍照，每個處理得到15張氣孔結構圖片，隨機選取 3 張圖片。然后，利用Image J軟件分別測量氣孔的長度、寬度、周長和面積，進一步計算氣孔形狀指數。氣孔形狀指數的計算公式為 S=P/2 π A （以圓為參照幾何形狀）。式中：S為葉片氣孔形狀指數;P表示氣孔周長;A表示氣孔面積。

1.2.3 牛皮杜鵑花青素含量的測定

花青素含量用分光光度法測定。將新鮮葉片按照25 ∶9的比例在甲醇與鹽酸（體積比為99 ∶1）的混合液中組成細胞勻漿，室溫下黑暗中提取3 d，在546 nm處讀取提取物的吸光度以測定花青素含量，吸光度用葉片處于新鮮狀態時的質量表示。

1.2.4 牛皮杜鵑PS Ⅱ葉綠素熒光參數測定及相關參數計算

利用IMAGING-PAM 葉綠素熒光成像系統（Heinz Walz，德國）對其進行葉綠素熒光參數的測定，在相同葉齡的葉片上選取 3 個觀測點，暗適應 20 min 后對初始熒光（ F? o）、最大熒光（ F? m）、光下最大熒光（ F? m′）以及光下最小熒光（ F? o′）進行測定并計算以下參數，同時對 ?q? P、NPQ 和電子傳遞效率（ETR）快速光響應曲線進行測定。

光系統Ⅱ（PS Ⅱ）的最大量子產量： F? v/ F? m=（ F? m- F? o）/ F? m;

光系統Ⅱ（PS Ⅱ）的有效量子產量： F? v′/ F? m′=（ F? m′- F? o′）/ F? m′;

光系統Ⅱ（PS Ⅱ）的潛在活性： F? v/ F? o=（ F? m- F? o）/ F? o;

光化學淬滅系數： q? P=（ F? m′- F? s）/（ F? m′- F? o′）;

非光化學淬滅系數：NPQ=（ F? m- F? m′）/ F? m′。

1.2.5 數據統計與分析

采用統計軟件SPSS 22.0對試驗數據進行差異顯著性分析（ P <0.05），利用非線性擬合曲線對參數進行計算，采用Sigmaplot 12.5軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 外源ABA與UV-B脅迫對牛皮杜鵑花青素含量的影響

通過對數據進行分析發現，與PAR組相比，UV-B 輻射處理顯著降低了花青素含量（ P <0.05），數值下降40.42%;ABA+PAR組的花青素含量顯著降低（ P <0.05），數值下降25.70%;經過UV-B、ABA雙重處理的牛皮杜鵑表現出了更高的花青素含量，為36.703 mg/g（表2、圖1）?；ㄇ嗨刈鳛楣J的抗紫外化合物，在植物抗紫外輻射中起到至關重要的作用，高強度的紫外輻射消耗了植物體中花青素的含量，降低了植物的色素含量，破壞了植物葉綠體，從而影響植物正常的光合作用。ABA單一處理使牛皮杜鵑花青素含量降低，但在ABA和UV-B的雙重作用下提高了花青素含量水平，說明ABA通過調控花青素含量來保持牛皮杜鵑體內色素含量的穩定，增強其光合能力，具有緩解UV-B脅迫對牛皮杜鵑的負面影響的作用。

2.2 外源ABA與UV-B脅迫對牛皮杜鵑氣孔的影響

為探究UV-B脅迫對氣孔的影響，制作牛皮杜鵑氣孔臨時裝片，在顯微鏡成像系統下觀察并拍攝照片進行測量及數據分析。與PAR組進行對比，UV-B脅迫顯著降低了氣孔長度、寬度、 周長及面積，

數值分別降低16.32%、26.52%、11.85%、28.68%;UV-B脅迫同時顯著增高了形狀指數（ P <0.05），數值升高33.33%;與PAR組相比，ABA+PAR組的氣孔特征變化顯著，氣孔長度、寬度、周長及面積均顯著下降（ P <0.05），數值分別降低14.43%、19.61%、13.86%、26.35%;與UV-B組相比，ABA+UV-B組的氣孔特征除寬度外均下降，但并不顯著（ P >0.05）。氣孔作為植物和外界交換H 2O 和 CO 2的重要介質，當植物遭受脅迫后會通過調整氣孔特征以抵御損傷。當牛皮杜鵑遭受UV-B脅迫后，氣孔長度、寬度、周長及面積等指標均顯著降低，氣孔開度減小，從而減弱蒸騰作用減少水分散失，UV-B引起過多的光抑制，以致過多的熱量無法通過蒸騰作用散發到外界環境中。外源ABA通過增加氣孔寬度提高蒸騰速率，使由 UV-B 造成的光抑制而無法散出的熱量散發，提高光合速率，并使CO 2更易通過氣孔擴散進入到牛皮杜鵑葉片組織內部，影響光合作用的最大反應速率，從而提高牛皮杜鵑對UV-B脅迫的耐受性（表3、圖2）。

2.3 外源ABA與UV-B對牛皮杜鵑葉綠素熒光圖像的影響

為探究ABA與UV-B脅迫對牛皮杜鵑葉綠素熒光圖像的影響，將2組材料分別進行PAR和UV-B輻射處理，在脅迫前后分別進行葉綠素熒光參數的測定。圖3顯示了在PSⅡ光系統中經過各種處理的牛皮杜鵑的 F? o和 F? m圖像。 其中 F? o是初始熒光值，其數值大小取決于PSⅡ光系統中心是否受到損傷，當PSⅡ光系統反應中心遭到破壞時， F? o數值會提高。 F? m是熒光的最大值，是處于黑暗適應狀態下關閉植物光反應中心時的熒光強度。 F? m數值反映PSⅡ光系統電子傳遞的情況，是體現植物承受脅迫能力的一個重要特性。由圖3可知，與PAR組相比，牛皮杜鵑在經受UV-B脅迫后，生長受到限制，其生長態勢并無明顯變化，說明UV-B脅迫使牛皮杜鵑的生長速度減緩;并且通過圖像可以發現，在經受UV-B脅迫后，牛皮杜鵑的發病區域多為葉片，葉片承受UV-B脅迫，這也體現了 UV-B 脅迫最初以及最主要的作用目標便是光合作用。

2.4 外源ABA與UV-B脅迫對牛皮杜鵑PSⅡ葉綠素熒光動力學的影響

2.4.1 UV-B脅迫對牛皮杜鵑PSⅡ葉綠素熒光動力學的影響

F? o為初始熒光，其數值大小取決于 PSⅡ 光系統中心是否受到損傷，當PSⅡ光系統反應中心遭到破壞時， F? o提高。PSⅡ光系統的最大光化學效率（ F? v/ F? m）也是原初光能轉化效率，反映PSⅡ光系統活性，以及植物在受逆境脅迫下的光抑制程度。當光合系統吸收過量的光能時，PSⅡ 光系統活性就會下降，這種現象稱為“光抑制”。 F? v′/ F? m′為PSⅡ光系統有效光化學效率，可以將捕獲的光能轉化為生物所需的化學能，反映了PSⅡ光系統反應中心原初光能的捕獲效率。 F? v/ F? o作為植物PSⅡ光系統的潛在活性，其變化反映出植物在受到脅迫后光合生理活性的變化。通過分析得知，與PAR組相比，UV-B組 F? o值顯著升高（ P <0.05）， F? v/ F? m的值降低但無顯著影響（ P >0.05）， F? v′/ F? m′、 F? v/ F? o的值顯著降低（ P <0.05）（表4、圖4）。說明牛皮杜鵑在受到UV-B脅迫后，初始熒光和有效光化學效率降低，光能利用率降低，導致PSⅡ光系統潛在活性受損，最終導致光化學電子進入碳還原過程受到抑制，降低了牛皮杜鵑的光合能力。

q? P是光化學猝滅系數，反映了PSⅡ光系統反應中心開放的比例和參與碳固定轉移的電子， q? P越大，說明植物進行光合作用利用的光能越多。NPQ是非光化學猝滅系數，反映了植物PSⅡ天線色素吸收光能后不能用于光化學電子傳遞，而以熱能形式耗散掉未利用光能的部分。與PAR組相比，UV-B組的 q? P顯著降低，NPQ顯著升高。 q? P的降低說明 PSⅡ光化學電子傳遞活性降低，與 ?F? v/ F? m、 F? v′/ F? m′ 和 ?F? v/ F? o 的下降相吻合。而NPQ的升高，說明 UV-B 引起了過多的光抑制（表4）。

2.4.2 外源ABA緩解UV-B脅迫對牛皮杜鵑 PSⅡ 葉綠素熒光動力學的影響

與PAR組相比，外源ABA處理后初始熒光、最大光化學效率、有效光化學效率無明顯改變，與PAR組持平;與UV-B組相比，在ABA+UV-B處理后，牛皮杜鵑的 F? o降低，但并無顯著差異（ P >0.05）， F? v/ F? m、 F? v′/ F? m′ 、 F? v/ F? o以及 q? P顯著提高（ P <0.05），并與PAR組基本持平，而NPQ與PAR組相比顯著升高（ P <0.05）。這些結果都說明外源ABA可以提高牛皮杜鵑PSⅡ的光合電子傳遞，從而緩解了UV-B脅迫對牛皮杜鵑的負面影響（表4）。

2.5 外源ABA與UV-B脅迫對牛皮杜鵑PSⅡ葉綠素熒光快速光響應曲線的影響

2.5.1 外源ABA緩解UV-B脅迫對牛皮杜鵑 PSⅡ ?q? P快速光響應曲線的影響

q? P是光化學淬滅系數，反映了PSⅡ反應中心開放的比例和參與了碳固定轉移的電子， q? P數值越大說明植物進行光合作用利用的光能越多。對結果進行分析可知，不同處理的 q? P快速光響應曲線呈現出不同的變化趨勢，與PAR相比，UV-B輻射處理后 q? P快速光響應曲線呈現明顯的下降趨勢，且隨著光照度的增加，其 q? P下降的幅度最小，這與 q? P動力學數值的下降表現一致，且隨著光照度的增加，ABA 預處理的 ?q? P 快速光響應曲線呈現出最佳狀態，在光照度不斷增加的過程中，UV-B處理的 q? P下降的幅度最小。由此可見，經UV-B脅迫的牛皮杜鵑光合能力變弱，對光能的利用率大大降低，而ABA能夠提高光能利用率，從而緩解UV-B的負面影響（表4、圖5）。

2.5.2 外源ABA與UV-B脅迫對牛皮杜鵑PSⅡNPQ快速光響應曲線的影響

植物處于UV-B脅迫時，PSⅡ天線色素吸收UV-B的高能光量子，不能用于光合電子傳遞的過量激發能以熱能形式淬滅，即非光化學淬滅，其份額可由非光化學淬滅系數NPQ來反映。通過對結果進行分析可知，與PAR組相比，牛皮杜鵑在受到UV-B脅迫后，NPQ快速光響應曲線呈現下降趨勢，這與NPQ數值的顯著降低（ P <0.05）表現一致（表4、圖5）。說明UV-B脅迫導致了牛皮杜鵑光合能力的顯著降低，引起了過多的光抑制，出于自我保護，牛皮杜鵑使NPQ上升，將不能利用的光能以熱能的形式散失以求部分減輕因PSⅡ吸收光能過多而導致的光氧化。

與PAR組相比，ABA+PAR組NPQ顯著上升（ P <0.05）;而與UV-B組相比，ABA+UV-B組NPQ顯著降低（ P <0.05）。并且NPQ快速光響應曲線在不同處理下隨著光照度的增大而呈現出不同趨勢，其上升幅度表現為ABA+PAR>PAR>ABA+UV-B>UV-B（表4、圖5）。這說明外源ABA預處理后可使NPQ快速光響應曲線上升，即減輕了牛皮杜鵑PSⅡ中過剩光能的光抑制效應，進而增強光保護能力。

3 討論與結論

植物在受到UV-B輻射脅迫時，會產生各種適應、傷害與修復機制。梁東雨等研究發現，UV-B輻射會使植物光系統Ⅱ受損，使光合作用的原初反應過程受到抑制[2]。陳娟等研究發現，ABA可以誘導葉片氣孔開度受抑或氣孔關閉、蒸騰作用下降，因而水分耗散減少，最終使植物保水能力和對干旱的耐受性提高;在外源ABA作用下可加強活性氧的清除，減緩膜脂過氧化對膜系統造成的損傷，從而維護光合系統的正常功能[16]。

本試驗中，UV-B脅迫限制了牛皮杜鵑的生長發育過程，具體表現為植株氣孔特征的降低，葉片的 F? v′/ F? m′、 F? v/ F? o顯著降低。然而，外施ABA可以通過調整氣孔的形態特征及其空間分布格局有效緩解了UV-B脅迫對牛皮杜鵑造成的負面影響。牛皮杜鵑在單一的UV-B輻射和外施ABA下其光合色素含量并沒有顯著變化，而ABA與UV-B雙重處理的花青素含量卻發生了顯著變化，花青素作為次生代謝物質類黃酮的一種，是植物抵御UV-B脅迫的主要物質，花青素含量的升高是牛皮杜鵑對UV-B的一種適應。在UV-B脅迫下，牛皮杜鵑PSⅡ的 F? v/ F? m受到影響但并不顯著，而 F? v′/ F? m′、 F? v/ F? o數值均顯著降低，使潛在活性降低，導致光化學電子進入碳還原過程受到抑制，從而引起光系統損傷，導致光合生理活性下降。而ABA可以緩解UV-B脅迫對牛皮杜鵑PSⅡ光合特性造成的負面影響。結果表明，在ABA與UV-B的雙重處理下 F? o數值回落以及 F? v/ F? m、 F? v′/ F? m′、 F? v/ F? o有所升高，并能基本恢復到PAR組水平。并且在外源ABA作用下，ABA+UV-B組的 q? P和 NPQ快速光響應曲線都呈現出最佳狀態。

綜上所述，這些結果都證明了ABA可以緩解UV-B對牛皮杜鵑造成的負面影響，可以增強光合作用且使花青素等物質積累以減輕傷害，并幫助其更好地適應逆境。

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