氧化石墨烯的表面處理及其在生物醫學領域的應用

張園園 楊寧文 何星

摘要：氧化石墨烯（ graphene oxide， GO ）表面具有豐富的含氧基團。通過共價鍵結合、疏水作用、氫鍵作用等吸附藥物和其他大分子對 GO 表面微觀結構的修飾可提升其實用性。尤其是對生物相容性的增強使得功能化的 GO 可以在臨床醫學領域得到廣泛應用。介紹了 GO 表面處理的原理，總結了近幾年國內外研究人員在 GO 表面修飾方面的研究進展，歸納了修飾后具有優異性能的功能化氧化石墨烯（ functionalized graphene oxide， FGO ）在生物醫學領域中的廣泛應用，包括疫苗載體、癌癥治療、藥物輸送和基因治療等方面。最后指出，通過加強對 GO 的進一步研究，可使其在未來的生物醫學領域發揮關鍵作用。

關鍵詞：氧化石墨烯;表面處理;功能化氧化石墨烯;臨床醫學;癌癥治療

中圖分類號： R 318.08文獻標志碼： A

Surface treatment of graphene oxide and its application in biomedical field

ZHANG Yuanyuan， YANG Ningwen， HE Xing

（School ofMaterials and Chemistry， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China）

Abstract： Graphene oxide （GO） surface is rich in oxygen-containing groups. Through adsorption drugs including covalent bonding， hydrophobic interaction and hydrogen bonding， and other macromolecules tomodifythesurfacemicrostructureof GO，itspracticabilitycanbeimproved. Inparticular，the enhancement of biocompatibility makes the functional GO widely used in the field of clinical medicine. The principle of GO surface treatment was introduced， the research progress of researchers at home and abroad in GO surface modification in recent years was summarized， the different modifications carried outbydomesticandforeignresearchersongoinrecentyearsweresummarized，andthewide applicationsof functionalizedgrapheneoxide （FGO） withexcellent propertiesin biomedicalfield， including vaccine carrier， cancer treatment， drug delivery and gene therapy， were concluded. Finally， it was pointed out that further research on GO could play a key role in the future biomedical field.

Keywords： grapheneoxide ; surfacetreatment; functionalizedgrapheneoxide ; clinicalmedicine ; cancer treatment

石墨烯的興起推動了電子器件、能源等各個領域的巨大變革[1-3]。最近十幾年，科學家們付出了巨大的努力來探索石墨烯，對其物理和化學性質有了更深入的了解。在碳基材料中，石墨烯及其衍生物因多功能性和可改性而備受關注，石墨烯具有大比表面積、導熱、導電、容易被修飾或功能化，使它成為生物醫學應用領域的獨特候選材料，然而，它在水和許多有機溶劑中的不良分散性限制了它在生物醫學領域中的應用。

氧化石墨烯（graphene oxide， GO）是通過對石墨烯進行氧化處理獲得的，它保留了石墨烯大的平面結構和大的比表面積，同時引入了親水基團，如環氧基、羥基（存在于片的頂面和底面）以及羧酸基團（存在于邊緣）[4]。這些親水基團可以通過氫鍵、靜電作用、π-π堆積和共價鍵與其他物質相互作用，使得 GO 成為生物活性分子的潛在載體平臺，因此， GO 被用作石墨烯的潛在替代品，以取代其生物應用，在藥物輸送、癌癥治療和治療診斷學等生物醫學方面都有廣闊的應用前景。

1GO 表面處理的原理

1.1GO 的結構

GO 是一種典型的二維片層結構，具有含氧基團和單原子層[5]。GO 的片層結構由 sp2和 sp3兩種碳原子排列成的六邊形網格構成，使 GO 具有大的表面積和疏水性[6]。羥基、羰基[7]和環氧基等含氧基團分布在骨架的表面和邊緣[8]。一般來說，GO 是由石墨烯通過各種氧化方法制備而成（見圖1），其中最常用的是改進 Hummers 法[9]。雖然不同合成方法制備的 GO基本一致，但在某些方面或性質上，如橫向尺寸、含氧基團數量等方面容易產生一些差異。含氧基團包括羥基、羰基和環氧基，這些基團的

引入使 GO 變成水溶性的[10]。然而，這些基團中最重要的是羧基，因為它為功能化氧化石墨烯（functionalized graphene oxide， FGO）的合成提供了基礎。芳香晶格通過π-π堆積或疏水相互作用也為 GO 的修飾提供了基礎[11]。用親水性生物材料改性后， GO 在生物溶液中的溶解性和穩定性得到改善[12]，因此， FGO 具有比 GO 更好的生物相容性[13]和更好的遞送能力[14]。

雖然 GO 可溶于水，但由于電荷屏蔽效應，GO 在鹽溶液（生理鹽水）中容易聚集，其毒性也可能限制其臨床應用，如誘導血小板減少、溶血、肺和肝的病理損傷等[15-16]。眾所周知，納米材料的表面化學性能是其生物相容性的關鍵。因此，對其進行改性以制備具有功能化的 GO 是非常重要的。一般來說， GO 的功能化有兩種方法：（1）共價結合，含氧基團的反應是共價修飾的常用方法;（2）非共價結合，靜電結合和疏水相互作用在非共價修飾中占主導地位。

1.2GO 的共價結合

GO 中的羧基，是其共價結合的關鍵。通常通過在 GO 和其他給定的物質之間形成酰胺鍵（見圖2a）或酯鍵（見圖2b）而實現共價結合，通過上述方法已經成功地合成了一些 FGO材料，如 GO-PEI、 GO-PEG、GO-PEG-PEI、GO-PAMAM（（PEI，聚醚酰亞胺; PEG，聚乙二醇; PAMAM，聚酰胺-胺型樹枝狀高分子）等[17-20]。給定的物質通常具有伯氨基或羥基，能與羧基表現出良好的親核反應[21]，然而，羧基不像酸酐或酰氯那樣具有活性，通常需要被活化，因此，它首先被偶聯試劑如 N-羥基琥珀酰亞胺（N- Hydroxysuccinimide，NHS）和1-乙基-3-（3′-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（1-（3-dimethylaminopropyl）-3- ethylcarbodiinide hydrochloride，EDC）活化，或者用亞硫酰氯（Thionyl chloride，SOCl2）分別官能化以產生酰亞胺或酰氯基團。然后，通過活化的羧基與給定物質的一個或多個羥基、氨基或巰基反應，獲得 FGO，其化學和電學性能可以通過共價修飾的調控來實現[22]。

1.3GO 的非共價結合

雖然共價結合是制備 FGO 的常用方法，但是 GO 的帶負電荷性和局域π電子的存在使得非共價結合成為 GO 功能化的另一種重要的方法（見圖3）。通過簡單地將 GO 與給定物質混合，并進行短時間的超聲處理，很容易制備非共價 FGO。

帶負電荷的羧基使 GO 具有負的 zeta 電位，這賦予它與帶正電荷的分子可以通過靜電作用而結合[23]。Bao 等[24]報道了通過帶陽離子的殼聚糖（chitosan， CS）和帶負電荷的 GO 之間的靜電作用來制備 CS 功能化的 GO（GO-CS）。CS 賦予 GO-CS 正 zeta 電勢，這可能促使 GO-CS 與帶負電荷的細胞膜相互作用，以促進細胞攝取。同CS 一樣，多環芳烴也帶有正電荷，可以與 GO 通過靜電作用結合[25]。蛋白質、多肽等通過多種氨基酸組合的復雜大分子物質由于其疏水性和芳香性，可以通過π-π堆積或疏水作用使 GO 功能化。如牛血清白蛋白和轉鐵蛋白，兩者都可以通過π-π堆積或疏水作用使 GO功能化;靶向分子與某些蛋白質的復合物也可以物理吸附到 GO 上來構建基于 GO 的靶向遞送載體，應用于藥物輸送。

2FGO 的應用

2.1 疫苗載體

疫苗是預防和控制傳染病、非傳染病和癌癥的最有效策略之一。佐劑和載體已被適當地添加到疫苗配方中，以提高抗原的免疫原性并誘導持久的免疫。一些批準用于人體的佐劑功能有限，迫切需要開發新的通用佐劑。 GO 在裝載和遞送抗原方面表現優異，而且顯示出激活免疫系統的潛力，因此，廣泛應用于生物分子的遞送。

2013年，王亞培[26]在 GO 表面共價修飾靶向分子透明質酸（hyaluronic acid， HA），形成 GO-HA 納米藥物載體材料，并進一步研究了所得材料的生物相容性以及載藥材料對荷瘤裸鼠的治療效果。2017年，Zhang 等[27]報道了GO-CS（77.6μg/mg）比GO （小于40μg/mg）表現出更高的負載效率;另一種FGO-PEG-PEI 作為 CpG ODNs（CpG oligonucleotide） 的高效載體，也促進了細胞對 CpG ODNs 的攝取和細胞因子的表達，這歸因于帶正電荷的 PEI 和帶負電荷的細胞膜之間的相互作用。2016年， Luo 等[28]證實整合素（αvβ8）通過與插膜或膜吸附的 GO- PEG 相互作用而被激活，隨后觸發下游信號通路的激活和細胞因子的有效釋放而激活巨噬細胞。圖4為nGO-PEG 刺激αvβ8上調，然后激活 FAK 相關細胞內的信號通路，以促進巨噬細胞的細胞因子合成和分泌示意圖。隨后，免疫系統被這些細胞因子激活，包括白細胞介素-6（Interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α， TNF-α）和干擾素-γ（Interferon-γ， IFN-γ），PEG 引發強烈的免疫反應，而不會顯著損傷巨噬細胞，這使得它成為疫苗配方中一種有前途的佐劑。另一項研究報告表明， PEG 可以誘導RAW264.7細胞（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）高分泌 IL-6，這也證明了其免疫激活的活性[17]。

結合 GO-PEG-PEI 的樹突狀細胞（ dendritic cells， DCs）與未經處理的 DCs 相比，會導致對toll樣受體（toll-like receptor， TLR） TLR2（1.5倍）和 TLR4（1.7倍）的上調，及 TLR2和 TLR4陽性的比例增加了1.4倍和5.7倍。通過與過度表達的 TLR 結合， GO-PEG-PEI 可以有效地誘導 CD80和 CD86等共刺激分子的調節（CD80、CD86是活化 T 淋巴細胞時的協同刺激因子），導致 DCs 的成熟達到一個更高的水平。結合UreB（幽門螺桿菌尿素酶 B）后，GO-PEG-PEI-UreB疫苗大大增強了 T 細胞增殖和 TNF-α、IFN-γ和 IL-17（白細胞介素17，interleukin 17）等的分泌。這些結果證實了 GO-PEG-PEI 可以改善抗原的免疫原性，并刺激強大的細胞免疫力，從而， GO 可以作為潛在的輔助劑[29]。圖 5為接種 GO-PEG-PEI-UreB疫苗促進體內體液免疫和細胞免疫示意圖，表1為FGO 在疫苗載體中的應用。

2.2 癌癥治療

癌癥是一種高度復雜的疾病，目前，癌癥的治療方式包括手術、化療、放療、激素、靶向和聯合治療等[33-34]?；熅哂袕V譜、高效的抑制作用，是臨床抗癌應用中最常用的策略。然而，抗癌藥物，如阿霉素（doxorubicin，DOX）、喜樹堿（camptothecin，CPT）、紫杉醇（paclitaxel，PTX）、血根堿（sanguinarine， Sa）等，通常不溶于水，給臨床應用帶來很大不便，生物利用度較差。此外，抗癌藥物還具有非特異腫瘤靶向性、血液循環時間短、通過代謝迅速消除等缺點[35]。大量研究指出，將 GO 用作抗癌藥物的載體可顯著改善其理化性質并增強其抗癌功效。最初的研究主要集中在 GO 的高載藥量和生理穩定性方面。 Zhou 等[36]報道的 GO 的載藥率在200%以上，高載藥率主要是由于單層 GO 兩側藥物分子通過π-π堆積和疏水作用的高效吸附。對于臨床應用來說，載體上的藥物濃度越高，意味著對癌細胞的殺傷更高效，另一方面，細胞對藥物的吸收也是一個重要問題。通過能量介導的內吞途徑，載藥 GO 可以有效進入細胞，然后釋放藥物殺死癌細胞[37]。大多數用于癌癥治療的化療劑都具有一些缺點，包括對生物降解的敏感性、在血液循環中的低半衰期、差的藥物代謝動力學性質和向細胞中的被動擴散等。外排泵和藥物轉運體通常在癌細胞中過度表達，如糖蛋白，進一步降低細胞內的藥物濃度，限制了其治療效果[38-39]。這產生了對合適的藥物遞送載體的需求。 GO 載體，像其他納米材料一樣，可以保護藥物免受降解，并以所需的劑量直接將藥物（包括藥代動力學性質較差的藥物）輸送到細胞、細胞質中。

杜士彬[40]通過改良的 Hummers 法制備出的 GO，平均粒徑為（204.20±4.56）nm，電勢為?34.2 mV，用 PEG 與 GO 共價耦合得到復合物 GO-PEG。相比 GO，GO-PEG 生物相容性更好、毒性更低。許多腫瘤細胞表面葉酸受體過表達，葉酸受體可以與葉酸特異性結合。將葉酸（folate acid， FA）共價偶聯到 GO 表面，得到一種具有細胞靶向功能的載體 GO- PEG-FA，GO 的載藥率高達17.79%。GO-PEG-FA 將藥物 DOX 靶向輸送到腫瘤細胞，釋放出藥物殺死腫瘤細胞，達到腫瘤治療的目的。

據報道，羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose， CMC）共軛 GO 的 GO-CMC 負載 DOX 的復合物，在 pH 為5.5時，100 h 內釋放出約65%的負載藥物。然而，較高的 pH 時（6.5和7.4），藥物釋放分別限制在20%和10%[41]。在另一項研究中，GO 與 PEG 和多巴胺（dopamine， DA）修飾的聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAM）共軛，然后裝載 DOX。與 pH 為7.4（藥物釋放約6%）相比，制備的復合材料在 pH 為5.0（藥物釋放約31%）時，顯示出顯著增強的 DOX 釋放性能。負載藥物在酸性條件下的快速釋放主要是由于質子化介導的 DOX 溶解度增強，這也與 DA 的表面修飾有關[42]。CS 在 GO 納米片上的層層自組裝被用于開發新的 DOX 傳遞載體[43]。圖6為 GO- CS/Dex表面修飾和 DOX 負載的示意圖。體外藥物釋放研究表明，在 pH 為5時，藥物釋放高于在 pH為7.4時的。除了 pH外，基于谷胱甘肽的氧化還原、近紅外光或酶的存在/不存在也被用作觸發藥物釋放的潛在刺激。在谷胱甘肽介導的氧化-還原反應的幫助下，納米復合材料的累積釋放進一步增加。除此之外，用近紅外（波長808 nm）照射也導致在 pH 為7.4時藥物釋放的突然增加[44]。

王萍悅[45]在普朗克127（Pluronic F127）修飾 GO（PF127-GO）載鹽酸阿霉素抗人神經膠質瘤的體外研究中發現，在低濃度時， PF127-GO 及 GO 對人星形膠質細胞和人神經膠質瘤細胞無毒性作用，體外試驗中， PF127-GO-DOX對人神經膠質瘤細胞有較強的殺傷作用。

2.3 藥物輸送

醫用藥物在臨床實踐中發揮著不可替代的作用，但游離藥物在體內的釋放往往存在缺陷，包括非特異性靶向性、血液循環時間短、突釋等，導致其可用性低、治療效果差、副作用大[46]。為了避免上述游離藥物的缺點，實現智能可控的治療性能，藥物傳遞系統（drug delivery system， DDS）是通過將藥物封裝在特定載體中而開發的。在過去的幾十年中，開發了脂質體、聚合物膠束、樹枝狀大分子、無機介孔材料、金屬有機框架、金屬氧化物、貴金屬和碳納米材料等作為DDS 的載體[47-48]。其中，石墨烯基材料，尤其是 GO，由于其獨特的二維結構、超大的表面積、優異的穩定性、易修飾的表面特性、良好的生物相容性，以及有前景的產業化潛力，引起了人們的極大興趣[49]。單原子層骨架結構有利于藥物分子在 GO 表面的吸附和錨定，有助于提高藥物的負載能力。 GO 邊緣和表面豐富的含氧官能團賦予其優異的水溶性，這將大大提高不溶性藥物的親水性。此外，含氧基團易于修飾，為特定需求帶來多功能和可控的表面改性潛力。

例如，結合 CS 的 GO 被用于遞送 DOX 和聚對苯二甲酸丙二醇酯（polypropanediol terephthalate， PTT），對細胞發揮抗癌活性[43]。將負載半胱氨酸和HNPa（感光劑）的 CS 進行改性，然后與 GO 相結合用于肝癌細胞的化療、靶向治療[50]。這種顆粒表現出靶向受體的細胞內遞送，其中 DOX 和HNPa被釋放（刺激反應性化療的一部分）。HNPa和 GO 被近紅外光照射導致活性氧（reactive oxygen species， ROS）產生，從而 PDT（PDT，光動力療法）產生良好的協同療效。

吳少玲[51]在用 GO 吸附 DOX 的試驗中發現， GO 在研究的濃度范圍內（0～100 mg/L）對多發性骨髓瘤細胞有低毒性; GO 不降低 DOX對多發性骨髓瘤細胞的細胞毒性，也不影響多發性骨髓瘤細胞的細胞周期; GO 不誘導多發性骨髓瘤細胞調亡，也不影響 DOX 誘導細胞凋亡的能力。表明 GO 是一種良好的納米藥物載體。

PEG 是一種應用廣泛的表面改性聚合物，可以避免 GO 在生理環境中的非特異性蛋白質吸附和聚集。因此， PEG 修飾的 GO 表現出更好的生理穩定性和更高的生物安全性[13]。Xu 等[52]利用 PEG 修飾的 GO 的獨特性質，采用 GO-PEG 作為 PTX 遞送的納米載體，所制備的 GO-PEG-PTX 在磷酸鹽緩沖液和培養基中均表現出良好的穩定性，而未改性的 GO 樣品發生聚集和沉淀。聚丙烯酸（polyacrylic acid， PAA）用于提高生物材料的水溶性，增強其生理穩定性。對于 GO 的表面改性， PAA 被認為是比 PEG 更合適的聚合物[53]。PAA 的接枝不僅增加了 GO 在生理溶液中的分散性和溶解性，而且保持了 GO 超高的抗癌藥物負載量。 Lu 等[54]報道了利用 GO-PAA 遞送卡莫司?。╟armustine，BCNU），并評價了其化療效果。負載 BCNU 的 GO-PAA 顯示出良好的溶解性和穩定性，優異的載藥性能，并顯著增強了對 GL261（小鼠神經膠質瘤細胞系，immortalised cell line）的毒性。水楊酸修飾的 GO 也具有良好的生物安全性和穩定性，高的 DOX 負載量，對 Hela 細胞（宮頸癌細胞系）有很好的抑制作用，并能傳遞5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）用于肺癌治療[55]。Zhao 等[56]已報道了使用 CS 修飾的 GO 納米粒子 GON作為 DOX 的載體，并實現了對裝載、運輸和釋放的控制。圖7為 CS 修飾的 GON 用于 DOX 載藥和對酸堿度敏感的藥物釋放示意圖。由于腫瘤細胞所處的酸性微環境中 CS 的溶解，當納米粒子在腫瘤中積累時，載體崩解，釋放更多的藥物分子，導致化療增強。表2為 GO 與不同物質結合后用于藥物輸送數據。

2.4 基因治療

基因治療被廣泛認為是治療疾病的理想策略，包括癌癥，這是與基因損傷相關的最嚴重的疾病之一[64]。成功的基因治療需要強大的載體將基因轉運到細胞中，被認為克服了傳統方法的非特異性傳遞、潛在的細胞毒性和免疫原性[65]。在各種基因傳遞載體中， GO 因其超高的比表面積和吸附能力、良好的生物相容性和生物安全性、易于表面修飾而被認為是優良的載體。

在初期的研究中， Lu 等[66]發現 GO 可以有效地吸附單鏈 DNA，顯示了 GO 作為基因傳遞載體的潛力。從那時起，基于基因工程的基因傳遞系統被廣泛研究。例如，Chen 等[67]報道了一種用于質粒DNA 遞送的 PEI 修飾 GO。該基因能有效地進入 Hela 細胞，并顯示出增強的轉染效率。 PEI 是一種帶正電荷的水溶性聚合物，可被細胞有效吸收并與核酸牢固結合。 PEI 的使用可以提高基因轉染效率，但它也存在固有毒性和穩定性差的缺點。與 GO 結合后， PEI 的毒性降低，轉染效率提高。為了進一步提高基因的傳遞效率，獲得更高的轉染效果，采用無創可控近紅外光進行刺激，精確調節基因的表達和沉默。為此，Feng 等[68]設計了一種 PEG 和 PEI 共同修飾的 GO （GO-PEG-PEI）作為 DNA 的載體。他們證明了 GO-PEG-PEI 可以被細胞有效地吸收，并且通過近紅外光譜的調整提高了基因轉染效率。利用 GO-PEG-PEI作為近紅外敏感基因載體，可控近紅外輻射還可以促進 siRNA 傳遞，調節基因的表達或沉默。在另一項研究中， Kim 等[69]也證明了 PEG 和 PEI 共價修飾的 GO 具有良好的穩定性和高的pDNA遞送能力，并且通過受控的近紅外輻射介導的光熱效應顯示出增強的轉染效率。圖8為 EG-nrGO-PEI（RGPP）和 PEG- nGO/PEI（GPP）納米復合物的合成示意圖。

3.結論

隨著生物醫學材料需求的快速增長，石墨烯及其衍生物在疫苗載體、癌癥治療、藥物輸送和基因治療等領域顯示出光明的前景。由于生理環境的物理化學特性， GO 因其突出的親水性和易修飾的表面特性而優于石墨烯。 GO 大的表面積、疏水的六元芳香環結構和易修飾的氧官能團，使抗癌藥物、基因、蛋白質、成像劑、治療劑和表面修飾基團等可以通過π-π堆積、靜電相互作用或共價鍵有效地與 GO 結合，形成 FGO，在生物醫學領域有廣泛的應用，特別是癌癥的診斷和治療。目前為止，研究人員通過使用合理設計的 FGO，從最初用于藥物/基因的遞送系統、單一診斷或治療方式的載體，到用于指導成像以提高精確腫瘤治療的組裝，形成良好的治療平臺，已經取得了很大的進展。多項研究表明， GO 在納米醫學領域具有廣闊的應用前景，但其在臨床應用中仍存在一些問題和迫切的挑戰，如 GO 在生理條件下的穩定性、GO 與細胞的相互作用、細胞對 GO 的反應、GO 的細胞攝取方式、GO 在不同組織/器官中的生物分布和積累、GO 在體內的轉化和代謝途徑以及 GO 的急性/潛在毒性等等。

總之，在納米材料、納米技術和納米生物醫學快速發展的基礎上， GO 將是生物醫學領域中的一種杰出的物質，在疾病的診斷和治療中發揮關鍵作用。

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