黃芪多糖生物活性檢測中各因子間的相關回歸分析

馬發順，岳超，元雪湞，張大斌，梁秀麗

（1.安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽 455000；2.河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室，安陽 455000；3.河南省獸藥飼料監察所，鄭州 450000）

黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是從黃芪的根系及莖稈中分離提取的具有生物活性的水溶性雜多糖[1]。APS可有效促進雛雞免疫器官發育，提高血液中免疫球蛋白含量和T淋巴細胞數量[2]。APS不僅可增強斷奶羔羊免疫球蛋白水平，還可提高其抗病能力[3]。APS是一種免疫增強劑，在豬的免疫功能中起著重要作用，還可提高仔豬的日增重和料重比[4-5]。APS可以促進禽類法氏囊和脾臟更好地發育，提高免疫功能指數[6]。APS不僅能促進肉雞的生長發育，還能抑制腸道病原菌生長，促進益生菌增殖[7]。目前關于APS生物活性檢測方面的報道較少，僅元雪湞等對APS生物活性檢測方法進行了分析和評價并建立了檢測模型，對APS生物活性檢測中各因子之間的關系也只作了典型相關分析[8-10]，還沒有關于這些因子之間回歸分析的報道。本試驗采用《中華人民共和國獸藥典2015版（二部）》提供的APS生物活性檢測方法，對試驗過程中的各個因子進行簡單相關分析和典型相關分析，在此基礎上進行回歸分析，以了解各因子之間的內在聯系，定量描述部分因子之間的關系，為進一步改進APS生物活性檢測方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

昆明鼠（SPF級，許可證號：SCXK2016-0002）40只，雌雄各20只，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司。使用IVC-Ⅱ型獨立送風隔離籠具飼養，設定溫度20～26℃，濕度60%，供給足量飼料，自由采食和飲水；飼料和飲水均經高溫滅菌，紫外線照射消毒。

1.1.2 儀器和試劑

電子天平（型號ES3200），天津市德安特傳感技術有限公司生產；梅特勒分析天平（型號XS205DU），上海雙旭電子有限公司生產；獨立送風隔離籠具（型號IVC-Ⅱ），蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司生產；一次性使用無菌注射器（規格1 mL），圣光醫用制品有限公司生產。APS注射液[以葡萄糖（C6H12O6）計10mL：0.1g]，由河南省某獸藥廠提供；0.9%氯化鈉注射液（規格250 mL，國藥準字H3702070766），購自山東齊都藥業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

將昆明鼠按照飼養標準適應性喂養2d后，稱取小鼠始重。取體重18～20 g的健康小鼠40只，按性別分為2組，每組20只；再把雌、雄小鼠分別隨機分為2組，每組10只；隨機設為試驗組和對照組。試驗組每只小鼠腹腔注射APS注射液0.5 mL/d，對照組每只小鼠腹腔注射生理鹽水0.5 mL/d，連續注射7 d；于最后一次注射24 h后將小鼠頸椎脫臼處死；稱取每只小鼠的體重、脾臟重、胸腺重，并計算脾指數和胸腺指數等。

1.2.2 因子的測定

把APS生物活性檢測中的因子分為兩類。第一類3個初始因子：處理方式（x1）：注射APS注射液賦值為“1”，注射生理鹽水賦值為“0”；性別（x2）：雄性賦值為“1”，雌性賦值為“0”；始重（x3）：試驗開始時的體重（g）。第二類5個效應因子：脾臟重（x4）：試驗結束時摘取脾臟稱重（mg）；胸腺重（x5）：試驗結束時摘取胸腺稱重（mg）；末重（x6）：試驗結束時的體重（g）；脾指數（x7）：計算方法x4/x6；胸腺指數（x8）：計算方法x5/x6。

1.2.3 統計處理

對原始數據按性別和處理方式進行整理，計算出各因子的平均值、標準差和變異系數，數據以“平均數±標準差”表示。在同性別的試驗組與對照組之間進行各因子的差異性t檢驗，接著進行8個因子間的簡單相關分析，然后對兩類因子進行典型相關分析，在此基礎上進行多元逐步回歸分析，建立回歸方程。使用Excel 2010軟件整理數據并進行差異顯著性檢驗；使用DPS v7.05軟件進行簡單相關分析、典型相關分析和逐步回歸分析。

2 結果與分析

2.1 試驗因子表現

對試驗原始結果按性別和處理分組匯總。各因子的描述統計結果見表1。

表1 APS生物活性檢測中各因子的描述統計

從表1可以看出，試驗組與對照組比較，x3雌性組和雄性組均差異不顯著（P＞0.05）；x4雌性組差異顯著（P＜0.05），雄性組差異極顯著（P＜0.01）；x7雌性組和雄性組均差異極顯著（P＜0.01）；x5、x6、x8雌性組和雄性組均差異不顯著（P＞0.05）。從變異程度看，x4、x5、x8變異程度較大，x3、x6、x7變異程度相對較小。

2.2 各因子間的簡單相關關系

8個因子間簡單相關系數見表2。

表2 8個因子之間的簡單相關系數

從表2可以看出，3個初始因子間的相關關系均不顯著（P＞0.05）；5個效應因子間，x4與x6、x7間均具有極顯著的相關關系（P＜0.01），x5與x8間具有極顯著的相關關系（P＜0.01），其余相關系數不顯著（P＞0.05）；3個初始因子與5個效應因子間，x4與x1、x2間，x6與x2間，x7與x1間均具有極顯著相關關系（P＜0.01）。

2.3 典型相關分析

3個初始因子（x1、x2、x3）與5個效應因子（x4、x5、x6、x7、x8）之間的典型相關分析結果見表3。

表3 典型相關系數及其顯著性

從表3可知，前2個典型相關系數達到了極顯著水平（P＜0.01），第3個不顯著（P＞0.05）?？梢?，初始因子和效應因子間的相關性主要由前2對典型變量所解釋。各因子的變異被2對達到極顯著水平的典型變量所解釋的比例見表4。

表4 各因子的變異能被2對典型變量解釋的比例

從表4可以看出，第1對典型變量U1、V1對初始因子可解釋的比例分別為36.90%、30.82%，對效應因子可解釋的比例分別為21.86%、27.06%，第2對典型變量U2、V2對初始因子可解釋的比例分別為33.20%、21.79%，對效應因子可解釋的比例分別為21.58%、33.70%。

2對典型變量的線性結構式為：U1=-0.2378x1+0.8971x2+0.1826x3，V1=-0.1551x4-0.1341x5+1.1445x6-0.0498x7+0.0956x8；U2=-0.9642x1-0.2034x2-0.0983x3，V2=-1.2943x4+0.2562x5+0.5701x6+0.0154x7-0.0895x8。從線性結構式中各項系數絕對值的大小來看，U1中x2系數最大，其次是x1；V1中x6系數最大，其次是x4；U2中x1系數最大，其次是x2；V2中x4系數最大，其次是x6。說明初始因子與效應因子之間的相關關系主要是由x1、x2和x4、x6之間的密切關系所造成。

2.4 因子間的回歸方程

因為脾指數（x7）是判定APS樣品是否合格的重要指標，所以選擇x7作為因變量。因x7與x1、x4間均有極顯著正相關關系（P＜0.01），與x2、x6間也有正相關關系（P＞0.05）；x7的變異主要被第2對典型變量（U2、V2）所解釋，此對典型變量主要反映x1、x2與x4、x6間的關系，而x1與x4間，x2與x4、x6間，以及x4與x6間均具有極顯著正相關關系（P＜0.01），所以，可把x1、x2、x4、x6納入自變量范疇，按試驗組和對照組分別建立回歸方程。

試驗組因子間的回歸方程為x7=6.176-0.068 x2+0.037 x4-0.230 x6（R2為0.992 6），對照組因子間的回歸方程為x7=3.902-0.052 x2+0.034 x4-0.134 x6（R2為0.992 1）。兩個回歸方程中各自變量對因變量的偏相關系數和通徑系數見表5。

表5 回歸方程中的偏相關系數和通徑系數

從表5可知，兩個回歸方程中x4、x6的偏相關系數均達到極顯著水平（P＜0.01），并且x4與x7之間呈正相關關系，x6與x7之間呈負相關關系。通徑分析表明x4對x7的決定作用最強。

3 討論

從APS生物活性檢測中各因子的表現來看，小鼠的始重符合試驗基本要求，并且試驗組與對照組隨機安排效果良好。脾臟重（x4）試驗組顯著（雌性，P＜0.05）或極顯著（雄性，P＜0.01）高于對照組，脾指數（x7）試驗組極顯著高于對照組（雌性和雄性，P＜0.01），說明APS對小鼠脾臟重（x4）和脾指數（x7）均有顯著作用（P＜0.05），而對胸腺重（x5）及胸腺指數（x8）無顯著作用（P＞0.05），此表現與元雪湞等[10]的研究結果相似。脾臟重（x4）、胸腺重（x5）和胸腺指數（x8）均存在較大的個體差異，可能是不同個體對APS的感應度有所不同?，F行APS生物活性檢測方法中僅規定試驗組平均脾指數與對照組平均脾指數之差大于等于2判定樣品合格，否則判定為不合格；既沒有關于試驗動物性別因素的限制，又沒有考慮試驗誤差的影響。若能使用統計學方法進行差異顯著性檢驗并運用到試驗結果的判斷中，將會提高試驗結果的科學性與判斷的可靠性。

從8個因子間的簡單相關系數來看，3個初始因子間的相關系數均不顯著（P＞0.05），說明試驗設計時嚴格遵守了隨機原則，試驗動物的初始條件控制良好。x4與x6、x7間極顯著的相關關系，與元雪湞等[10]的研究結果一致，充分說明以脾指數作為APS生物活性檢測指標的合理性。x4與x1、x2間的極顯著相關關系說明試驗處理和性別對脾臟重均有極顯著影響，這不僅進一步證實了APS對脾臟生長的促進作用，而且還揭示出在試驗中應考慮小鼠性別因素的必要性[8，10]。x1與x7之間極顯著的相關關系（P＜0.01）對現行APS生物活性檢測方法具有有效支持，解決了元雪湞等[10]在討論中提出的問題。盡管x5與x8間具有極顯著正相關關系（P＜0.01），但x4和x5間、x7和x8間相關系數均不顯著（P＞0.05），所以，x8在APS生物活性檢測時的作用不大。

從典型相關分析得知，初始因子與效應因子間的相關關系主要是由于x1、x2與x4、x6間的密切聯系所造成，這不僅與簡單相關分析結果相吻合，也與元雪湞等[10]研究結果一致。這一方面支持了現行APS生物活性檢測方法的基本可行性，另一方面也揭示出現行方法中僅規定以試驗組和對照組脾指數的差作為判斷標準而忽視試驗動物性別因素影響的缺陷。

本研究建立回歸方程時充分考慮了性別因素，試驗組和對照組的回歸方程R2均大于0.99，擬合效果很好；所建立的回歸方程比元雪湞等[9]建立的檢測模型在自變量篩選方面更精準可靠，使用效果會更好。此回歸方程可用于APS生物活性檢測時指標的估算和驗證，也可作為試驗結果判定時的參考。建議有關部門在今后修訂APS生物活性檢測方法時把小鼠性別作為控制因素做出相應規定。

4 小結

APS生物活性檢測中，試驗組與對照組間脾臟重（x4）差異顯著（雌性，P＜0.05）或極顯著（雄性，P＜0.01），脾指數（x7）差異極顯著（雌性和雄性，P＜0.01）；3個初始因子間簡單相關系數均不顯著（P＞0.05），5個效應因子間有3個相關系數達到極顯著水平（P＜0.01），初始因子與效應因子間的相關系數有4個達到極顯著水平（P＜0.01），有1個達到顯著水平（P＜0.05）；初始因子與效應因子間的典型相關系數為0.913 9（P＜0.01）、0.810 2（P＜0.01），兩類因子間的相關性主要由x1、x2與x4、x6間的相關關系所造成；試驗組回歸方程為x7=6.176-0.068 x2+0.037 x4-0.230 x6（R2為0.992 6），對照組回歸方程為x7=3.902-0.052 x2+0.034 x4-0.134 x6（R2為0.992 1）。說明現行的APS生物活性檢測方法基本可行，試驗時應把試驗動物的性別作為控制因素納入試驗設計中，并運用統計學方法判斷試驗組與對照組的差異，以提高試驗的準確性和可靠性。