哈茨木霉和葡萄座腔菌對亞甲基藍染料的脫色試驗初報

魏鴻錦 吳林應 尚曉靜 侯瑞

摘 要 以女貞樹樹干上分離、純化得到的哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株（B7）和從楊樹樹干上分離、純化得到的葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea菌株（N38）為對象。研究了2種菌株產生的3種木質素降解酶：漆酶（laccase，Lac）、木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）和錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）的活性。結果顯示，B7在培養第6 d時Lac活性最大，達到13.3 U·L-1，同時MnP活性也達到11.29 U·L-1，LiP在培養第8 d活性達到峰值為5.24 U·L-1;N38在培養第8 d時MnP活性最大，達到16.53 U·L-1，同時Lac活性也達到9.27 U·L-1，LiP在培養第6 d活性達到峰值為5.24 U·L-1。通過染料固體培養基進行預脫色篩選，發現2個菌株對亞甲基藍脫色效果最佳。菌株B7對亞甲基藍的脫色優化結果為20.0 g·L-1葡萄糖、1.0 g·L-1硝酸鈉、1.0 g·L-1硫酸鋅、pH3.0、裝液量10.0 mL;菌株N38對亞甲基藍的脫色優化結果為20.0 g·L-1葡萄糖、1.0 g·L-1氯化銨、1.0 g·L-1硫酸鎂、pH7、裝液量30.0 mL。

關鍵詞 哈茨木霉;葡萄座腔菌;亞甲基藍;脫色優化;木質素降解酶

中圖分類號：Q948.12+2.3 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.07.019

亞甲基藍（Methylene blue）是一種噻嗪類染料，已被廣泛應用于紡織品和紙張的染色。其污水已被證實可引發多種疾病，如休克、黃疸、組織壞死、嘔吐、眼灼傷、惡心、頭暈等[1]。因此，如何高效處理染料廢水，已成為全世界關注的主要問題之一[2]。目前處理染料廢水的方法主要分為物理法、化學法和生物法3類[3]。其中生物法運行成本低，綠色環保，具有較大的研究價值?，F有研究顯示，具有脫色染料功能的生物有細菌、真菌和藻類等[4]。楊春霖研究發現黃絲衣霉菌（Byssochlamys Fulva）對亞甲基藍染料廢水具有良好的脫色效果[5];張桐等人研究的一栓孔菌ZT-197（Trametes versicolor）對亞甲基藍染液的脫色率高達98%[6]。

木質素降解酶作用是生物脫色的主要機制，木質素降解酶包括：漆酶（laccase，Lac）、木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）和錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）[7]。漆酶具有較強的氧化還原能力，可對多種染料進行脫色[8]，木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶是兩種常見的過氧化物酶，能夠有效分解木質素和多種有機物[9]。木霉菌是目前產纖維素酶量最高的菌株，能夠有效降解纖維素[10-11]。有效利用纖維素酶，將纖維素轉化成人類可利用的能源十分重要[12]。

本試驗從女貞樹樹干上分離得到菌株B7，從楊樹樹干上分離得到菌株N38，并對其進行固體脫色篩選。菌株B7、N38對孔雀石綠、亞甲基藍的脫色效果均為明顯。在進行固體培養基脫色篩選時，兩株菌株在添加孔雀石綠染料的培養基里生長速度明顯慢于其他染料培養基，因此選擇對亞甲基藍進行脫色優化試驗。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

1.1.1 ?菌株

N38、B7菌株均來源于貴州大學校園內楊樹、女貞樹枝干，通過真菌分離法獲得，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.1.2 ?培養基

PD培養基：馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL;PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、一次蒸餾水1 000 mL;PDB培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL;碳源篩選培養基：添加可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖作為碳源，分別添加20 g·L-1至PD培養基中，pH未調節;氮源篩選培養基：添加硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、蛋白胨、尿素作為氮源，分別添加1.0 g·L-1至PDB培養基中，pH未調節;金屬源篩選培養基：添加硫酸鋅、硫酸鉀、硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸錳作為金屬源，分別添加1.0 g·L-1至PDB培養基中，pH未調節。

1.1.3 ?染料與試劑

活性染料：活性黑、活性紅;堿性染料：孔雀石綠、亞甲基藍、剛果紅、結晶紫;酸性染料：鉻黑T。次氯酸鈉溶液、無水乙醇、75%酒精、蒸餾水。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌株形態學鑒定

在超凈工作臺中，用9 mm的無菌打孔器截取已活化的菌株B7、N38的菌柄至新的PDA固體培養基上，在28 ℃恒溫箱中避光培養，記錄菌落的生長情況（形態、直徑）[13]。培養6 d后，用光學顯微鏡進行形態學觀察、鑒定，參照《真菌鑒定手冊》[14]。

1.2.2 ?菌株分子生物學鑒定

提取菌株的DNA時使用Plant Direct PCR Kit （Finnzymes，Finland）真菌DNA提取試劑盒，通過PCR擴增得到引物ITS1和ITS4[15]。并送至重慶擎科興業生物技術有限公司進行測序。同時從NCBI獲得相關可靠的結果進行比對，利用MEGA7.0對上述分子序列進行多序列比對，采用MEGA7.0中鄰接法（Neighbor joining，NJ）構建系統進化樹，并結合菌株的形態特征證實該菌株的物種種類[16]。

1.2.3 ?菌株B7、N38漆酶、木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶活性測定

將70 mL PDB分別裝入250 mL的三角瓶中，高溫下用低壓的熱蒸汽在每個滅菌鍋121 ℃下，滅菌30 min后在每個新的三角瓶內分別重新接入4片菌柄（d=9 mm）后并置于每一個新的三角瓶中，置于28 ℃下的恒溫中心后進行一次避光滅菌培養，將第2 d、4 d、6 d、8 d和10 d的發酵液吸取1.0 mL，再將其進行5 min轉速為7 000 r·min-1的離心，然后用紫外分光光度計測定其酶活性。

Lac活性測定[17-18]：將PH值為5的1.95 mL羥基檸檬酸-羥基磷酸氫二鈉緩沖液、1.0 mmol·L-1 2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]和0.05 mL的上清發酵液置于30℃的電熱水浴中3 min后，測定它在3 min內420 nm處的強度吸光劑在照射下的強度及其值的變化改變，每個測定過程及其中的吸光處理均需要重復3次。一個氧化酶的生物活力學計量單位（U）被定義為每分鐘可以通過酶催化底物氧化1.0 μmol ABTS底物時所需酶的總數量（ABTS：ε420=3.6×104 L·mol-1·cm-1）。

MnP活性測定光劑[18-19]：0.84 mL上清濃度為0.05 mol·L-1的羥基丙二酸鈉鹽水溶液、0.05 mL上清濃度為0.01 mol·L-1的硫酸錳溶液、0.05 mL上清濃度為0.01 mol·L-1的2，6-二甲氧基乙酰苯酚（2，6-dimethoxyphenol，2，6-dmp）、0.05 mL上清濃度發酵液和0.01 mL上清濃度按照比例測量為0.01 mol·L-1的雙氧水裝入一個吸光比色皿中，測定1 min內468 nm內皿處的各種吸光劑在照射下的強度和數值的活性變化，每個比色皿中的強度處理均勻后可以同時重復3次。一個氧化酶的整體活力學計量單位（U）被定義為每分鐘可以通過催化底物氧化1.0 μmol 2，6-dmp底物的整體所需氧化酶量（2，6-DMP：ε468=4.68×104 L·mol-1·cm-1）。

LiP活性測定[6，18]：將混合后的溶液1.7 mL 濃度相差為0.25mol·L-1的四水合酒石酸鉀鈉溶液和0.05 mL濃度相差為0.1 mol·L-1的藜蘆醇（veratryl alcohol，VA溶液置于30 ℃的水浴中進行預熱后，依次在鍋中加入0.05 mL上清發酵液和濃度為0.1mol·L-1的0.05 mL雙氧水，測定其在3 min內310 nm處吸光光度值的變化，每個處理均重復3次。一個酶的活力學單位（U）被定義為每分鐘可以通過催化氧化1.0 μmol VA物所需酶量（VA：ε310=9.3×103 L·mol-1·cm-1）。

1.2.4 ?固體培養基脫色篩選

添加50.0 mg·L-1活性紅、活性黑、孔雀石綠、剛果紅、亞甲基藍、鉻黑T、結晶紫至PDA培養基中，121 ℃下高溫高壓蒸汽滅菌30 min。在超凈工作臺中將加入不同染料的PDA（20 mL）倒入直徑90 mm的培養皿中，用9 mm的無菌打孔器截取已活化菌株B7、N38的菌柄至不同染料的PDA固體培養基上，上述操作重復3次。再做一組不接菌的空白對照，每個染料作一組空白對照（7組）。在28 ℃恒溫培養箱避光培養10 d，根據接菌組的脫色圈大小及顏色變化與對照組相比較，計算菌株B7、N38對不同染料的脫色率，RD為染料脫色率，A1為脫色圈直徑，A0為對照組染料區域直徑，計算公式為：RD（%）=A1/A0×100[20]。

1.2.5 ?碳源種類對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

添加麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖作為碳源，分別添加20 g·L-1的碳源至染料終質量濃度50.0 mg·L-1的PD培養基作為碳源篩選培養基，在100 mL三角瓶中裝入50 mL碳源篩選培養基。以同樣濃度的PD染料培養基作為對照組。

1.2.6 ?氮源種類對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

添加硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、蛋白胨、尿素作為氮源，分別添加1.0 g·L-1的氮源至染料終質量濃度50.0 mg·L-1的PDB培養基作為氮源篩選培養基，將50 mL氮源篩選培養基裝入100 mL三角瓶中。以同樣濃度的PDB染料培養基作為對照組。

1.2.7 ?金屬源種類對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

添加硫酸鋅、硫酸鉀、硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸錳作為金屬源，分別添加1.0 g·L-1的金屬源至染料終質量濃度50.0 mg·L-1的PDB培養基作為金屬源篩選培養基，將50 mL金屬源篩選培養基裝入100 mL三角瓶中。將同樣濃度的PDB染料培養基作為對照組。

1.2.8 ?裝液量對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

將濃度為50.0 mg·L-1 PDB染料培養基分裝90.0 mL、70 mL、50 mL、30 mL、10 mL于100 mL三角瓶瓶中。

1.2.9 ?pH值對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

將PDB培養基染料濃度調至50.0 mg·L-1，分別倒入100 mL三角瓶中，高溫高壓蒸汽滅菌30 min。在超凈工作臺中用已滅菌的過濾器過濾NaOH、HCL，用NaOH、HCL將培養基調整為pH3、pH5、pH7、pH9、pH11。

1.2.10 ?染料吸光值的測定、脫色率的計算及數據分析

分別取4片菌柄（d=6 mm）于上述三角瓶中，重復3次。28 ℃恒溫培養箱中避光培養10 d，每2 d在超凈工作臺中取1.8 mL染料發酵液，經1 2000 r·min-1離心2 min，取1.0 mL上清液于紫外分光光度計波長為662 nm測量其OD值。液體染料脫色公式為RD=（C0-C1）/C0×100%[17]。C0為未接菌PDB染料培養基的光度值，C1為已接菌的染料發酵液，RD為液體染料脫色率。

2 ?結果與分析

2.1 ?菌株N38和B7形態學觀察、DNA的提取及ITS系統發育樹的構建

菌株N38和B7于恒溫培養箱中，4 d即可長滿培養皿（見圖1）。提取菌株B7、N38的DNA后，進行引物擴增得到PCR產物送其測序，構建系統發育樹（見圖2）。獲得測序結果后登錄網站GenBank，得到菌株N38的登錄號MZ461912.1，菌株B7的登錄號OK021633.1。

2.2 ?漆酶、木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶的活性變化

培養第2 d開始監測菌株N38產酶活性，其酶活性隨時間的增長呈現先增長再降低的趨勢。Lac活性在第8 d時達到峰值，其酶活力為9.27 U·L-1;MnP活性也在第8 d達到最大值，為16.53U·L-1;而LiP活性在第6 d達到最大值，為7.66U·L-1（見圖3a）。

培養第2 d開始監測菌株B7產酶活性，其酶活性隨時間的增長呈現先增長再降低的趨勢。Lac活性與MnP活性均在第6 d達到峰值，其酶活力分別為13.31 U·L-1、11.29 U·L-1;LiP活性在第8 d達到峰值，為5.24 U·L-1（見圖3b）。

2.3 ?菌株B7、N38對7種分屬不同類別染料脫色篩選

將菌株接種在添加孔雀石綠、剛果紅、鉻黑T、活性黑、活性紅、結晶紫、亞甲基藍的固體染料培養基上。觀察后發現，菌株B7對孔雀石綠和亞甲基藍脫色都很明顯，脫色率分別為92.78%、92.22%，對剩余染料的脫色率由高到低依次為：結晶紫（79.22%）、鉻黑T（64.44%）、活性紅（50.00%）、剛果紅（44.44%）、活性黑（41.11%）（見圖4a）;菌株N38對亞甲基藍的脫色效果最佳，脫色率為92.78%，對活性紅、結晶紫、剛果紅三種染料脫色率相同，均為88.89%，對剩余染料的脫色率由高到低依次為：孔雀石綠（82.22%）、活性黑（5.00%）、鉻黑T（3.33%）（見圖4b）。

2.4 ?菌株N38、B7脫色亞甲基藍受碳源種類的影響

脫色第10 d，添加葡萄糖作為碳源時的脫色效果最好，脫色率達84.92%;其次果糖與麥芽糖效果較為接近，脫色率分別為73.38%、70.43%;蔗糖和淀粉脫色率略低，依次是68.64%、48.13%。依結果可見淀粉作為碳源對N38脫色效果并不佳，與其他碳源差距明顯（見圖5a）。

脫色第10 d，添加葡萄糖作為碳源時的脫色效果最好，脫色率達83.01%;果糖、蔗糖與淀粉效果較為接近，脫色率分別為77.99%、70.74%、69.57%;麥芽糖脫色率最低，僅54.66%。結果顯示麥芽糖作為碳源對N38脫色效果不佳，與其他碳源差距明顯（見圖5b）。

2.5 ?菌株N38、B7脫色亞甲基藍受氮源種類的影響

五種氮源中，以氯化銨為氮源的脫色效果最佳，脫色率為93.21%;添加蛋白胨與尿素脫色效果次之，脫色率依次為74.28%、76.12%;添加硫酸銨的脫色率為65.09%;而硝酸鈉添加后脫色效果最差，脫色率為54.34%。綜上所述，添加氯化銨作為氮源對菌株N38脫色亞甲基藍效果明顯（見圖6a）。

五種氮源中，以硝酸鈉為氮源的脫色效果明顯，脫色率為80.31%;添加蛋白胨，脫色效果次之，脫色率為75.44%;添加尿素、氯化銨和硫酸銨的脫色效果明顯降低，脫色率依次為：27.17%、25.38%、15.29%。綜上所述，添加硝酸鈉作為氮源對菌株B7脫色亞甲基藍效果明顯（見圖6b）。

2.6 ?菌株N38、B7脫色亞甲基藍受金屬離子種類的影響

鎂離子的添加對菌株N38脫色亞甲基藍效果最佳，脫色率為88.80%;其余四種金屬離子脫色效果都較為接近，添加鋅離子、鐵離子、錳離子、鉀離子為金屬源對菌株N38脫色亞甲基藍效果十分接近，脫色率分別為78.47%、76.60%、76.21%、71.42%（見圖7a）。

鋅離子的添加對菌株B7脫色亞甲基藍效果最佳，脫色率為91.18%;鉀離子、鎂離子脫色效果都較為接近，其脫色率依次是：85.73%、82.78%;添加錳、鐵離子作為金屬源的脫色率較低，依次為69.93%、59.62%（見圖7b）。

2.7 ?菌株N38、B7脫色亞甲基藍受裝液量的影響

裝液量為30 mL時，脫色效果最佳，脫色率為99.11%;裝液量為10 mL時脫色效果也同樣很好，脫色率為95.75%;其余3種裝液量脫色效果隨著裝液量增加，脫色率下降，裝液量為50 mL、70 mL、90 mL時，脫色率依次為85.01%、65.41%、50.56%。當裝液量達到90 mL時脫色率明顯低于其余4種裝液量（見圖8a）。

裝液量為10 mL時，脫色效果最佳，脫色率為90.56%;裝液量為30 mL時脫色效果略低于10 mL時，脫色率為86.86%;隨著裝液量增加脫色率不斷下降，裝液量為50 mL、70 mL和90 mL時，脫色率依次為68.59%、67.07%、31.95%。當裝液量達到90 mL時，脫色率明顯低于其余4種裝液量（見圖8b）。

2.8 ?菌株N38、B7脫色亞甲基藍受 pH值的影響

培養基pH值不同，菌株的脫色能力也差異顯著。當pH值由3.0增加至5.0時，脫色效果明顯增加，脫色率由15.88%增加為73.05%;當pH值為7時脫色效果最佳，脫色率為77.99%;隨著pH值繼續增大時，脫色率下降趨勢明顯，pH值為9時脫色率為14.19%;pH值為11時脫色率為10.22%。綜上所述，菌株N38在極酸極堿的條件下脫色能力差（見圖9a）。

受pH值的影響，菌株的脫色能力也差異顯著。當pH值為3.0時，脫色效果最佳，脫色率為97.30%;而pH值為5時脫色率為73.99%;當pH值為7時脫色率也，脫色率為93.93%;但隨著pH值繼續增大時，脫色率下降趨勢明顯，pH值為9時脫色率為13.54%;pH值為11時脫色率為13.03%。綜上所述，菌株N38在極堿的條件下脫色能力差，培養基pH值位于3時，菌株B7脫色亞甲基藍能力最強（見圖9b）。

3 ?討論

本試驗從貴州大學校園內的女貞樹枝干上分離、純化得到菌株B7，從楊樹樹干上分離、純化得到菌株N38。根據菌株的形態學特征、ITS序列相似性比對以及進化樹分析，鑒定B7為哈茨木霉菌Trichoderma harzianum;N38為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。哈茨木霉為半知菌亞門絲孢綱叢梗孢目科木霉屬，廣泛分布于森林生態系統中，其適應性極強，對多種病原真菌和細菌都有拮抗作用[21]，是一類重要的生防真菌，廣泛存在于空氣、土壤以及植物體表面等生境中，具有強適應力、存在范圍廣和廣譜、高效等優點[22]。葡萄座腔菌是一種重要的植物內生菌[23]。通過木質素過氧化物酶的測定，可知兩菌株具有一定的脫色能力。B7、N38的漆酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶的酶活峰值出現在6～8 d，與喬喬研究的木質素過氧化物酶的酶活峰值為第6～8 d結果相同[24]。為了研究兩菌株在不同條件下對亞甲基藍脫色能力，本試驗測定了不同碳源、氮源、金屬離子、pH值和裝液量條件下對菌株脫色亞甲基藍的影響。結果顯示添加葡萄糖作為碳源，菌株N38、B7脫色亞甲基藍效果最佳，推測菌株N38、B7在添加葡萄糖時，可促進其對亞甲基藍脫色。徐紅云在一色齒毛菌的脫色試驗中，添加葡萄糖作碳源的脫色效果也最佳[25];添加氯化銨作為氮源，菌株N38脫色效果最佳。菌株B7在添加硝酸鈉作為氮源時，脫色效果最佳。而一色齒毛菌脫色剛果紅時，添加硝酸銨作氮源效果最佳[26]，考慮是菌株不同，對氮源的需求也不同;添加硫酸鎂作為金屬源，菌株N38脫色亞甲基藍效果最佳。菌株B7在加入鋅離子作為金屬源時，脫色率高達91.18%。由此可見，金屬離子是微生物生長中不可或缺的一部分，少量的金屬離子可以促進菌株的生長[27];培養基pH值為7時，菌株N38脫色亞甲基藍效果最佳。菌株B7在pH值為5的條件下，脫色效果明顯。與周菲結論相對應，其研究的哈茨木霉脫色活性艷藍KN-R的最適培養條件為pH值為5.5[28]，推測pH值為5左右時，最適合哈茨木霉生長;當裝液量為10 mL時，菌株N38、B7脫色亞甲基藍脫色率均達到90%以上。隨著裝液量的升高，脫色率逐漸降低，印證了姚英等的結論：當裝液量為10 mL時，脫色效果最佳，但是在染液量超過菌株自身承載范圍時，脫色效果大大降低[26]。推測菌株對染料脫色有一定的能力范圍，因此當接菌量一定時，裝液量越少脫色效果越明顯。葡萄座腔菌在脫色優化方面暫無報道，在生態發展的時代，微生物降解染料廢液備受關注。綜合本研究結果，菌株N38、B7可脫色染料亞甲基藍，這對染料廢水的治理具有一定借鑒和指導價值。

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（責任編輯：敬廷桃）

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收稿日期：2021-12-16

基金項目：黔科合平臺人才（〔2018〕5781）;貴州大學州SRT計劃項目（〔2021〕213）。

作者簡介：魏鴻錦（2000—），男，貴州息烽人，在讀本科生，研究方向為林木病理。E-mail：903369337@qq.com。

*為通信作者，E-mail：jiayouhourui123@163.com。