增強MR組學聯合臨床因素預測肝細胞癌根治性切除術后早期復發的價值研究

楊浩然，張濬韜，馬密密，鄒林軒，曹新山*

作者單位：1.濱州醫學院附屬醫院放射科，濱州 256603；2.通用電氣醫療精準醫學研究院，上海 210000

原發性肝癌是我國目前第4位常見惡性腫瘤及第2 位常見腫瘤致死病因[1]，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發性肝癌中最常見的類型，占85%～90%。HCC根治性切除術是肝臟儲備功能較好的HCC 患者獲得長期生存的主要治療方式，但潛在術后復發風險較高，其中早期復發即根治性切除術后兩年內復發占總體復發的70%以上[2]，這與HCC肝內轉移、多灶性發生、微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)等生物學行為密切相關[3-4]。并且早期復發患者較遠期復發患者預后更差[5]，因此及時識別HCC 切除后早期復發相關的敏感生物學標志物至關重要，這將有助于HCC患者的分類和及時干預，提高生存率。目前，已有多種實驗室指標及影像學征象將HCC預后預測與治療選擇相結合[6-7]，然而，這些預測因子大多不針對預后效果，其預測HCC 術后復發方面的價值有限。

影像組學運用醫學圖像推斷分子腫瘤數據，再通過計算機算法從大規模的數據集中進行學習，是傳統影像學與分子生物學、信息科學等多學科的結合。影像組學研究已在HCC 臨床診斷與預后預測方面展現出明顯優勢[8-9]，但評估HCC 術后早期復發的研究較少。本研究通過探究增強MR 影像組學模型聯合臨床因素預測HCC 術后早期復發，旨在為優化早期HCC 手術預后評估方案提供新的思路與方法。

1 資料和方法

1.1 研究對象

回顧性分析2015 年1 月至2020 年12 月于濱州醫學院附屬醫院放射科行肝臟MRI 檢查的患者病例資料。納入標準：(1)經HCC 根治性切除術后，病理組織學確診為HCC 的患者；(2)術前4 周內行MRI 檢查的患者；(3)單發腫瘤的HCC 患者。排除標準：(1)既往有HCC 治療史或合并其他惡性腫瘤的患者；(2)聯合接受其他抗腫瘤治療(如經動脈化療栓塞、靶向治療、放療等)或姑息治療；(3)自術后第一天起隨訪時間不足12 個月。共計116 例病例被納入研究。根據隨訪結果是否復發將病灶分為早期復發和未復發兩類。通過Python 中sklearn 庫隨機數發生器將整個隊列按7∶3 的比例隨機分為訓練集和驗證集，訓練集82 例，驗證集34 例。所有圖像信息均在濱州醫學院附屬醫院PACS 系統進行采集，按照納入和排除標準收集患者術前以下四個磁共振序列圖像：T2 加權成像(T2 weighted imaging，T2WI)、擴散加權成像(diffusion weighted imaging，DWI)、表觀擴散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)、動態對比增強MRI (dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI)，以DICOM格式導出。

1.2 臨床數據及隨訪方法

常規的術前臨床數據和實驗室檢查從醫院的電子病歷系統中收集。臨床數據包括年齡、性別、是否有肝炎病史、肝硬化狀態、Child-Pugh 分級以及腫瘤TNM 分期(美國癌癥聯合委員會第8 版癌癥分期)。術前1 周內獲得的實驗室指標，包括血清甲胎蛋白(AFP)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和白蛋白等臨床資料。以實驗室檢查、腹部影像學[超聲、增強計算機體層攝影(computed tomography，CT)或增強MRI]以及病理結果為隨訪診斷標準。若實驗室檢查或超聲檢查懷疑腫瘤復發可能，則進行增強CT 或MRI 檢查進一步明確，否則每6 個月常規進行1 次增強CT 或MRI 檢查。隨訪截至2020 年12 月31 日的病例。終點為復發(剔除不能確定死亡原因病例)，其定義為具有典型HCC影像學特征的新的肝內復發和/或肝外復發，或術后12個月內病理學證實的復發。

1.3 MRI檢查參數

MRI掃描使用GE DISCOVERY 750W 3.0 T磁共振掃描儀，獲取所有患者的軸位T2WI、DWI及DCE-MRI序列圖像，掃描參數：T1WI：TR 4.5 ms，TE 1.7 ms，FOV 380 mm×380 mm，層厚5 mm，矩陣256×192；T2WI：TR 6667 ms，TE 90.5 ms，FOV 380 mm×320 mm，矩陣256×256，層厚6 mm；DWI：TR 8000 ms，TE 69.8 ms，FOV 400 mm×320 mm，矩陣380×380，層厚6 mm，b值選取0、800 mm2/s；DCE-MRI：TR 4.5 ms，TE 1.7 ms，FOV 380 mm×380 mm，層厚5 mm 矩陣256×192。DCE-MRI掃描時使用自動注射器在預掃描后以2 mL/s的流率注射對比劑釓特酸葡胺，對比劑使用劑量0.2 mL/kg，等量生理鹽水沖洗。注射對比劑后分別在0 s (早期前期)、11 s (動脈早期)、37 s (動脈晚期)、136 s (靜脈期)進行掃描，獲得增強掃描的4 期圖像。

1.4 圖像分割及影像組學特征提取

圖像分割軟件為3D Slicer (Version 4.10.2)[10]。圖像分割由具有5 年腹部MRI 診斷經驗的放射科醫師1 運用3D Slicer 中的“Segment Editor”模塊在DCE-MRI 圖像逐層手動勾畫病灶ROI (圖1)，HCC 大多為肝動脈供血的富血供腫瘤，增強掃描動脈期圖像上，肝動脈強化，而肝靜脈無強化。動脈晚期與動脈早期相比，HCC 在這一階段表現出更高強化。此外，少部分肝癌僅在動脈晚期才顯示高強化[11]。因此選擇DCE-MRI 增強后第三期(37 s，動脈晚期)作為影像組學分析的期相。勾畫病變時同時參考T2WI、ADC、DWI 序列圖像以提高準確性。由1 名具有20 年腹部磁共振診斷經驗的醫師2 審核醫師1 的圖像分割工作，如醫師2 對醫師1 分割后的感興趣區(region of interest，ROI)有質疑，則醫師2 與醫師1 協商達成一致結果或由醫師2 對醫師1 的分割結果做出相應修改。通過Python 中的Pyradiomics[12]提取勾畫得到的ROI 中的影像組學特征。

圖1 男，64歲，肝細胞癌。1A：軸位動脈晚期病灶；1B：勾畫病灶邊界；1C：填充病灶；1D：對整個病灶進行逐層分割，綠色區域表示用于提取影像組學特征的ROI的輪廓；1E：感興趣區的三維(3D)體積重建。Fig. 1 A 64?year?old male with histologically confirmed HCC. 1A: The late arterial stage on axial direction; 1B：Draw the boundary of the lesion;1C: Fill in the lesion;1D: layers segmentation of the whole lesion illustrated, the green area represent the delineations of the ROIs used to extract the radiomics features; 1E:Three?dimensional(3D)volumetric reconstruction of the ROI.

1.5 影像組學評分模型的構建與驗證

本研究中使用了兩種特征選擇方法，最大相關-最小冗余算法(maximum correlation minimum redundancy，mRMR)和最小絕對值收縮和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)來選擇特征。首先，對冗余和不相關的特征使用mRMR 縮小范圍，保留的特征再通過LASSO進行篩選，LASSO回歸結果中相應系數不為零的特征被保留，進行10 折交叉驗證以選擇最優的λ值，并同時得到相應影像組學特征的系數，通過將所選的多個特征乘以各自的系數進行線性組合，計算出每例患者的影像組學評分(rad-score)，采用Wilcoxon 秩和檢驗分別比較訓練集、測試集中影像組學評分的差異是否有統計學意義。最后通過影像組學模型計算出每例患者患HCC的概率，繪制ROC曲線評估預測模型在訓練集和測試集數據中的診斷效能。

1.6 臨床-病理因素聯合影像組學列線圖模型的構建及驗證

收集到的臨床-病理因素：年齡、性別、肝功能分級、是否合并肝炎、肝硬化狀態、術前甲胎蛋白水平、臨床TNM 分期、MVI 分級、AFP、ALT、AST、ALP、白蛋白、間接膽紅素和直接膽紅素。定量數據以平均值±標準差表示，分類數據以百分比表示。采用單因素分析比較未復發與復發組間臨床因素的差異，輸入單因素分析中的顯著性變量，采用多因素Logistic 回歸建立臨床-病理因素模型。結合影像組學評分和臨床因素，采用多變量Logistic 回歸方法建立聯合模型，以聯合模型的預測評分繪制了列線圖。利用ROC曲線評估列線圖預測精度。采用Hosmer-Lemeshow檢驗，并以此繪制校準曲線(calibration curve)用于評估模型預測概率和實際概率之間的擬合度。將僅考慮臨床因素構建的模型與列線圖模型進行比較，Delong 檢驗用于比較列線圖和臨床模型的AUC 差異是否具有統計學意義，最后通過決策曲線來評價模型的臨床凈收益率。分別運用影像組學評分，臨床模型，聯合列線圖模型計算出每例患者患HCC 的概率，通過ROC 曲線評價各個模型的診斷效能。

1.7 統計分析

采用R統計軟件(Version 4.1.0)進行統計分析。計量資料以均值±標準差表示。采用Wilconxon秩和檢驗比較訓練集、測試集中影像組學評分的差異是否具有統計學意義。以受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評價各模型預測HCC根治性切除術后早期復發效能，計算相應的曲線下面積(area under the curve，AUC)，并采用Delong檢驗比較各模型AUC 的差異，P＜0.05 為差異有統計學意義。使用Hosmer-Lemeshow檢驗，并以此繪制校準曲線用于評估聯合模型預測概率和實際概率之間的擬合度。通過決策曲線分析(decision curve analysis，DCA)來評價聯合模型的臨床凈收益率。

2 結果

2.1 患者資料

在82 例訓練集病例中，40 例術后未復發，42 例術后早期復發；34 例測試集病例中，17 例術后未復發，17 例術后早期復發?；颊咭话阗Y料的分類信息見表1，從表1 的數據可以得出訓練集中復發與未復發病例的年TNM 分期，甲胎蛋白水平，γ-谷氨酰氨基轉移酶，Child-Pugh 分級組間差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 患者一般資料Tab.1 General information of patients

2.2 特征選擇、影像組學模型的驗證

從每個病例的ROI區域圖像中提取了805個特征，經過mRMR 篩選保留30 個特征，再通過LASSO 回歸及10折交叉驗證得到最優的λ值(圖2A、2B)，對應的子集中確定9 個影像組學特征，9 個特征名稱分別為wavelet_LLH_glrlm_GrayLevelNonUniformityNormali zed、log_sigma_4_0_mm_3D_gldm_DependenceVariance、wavelet_HLL_glszm_LowGrayLevelZoneEmphasis、wave let_HHH_firstorder_Uniformity、wavelet_HHL_glcm_SumSquares、 original_glcm_SumEntropy、 wavelet_HLH_glszm_LowGrayLevelZoneEmphasis、wavelet_HHH_firstorder_Median、original_firstorder_Kurtosis(圖2C)，經過Wilcoxon秩和檢驗，未復發和早期復發的影像組學評分差異具有統計學意義(圖2D)。影像組學模型的AUC為0.79 (95%CI：0.69～0.88) (圖3)。

圖2 影像組學模型的構建。使用最小絕對值收縮和選擇算子(LASSO)進行影像組學特征篩選。2A：調整參數λ使擬合損失值二項偏差最小，以篩選最優影像組學特征；2B：篩選最優影像組學特征的系數收斂圖；2C：選定的9個特征及其系數；2D：訓練集和驗證集中每個患者的影像組學評分。Fig. 2 Construction of the radiomics signature. Radiomics feature selection using the least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) Logistic regression model. 2A：Adjusting the parameter λ to minimize the binomial deviation of the model fitting loss value, in order to select the best radimics characteristics;2B:Radiomics feature selection using the LASSO Logistic regression model; 2C:The selected 9 features and the values of their coefficients; 2D:The Radiomics scores(Rad?scores)for each patient in the training and test set.

2.3 聯合模型列線圖的驗證

TNM 分期、甲胎蛋白水平、γ-谷氨酰氨基轉移酶、Child-Pugh分級等臨床因素與HCC切除術后早期復發的相關性建立臨床模型，并結合影像組學評分得出早期復發風險評分的聯合模型列線圖(圖4A)。僅使用臨床因素構建的模型，訓練集的AUC 為0.77 (95%CI：0.67～0.87)，驗證集的AUC 為0.71 (95%CI：0.52～0.90)；聯合模型的訓練集AUC為0.87 (95%CI：0.79～0.94)，驗證集AUC為0.79 (95%CI：0.63～0.96) (圖3)。DeLong 檢驗，聯合模型與臨床因素模型訓練集ROC 比較，Z=2.363，P=0.018，影像組學模型與臨床因素模型訓練集ROC比較，Z=0.191，P=0.849。

圖3 訓練集(3A)和驗證集(3B)中的臨床模型(黃色)、影像組學模型(紅色)和聯合模型列線圖(綠色)的受試者工作特征(ROC)曲線。 圖4 列線圖和校準曲線。4A：臨床因素結合Rad?score 構建聯合模型列線圖；4B～4C：校準曲線表明訓練集(4B)和驗證集(4C)的列線圖校準良好。 圖5 決策曲線。紅線代表影像組學模型，黃線代表臨床模型，綠線代表列線圖聯合模型，對三個模型進行決策曲線分析，y軸和x軸分別表示標準化凈收益和高風險閾值概率。藍色線代表所有患者未復發的假設，水平黑線代表所有患者早期復發的假設。與臨床因素模型和影像組學模型相比，聯合模型列線圖提供了更高的凈收益。Fig 3 The receiver operator characteristic(ROC)curves of the clinical factors model,the radiomics model and the combined model nomogram,respectively in the training set 3A and test set 3B. Fig. 4 Nomogram and Calibration curve. 4A: The radiomics nomogram is constructed by combining clinical factor model and Radiomics score(Rad?score).4B,4C:The calibration curves indicate good calibration of the nomogram in the training and test sets.Fig.5 Decision curve analysis for the three models (The red line represents the imaging omics model, the yellow line represents the clinical model, and the green line represents the rosette combination model).They?axis andx?axis indicate the net benefit and the threshold probability, respectively.The blue line represents the hypothesis for all patients without recurrence, while the horizontal black line represents the hypothesis for all patients with early recurrence.The nomogram provides a higher net benefit than the clinical factors model and the radiomics.

訓練集擬合優度H-L 檢驗P=0.633，驗證集擬合優度H-L 檢驗P=0.147，預測值與真實值之間差異無統計學意義(圖4B、4C)。決策曲線顯示，聯合模型決策曲線在高風險閾值概率0.4～0.6段與臨床模型和影像組學模型相比明顯偏上(圖5)。

3 討論

根治性手術切除是目前最常采用的HCC 治療方式[13]，然而早期復發仍是導致患者術后五年內生存率降低的重要因素。多灶性和MVI 等腫瘤生物學行為已被確定為早期復發的危險因素，但是這些因素中的大多數只能在術后評估。因此在術前確定可靠的早期復發預測因子對于患者風險分層、治療決策支持和長期生存改善至關重要。目前已經有相關研究將影像組學應用于肝癌手術的預后評估，Akai等[9]通過影像組學特征結合隨機森林模型分析了肝癌切除術預后風險因素，得出影像組學評分作為高危個體風險(風險比=1.06，P=8.4×10-8)是預后不利影響因素之一。Mao 等[14]提取術前297 名HCC 患者的影像組學特征并結合臨床因素訓練機器學習模型，AUC 值為0.80，高效預測了HCC的術前病理分級，協助評估HCC患者的復發風險。

3.1組學模型的價值

本研究使用MRI 動態對比增強圖像作為影像組學分析期相，MRI相對于CT的主要優點是對比度分辨率高，同時能對肝內和病灶內的脂肪和鐵含量進行定量分析，而且能同時使用細胞外和肝細胞特征性對比劑。根據最近文獻報道，對于肝臟病變的定位和定性，MRI具有比CT更高的診斷準確率[15]。通常診斷HCC 常規使用釓對比劑多期增強掃描加脂肪抑制獲得的T1 加權快速回波掃描MRI (肝動脈期及隨后的門靜脈期和延遲期)以及DWI 等序列，其中肝動脈期特別是動脈晚期能夠獲得較好的病變強化信息[16]。同理與CT 相比MR 的影像學的多參數特性，體現在影像組學特征上，則HCC 患者MR 圖像中所對應的高通量信息相比較CT圖像更多，可提取參數數量更龐大，同時也需要排除更多弱相關性及冗余參數。因此在本研究中，采用mRMR算法評估避免特征間的冗余，經初步篩選后再通過LASSO 結合多折交叉驗證對剩余特征進行降維，最終得出小于10個特征，以防止過擬合，得到的9個特征中，3個對預后生存不利的回歸系數要明顯高于6個有利特征。LASSO是一種同時進行特征選擇和正則化的回歸分析方法，尤其適用于高維數據的降維，同樣的LASSO 正則化Logistic 回歸也是對預測因子數量遠遠超過觀測數的連續變量的有效選擇策略，經過這些特征訓練，9 個特征被合并成一個Rad-Score，該評分在訓練集和測試集中表現了良好的預測效果(AUC 分別為0.79、0.76)，符合多預后因素的組合比單一因子具有更好的預測性能的統計觀點。

3.2 聯合模型的價值

Rad-Score可作為一個獨立的生物學標志物，在本研究中引入了部分臨床因素建立聯合模型，已有研究表明MVI、術前血清AFP、腫瘤直徑等臨床指標是導致HCC患者根治性切除術后早期復發風險增加的危險因素[17-18]，可以提示HCC 術后情況。本研究從臨床因素篩選出HCC TNM 分期，AFP、Child-Pugh分級以及γ-谷氨酰胺基轉移酶指標。在聯合模型列線圖的五個組成部分中，可以看出單一臨床因素的量化指標均與實際臨床應用相符，其中TNM 分期主要劃分依據是腫瘤原發灶情況，腫瘤原發灶的大小是HCC早期復發的重要危險因素，隨著腫瘤增大，早期復發率升高。在本研究中MVI 的多因素邏輯回歸P值＞0.05,未列入早期復發的獨立危險因素。AFP 是HCC 腫瘤標志物，用于HCC 診斷、療效評估、復發監測及預后評估等方面，AFP 水平是HCC 早期復發的危險因素[19]。在本研究中，術前血清AFP 水平與早期復發密切相關。Child-Pugh 分級是對肝硬化患者肝臟儲備功能進行量化評估的分級標準，也是肝臟術前的評估手術風險的重要參考，較差的肝功能儲備對預后影響明顯，在本研究中B 級相對于A 級有更高的復發風險。γ-谷氨酰胺基轉移酶升高主要受肝內合成亢進影響，與AFP聯合檢測，可提高肝癌診斷正確率，其對早期復發的相關性與AFP 接近。Rad-Score 模型ROC 曲線訓練集和驗證集AUC (分別為0.79、0.76)與臨床因素模型AUC (分別為0.77、0.71)相比較高，但Delong 檢驗顯示Rad-Score 模型與臨床因素模型之間ROC 差異無統計學意義(P值=0.8488)，這表明兩個模型對預測術后早期復發效能接近?？紤]到我們收集到的大多數HCC病例為單發，且被排除的少數多發腫瘤HCC 病例并不能確定哪一處病灶對復發的影響更大，因此為了控制這個不確定因素對模型效能的影響，在我們的研究中，只納入了單發腫瘤的HCC 患者，這一研究設計可能與臨床因素模型的AUC相對較低有關。按照傳統分期系統，這些患者屬于早期或中期，更適合手術治療[20]，在多發腫瘤的HCC 病例中臨床分期及實驗室檢查的提示作用更顯著。聯合模型在訓練集和測試集上AUC (分別為0.87、0.79)均高于前兩者，校準曲線顯示聯合模型預測概率與實際概率之間具有良好的擬合度，當前數據集中的信息利用較充分；另外聯合模型的DCA偏高于另外兩個模型，結合Delong檢驗結果，聯合模型與臨床因素模型ROC 差異具有統計學意義(P值=0.018)，提示聯合模型的臨床預測凈收益率要高于另外兩個模型。綜上所述，基于增強MR的影像組學特征已被證明是HCC患者早期復發的一個有效的術前預測指標，綜合臨床因素和MR 組學特征模型效能及臨床凈收益率較高，可幫助臨床醫生選擇適合HCC患者的治療方案。

3.3 局限性和展望

本研究為初步探索性研究，單中心，樣本量相對較小，回顧性研究存在潛在的信息偏倚，圖像質量如信噪比、重采樣參數對顯示腫瘤異質性信息有較大影響，可能造成預測結果的穩定性差，雖然所有MR圖像都是在統一的MR 掃描儀中采集的，并具有標準化的成像采集序列，提取特征時的統一重采樣及提取后的數據預處理，以減少我們結果的偏差，但其他機構的外部驗證是必要的。因此在后續的研究中，我們將引入外部驗證或者組成多中心研究，獲取更大樣本量數據做進一步驗證。另外Kierans等[21]的研究發現腫瘤環形強化等影像學形態特征也是早期復發的獨立預測因子，已有相關研究證明腫瘤周圍區域內的影像組學特征具有臨床應用價值[22]。本研究選擇MR 增強動脈晚期(注射對比劑后37 s采集)圖像進行影像組學特征提取，僅是該時相的腫瘤內部影像組學數據模型，有所偏頗；相較動脈晚期，動脈早期沒有背景強化的干擾，能更清晰顯示分支動脈信息，延遲期有假包膜強化對腫瘤周圍影像學特征顯示更確切，DWI提供了有關組織細胞密度和細胞膜完整性的信息[23]，較多文獻認為HCC 多序列、動態多圖像影像組學綜合分析更接近腫瘤異質性實際狀況[24]。上述研究給我們提供了新的思路，今后，我們將用多序列多期相MR 影像組學驗證HCC 腫瘤影像形態學及腫瘤周圍強化特征因素，并綜合這些因素所體現的HCC腫瘤周圍和內部影像組學特征建立預測模型，以提高增強MR 組學模型對HCC根治性切除術后早期復發的預測效能。

作者利益沖突聲明：全部作者均聲明無利益沖突。