膳食菊苣酸對過敏性哮喘小鼠的體內調節作用

李 琴，申云琴，郭興悅，徐藝璇，李靈杰，武音帆，楊 燕，陳彥球

（1.中山大學公共衛生學院（深圳），廣東深圳 518000；2.廣東省營養與健康重點實驗室，廣東廣州 510080；3.廣東省營養轉化工程技術研究中心，廣東廣州 510080；4.中山大學公共衛生學院，廣東廣州 510080；5.同濟大學附屬上海市第四人民醫院，臨床營養科，上海 200434；6.廣州市婦女兒童醫療中心耳鼻喉科，廣東廣州 510623）

哮喘是一種以氣道的高反應性、阻塞、重塑為特征的炎癥性疾病，全世界大約有3 億人患有哮喘，且患病率逐年上升［1］。過敏性哮喘是哮喘中的主要類型，占60%～80%［2］。過敏性哮喘的發病機制復雜，尚未完全闡明，其中，T 細胞尤其是2 型輔助性T 細胞（Th2）分化失衡理論長期以來被認為是其主要發病機制［3］。并且，過敏性哮喘的一線治療藥物糖皮質激素也以Th2 為靶點發揮作用，但是此種藥物存在很多副作用，且對難治型哮喘沒有效果［4］。因此，尋找更為安全有效的治療手段具有極大的實用價值。膳食營養因素與過敏性疾病等免疫相關疾病的發生發展密切相關［5］。例如，一項為期10 年的多中心人群橫斷面研究顯示，更頻繁地食用水果、蔬菜和魚類與更低的哮喘患病率相關［6］。除了健康的膳食模式以外，多種膳食營養素如槲皮素等天然植物化學物也能有效緩解和治療過敏性哮喘［7］。天然植物營養素菊苣酸（cichoric acid），是一種羥基肉桂酸，屬于苯丙酸家族。菊苣酸存在于許多植物的根部，在菊苣、紫錐花和羅勒中含量尤其豐富。研究證明，菊苣酸具有多種有益的生物功效，如調節免疫功能、抗病毒、抗炎癥、抗氧化等［8］，但菊苣酸對過敏性哮喘是否具有調節作用尚不清楚。因此，本研究通過膳食添加菊苣酸干預過敏性哮喘小鼠，旨在初步探索菊苣酸對過敏性氣道炎癥的體內治療效應，為防治過敏性哮喘提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

菊苣酸（＞98%，阿拉?。?，AIN 93G 飼料，卵清蛋白（Sigma），氫氧化鋁（阿拉?。?，DNA酶（Roche），流式細胞術抗體CD3e（PE-eFluor? 610）、CD4（APC-eFluor? 780）、CD8a（FITC）、IL-17A（PE）、IL-4（PE-Cy7）、IFNγ（APC），細胞刺激劑、破膜破核劑（eBioscience）。

1.2 實驗動物與分組

5 周齡SPF 級 雌性BALB/c 小鼠，體質量19～21g，購自中山大學實驗動物中心，飼養于中山大學公共衛生學院SPF 級動物房。隨機將小鼠分為4組（n=4）：正常組（Control）、過敏性哮喘模型組（OVA）、膳食菊苣酸干預組（OVA+CA）和藥物對照組（OVA+DEX）。實驗前在動物房適應性飼養一周，實驗期間小鼠自由攝食與飲水，墊料定期更換，定期監測小鼠攝食量與體質量。動物實驗獲得中山大學動物倫理委員會批準，許可證號：SYXK［粵］2017-0080。

1.3 實驗動物干預與樣本采集

1.3.1 過敏性哮喘小鼠模型 過敏性哮喘小鼠造模方法具體如下：在第0 天、第7 天和第14 天進行致敏，具體方法為使用200 μL OVA 溶液（含40 μg OVA，4 mg 氫氧化鋁，溶于PBS），于小鼠左下腹腹腔注射；第21 天至第25 天進行激發，操作是采用5%的OVA 溶液霧化給藥30 min，隨后用40μg/μL的OVA 溶液滴鼻給藥，每日1 次。正常對照組用PBS進行相同操作。

1.3.2 膳食菊苣酸干預 將菊苣酸粉末均勻混合于飼料中，制成菊苣酸含量為400 mg/kg 的飼料飼喂膳食菊苣酸干預組。其余組給予普通飼料。

1.3.3 樣本采集和指標檢測 末次激發后，記錄10 min 內各組小鼠的撓鼻次數。24 h 內使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，心臟取血法獲取小鼠全血用于檢測血細胞，采集左肺固定于40 g/L 多聚甲醛中待病理學處理分析，采集右肺用于檢測肺組織T 細胞亞群。

1.4 肺部病理染色與病理評分方法

取新鮮小鼠肺組織用40 g/L 多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色和過碘酸-雪夫（PAS）染色。在光學顯微鏡下觀察H&E染色切片，放大400 倍，每個切片隨機選取5 個氣管，進行炎癥評分，評分范圍為0～5 分：“0”分為未見炎癥浸潤，“1”分為受影響氣道范圍＜20%，“2”分為20%～40%受影響氣道范圍，“3”定義為40%～60%，“4”定義為60%～80%和“5”定義為＞80%受影響氣道范圍。顯微鏡下放大400 倍觀察PAS 染色切片，每個切片隨機選取5 個氣管，用Image J 軟件分析氣管中PAS陽性區域占整個氣管的比例，從而分析肺部杯狀細胞增生情況。

1.5 外周血細胞的測定

取小鼠的全血，使用配備五分類血細胞試劑盒（DREW SCIENTIFIC）的全自動動物血液分析儀（HEMAVET 950），檢測血液中白細胞的數量以及各種白細胞亞類（包括嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞）的百分比，根據嗜酸性粒細胞比例和淋巴細胞比例計算嗜酸性粒細胞/淋巴細胞比值（ELR）。

1.6 流式細胞術

取小鼠新鮮完整的肺組織，使用DNA 酶和膠原酶消化1 h。隨后進行研磨，加入細胞刺激劑于CO2培養箱中培養5 h。培養后用buffer Ⅱ洗滌兩遍，然后使用相應抗體和破膜破核劑按順序進行表面染色（CD3、CD8、CD4）、破膜破核和胞內染色（IL-4、IL-17A、IFNγ）。洗滌后用200 μL buffer Ⅱ重懸，10%多聚甲醛固定，使用貝克曼分析型流式細胞儀（CytoFLEX S）上機檢測。

1.7 統計學分析

研究數據使用IBM SPSS 23.0 軟件進行分析，計量資料以mean ± SEM 的形式表示，使用Graph-Pad Prism 5 軟件繪制統計圖。各組間差異采用單因素方差分析（ANOVA）進行比較，并采用LSD 法進行隨后的兩兩比較；如數據不滿足正態性和方差齊性則使用Kruskal Wallis 檢驗。雙側檢驗，P＜0.05 視為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 膳食菊苣酸對小鼠體質量變化的影響

在進行OVA激發（Day 21）之前，各組小鼠的體質量呈逐漸增長的趨勢（圖1A）；在激發后，除正常組外，其他三組小鼠的體質量開始出現不同程度的減輕（圖1A）。進一步比較各組小鼠在激發前后的體質量差值，發現膳食菊苣酸干預組的體質量下降情況較OVA 組小鼠相比明顯緩解，差異具有統計學意義（P＜0.05；圖1B）；藥物對照組的體質量也呈現恢復趨勢，相比于OVA 組小鼠，差異尚未達到統計學意義（P=0.072）。

圖1 小鼠體質量變化情況Fig.1 The change of body weight in mice

2.2 膳食菊苣酸對小鼠鼻部癥狀的影響

激發后，OVA 組小鼠煩躁不安，頻繁撓鼻，箭頭所指之處鼻部胡須稀疏、短缺（圖2A）。與正常組相比，OVA組小鼠撓鼻次數明顯增多（P＜0.001），而膳食菊苣酸干預后，小鼠撓鼻次數明顯減少（P＜0.05；圖2B）。

圖2 小鼠鼻外觀與撓鼻頻率Fig.2 Nasal appearance and rubbing frequencies of mice

2.3 膳食菊苣酸對小鼠外周血中炎癥細胞的影響

相比正常組小鼠，OVA 組外周血中的總白細胞數量（P＜0.05；圖3A）、嗜酸性粒細胞比例（P＜0.01；圖3B）、嗜酸性粒細胞/淋巴細胞比值（P＜0.001；圖3D）、嗜堿性粒細胞比例（P＜0.01；圖3E）、單核細胞比例（P＜0.01；圖3F）和中性粒細胞比例（P＜0.01；圖3G）均升高，差異均有統計學意義。經膳食菊苣酸干預后，小鼠外周血中的總白細胞數量（P＜0.05；圖3A）、嗜酸性粒細胞比例（P＜0.05；圖3B）、嗜酸性粒細胞/淋巴細胞比值（P＜0.05；圖3D）、嗜堿性粒細胞比例（P＜0.01；圖3E）、單核細胞比例（P＜0.01；圖3F）和中性粒細胞比例（P＜0.05；圖3G）較OVA 組小鼠均下降，差異均有統計學意義。與正常組相比，OVA 組小鼠外周血淋巴細胞比例有所下降，差異尚無統計學意義（P＞0.05；圖3D）。

圖3 小鼠外周血炎癥細胞Fig.3 Peripheral blood cells of mice

2.4 膳食菊苣酸對小鼠肺組織炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生的影響

相比正常組小鼠，OVA 組小鼠肺組織出現炎癥浸潤（P＜0.001；圖4B）和杯狀細胞增生（P＜0.05；圖4D），差異具有統計學意義。經膳食菊苣酸干預后，小鼠肺組織炎癥浸潤（P＜0.05；圖4B）和杯狀細胞增生情況（P＜0.05；圖4D）有所緩解，差異具有統計學意義。

圖4 小鼠肺組織炎癥浸潤與杯狀細胞增生Fig.4 Pulmonary inflammation and goblet hyper-production in lung tissues of mice

2.5 膳食菊苣酸對小鼠肺組織中各類Th 細胞亞型的影響

相比正常組小鼠，OVA 組小鼠肺組織中Th2細胞比例（P＜0.001；圖5D）和Th17 細胞比例（P＜0.01；圖5E）明顯上升，差異具有統計學意義。經膳食菊苣酸干預后，小鼠肺組織中Th2細胞比例（P＜0.001；圖5D）和Th17 細胞比例（P＜0.001；圖5E）相比于OVA 組明顯下降，差異具有統計學意義。在各實驗組中，Th1細胞比例沒有差異（P＞0.05；圖5F）。

圖5 小鼠肺組織中Th細胞百分比Fig.5 The percentages of Th in the lung tissues of mice

2.6 膳食菊苣酸對小鼠肺組織中各類Tc 細胞亞型的影響

相比正常組小鼠，OVA 組小鼠肺組織中Tc2 細胞比例（P＜0.001；圖6D）和Tc17 細胞比例（P＜0.05；圖6E）顯著上升，差異具有統計學意義。經膳食菊苣酸干預后，小鼠肺組織中Tc2 細胞比例（P＜0.001，圖6D）和Tc17 細胞比例（P＜0.001；圖6E）相比于模型組明顯下降，差異具有統計學意義。在各實驗組中，Tc1細胞比例沒有差異（P＞0.05；圖6F）。

圖6 小鼠肺組織中Tc細胞百分比Fig.6 The percentages of Tc in the lung tissues of mice

3 討論

本研究首次發現膳食菊苣酸干預能夠有效改善小鼠過敏性哮喘，包括改善小鼠的體質量減輕現象、緩解鼻部瘙癢癥狀，有效降低外周血中炎癥細胞的數量和比例，改善肺組織炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生情況，下調肺部Th2、Th17、Tc2、Tc17 比例，提示膳食菊苣酸對過敏性哮喘小鼠的體內炎癥具有抑制作用。

在受到過敏原刺激的人群中，Th2 細胞所產生的過度的免疫反應是導致過敏性哮喘的根本原因，靶向Th2 免疫反應的藥物至今為止仍是過敏性哮喘的主要治療手段，也是判斷治療方法是否有效的主要標準之一［9］。當機體受到過敏原刺激時，CD4+T 細胞趨向于分化成Th2、Th17 細胞，而分化為Th1細胞受到抑制，打破了正常機體環境中的Th1/Th2/Th17 平衡。Th2 細胞過度分化并分泌相關細胞因子如IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13，這些細胞因子進而促進B細胞增殖和免疫球蛋白E（IgE）生成，并且導致嗜酸性粒細胞增多、杯狀細胞增生、氣道平滑肌收縮［10］。Th17 在中性粒細胞型哮喘中扮演主要角色，也參與過敏性哮喘的發病過程，在過敏性哮喘中的重要性僅次于Th2。在本研究中，我們發現膳食菊苣酸干預能夠有效減少過敏性哮喘小鼠肺部的Th2、Th17 比例，抑制Th2、Th17 細胞分化，并且緩解了小鼠肺部炎癥浸潤和杯狀細胞增生。與之類似的，Tc2 細胞和Tc17細胞在哮喘發病過程中也十分重要［11］，同樣在菊苣酸干預后被抑制。盡管Th1和Tc1的比例未發生明顯變化，但Th2/Th1免疫平衡仍是向著Th1 優勢的方向，也就是恢復正常機體平衡的方向轉變，在其他研究中也出現過類似情況［12］。因此，本研究提示菊苣酸可以調節小鼠體內T細胞分化，有效治療小鼠過敏性哮喘。

Th2 型炎癥免疫反應導致的組織中嗜酸性粒細胞炎癥也是過敏性哮喘的特性之一，這種嗜酸性粒細胞增多的癥狀不僅體現在組織當中，還能在病人的血液和痰液中檢測到［13］。在哮喘病人的研究中還發現血嗜酸性粒細胞/淋巴細胞比率（ELR）升高，ELR 是一種能夠準確預測過敏性哮喘的指標［14］。本研究的結果顯示，膳食菊苣酸干預不僅有效降低組織炎癥，還能夠有效抑制血液中包括嗜酸性粒細胞在內的多種粒細胞浸潤，降低ELR。

在亞洲、歐洲，富含菊苣酸的植物如菊苣和紫錐花，被人們用作治療炎癥、傳染病、糖尿病的傳統草藥，而菊苣酸常被用作這類草藥產品質量檢查的標志物［15］。近年來，越來越多的研究證實了菊苣酸在細胞培養和動物研究中的有益作用，包括抗炎、抗氧化、抗病毒、調節免疫等等。給予過敏性休克模型小鼠20 mg/kg 的菊苣酸口服，能夠抑制組胺釋放，調節肥大細胞介導的過敏反應［16］，提示菊苣酸是治療過敏相關炎癥的有效藥物。在慢性應激小鼠模型中，研究者進一步證實了菊苣酸的免疫調節機制：菊苣酸通過上調CD28和CD80的表達以及下調CTLA-4 來進行免疫刺激，調節小鼠免疫反應和Th1/Th2 穩態［17］，這與本研究中菊苣酸能夠調節Th1/Th2/Th17免疫穩態的現象是一致的。

在以往的動物研究中，菊苣酸的干預劑量設置為每天2～60 mg/kg不等?？紤]到實驗的干預時間、實驗動物品種以及疾病模型的特性，本研究將劑量設置為每千克飼料摻入400 mg 菊苣酸進行干預，約相當于給予小鼠每天40 mg/kg的菊苣酸，這個劑量等價于人體每日服用菊苣酸約200 mg［18］，遠低于曾在人體研究中使用的劑量［19］。這提示，本研究所使用的菊苣酸劑量，若拓展到人體應用，在理論上是可行的。在大鼠體內進行的代謝動力學研究表明，菊苣酸在血漿中消除速率低，駐留時間長，并且在肺內的濃度僅次于肝臟［20］，推測這可能是菊苣酸在較低濃度下仍能發揮抑制肺部炎癥作用的原因。

過敏性哮喘是遺傳因素和環境因素共同調控的疾病，發病機制復雜，目前尚無治愈的方法。膳食營養素作為一種安全、有效、經濟的手段，不僅有治療疾病作用，更能融入人群的日常生活當中，從預防的角度來應對復雜的過敏性疾病。因此，本研究欲以膳食營養為基點，為過敏性哮喘提供有效的防治手段，將來，可通過日常攝入富含有益營養素的食物，或開發功能性食品以及膳食補充劑，大大降低過敏性哮喘的發病率和緩解發病癥狀。

綜上所述，本研究首次通過動物體內實驗，證實了膳食菊苣酸能有效治療過敏性哮喘小鼠體內炎癥，從膳食營養的角度為防治過敏性哮喘提供了新的思路和理論依據。