磁微?；瘜W發光法在食品中百草枯殘留量檢測的應用研究

唐潔 莫緒 張啟韓

摘 要：百草枯（Paraquat，PQ）又稱巴拉利，是一種有效的除草劑，具有觸殺作用和一定內吸作用，能迅速被植物綠色組織吸收，制其枯死。百草枯在植物中容易產生殘留，對人體毒性極高，且無特效解毒藥，是人類急性中毒死亡率最高的除草劑，但因其高效、實用性，仍然未能完全杜絕其應用，每年百草枯中毒現象仍時有發生。因此，建立快速、準確、靈敏的食品中百草枯殘留檢測對有效監測食品安全、控制農藥濫用具有非常重要的意義。本文利用磁微?；瘜W發光免疫檢測方法對百草枯6個不同濃度的標準液C1～C6進行了定量分析。結果表明，該方法準確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩定性分析均優于國家標準要求。

關鍵詞：百草枯;磁微?；瘜W發光法;定量檢測

Application of Magnetic Particle Luminescence Technology in the Determination of Paraquat Residues in Food

Tang Jie， Mo Xu， Zhang Qihan

（Guilin Normal College， Guilin 541199， China）

Abstract： Paraquat （PQ）， also known as Balali， is an effective herbicides. It has contact killing effect and certain internal absorption effect， which can be quickly absorbed by plant green tissue to make it wither. Paraquat is easy to produce residues in plants， highly toxic to human body， and there is no specific antidote. It is the herbicide with the highest mortality of acute poisoning in human beings. However， due to its high efficiency and practicality， the application of paraquat is still not completely eliminated， and paraquat poisoning still occurs from time to time every year. Therefore， the establishment of rapid， accurate and sensitive detection of paraquat residues in food is of great significance to effectively monitor food safety and control pesticide abuse. In this paper， 6 different concentrations of paraquat standard solutions C1～C6 were quantitatively analyzed by magnetic particle chemiluminescence immunoassay. The results show that the accuracy， sensitivity， specificity， precision and stability of the method are better than the requirements of the national standard.

Keywords： paraquat; magnetism particulate immune-chemistry luminescence method; quantitative detection

截止到2020年，包括中國、英國、歐盟、丹麥、俄羅斯及巴西等20多個國家已經禁止或者嚴格限制使用百草枯。目前國內外應用于禁用農藥殘留的檢測技術為氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜-串聯質譜法和免疫分析法等[1]。

色譜分析法由于檢測儀器體積龐大，對使用環境及操作者素質都有非常高的要求，同時檢測時間過長，只適合在特定的實驗室由專業人員進行操作，難以普及推廣應用;免疫分析法主要根據體外生成原理，利用抗體作為生化探測器實現對農殘的定性和定量分析;其中，采用酶聯免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、熒光免疫分析（Fluorescence Immunoassay，FIA）進行檢測都查到有相關文獻報道。但食品中農藥殘留的量往往非常低，這些方法由于其檢測靈敏度和精密度偏低，因而檢測結果達不到國家標準要求的檢出率。在免疫分析法中，利用磁微?；瘜W發光法技術檢測百草枯農藥殘留還未見報道[2]。

本文采用單克隆抗體、AP酶標記以及磁微粒分離技術，建立了百草枯的磁微?；瘜W發光免疫定量檢測方法。該方法是在免疫分析法基礎上發展起來的集化學發光、特異性免疫分析及磁微粒分離等技術于一體的新型檢測技術，相對于其他傳統分析方法，該技術具有靈敏度高、檢測范圍寬、檢測結果準確、檢測成本低及易于實現自動化操作等系統性優勢，最低可檢測到10-18 g量級，能及時有效地為監管機構提供監測數據，為政府職能部門監測和控制農藥濫用提供現實依據[3-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris），西隴化工股份有限公司;氯化鈉，西隴化工股份有限公司;牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），Sigma有限公司;甘露醇，西隴化工股份有限公司;海藻糖，西隴化工股份有限公司;BRONIDOX-L，天津希恩思生化科技有限公司;吐溫20（Tween20），上海聯邁生物工程有限公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平：AR224CN（奧豪斯儀器有限公司）;冷凍離心機：SF-TGL-20R（上海菲恰爾）;pH計：Sartoriuspp-20;蛋白測定儀：K9840（山東還能科學儀器有限公司）;集熱試恒溫加熱攪拌器：DF-101S（鄭州長城科工貿有限公司）;細胞破碎儀：SM-650A（南京舜瑪儀器設備有限公司）;制冰機：ZBL-35（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑緩沖液配制

依次稱取以上物質溶解到800 mL純化水里，用鹽酸調節pH值為7.4，并定容為1 000 mL的儲備液備用，分別為Tris（0.01 mol/L）、氯化鈉（0.15 mol/L）、BSA（0.5 mol/L）、甘露醇（0.5 mol/L）、海藻糖（0.5 mol/L）、BRONIDOX-L（0.01 mol/L）及Tween20（0.05%）。

1.3.2 檢測試劑盒主要組份的制備

檢測試劑盒主要組份由試劑R1、試劑R2及標準液組成。

（1）PQ試劑R1配制。生產工藝流程如圖1所示，采用抗體偶聯操作工藝。①取10.00 mL磁珠微球（固體物10%），磁分離10 min，棄上清，用100 mL?0.5 mol/L、pH 5.0的MES緩沖液重懸，在混勻儀上混勻10 min;磁分離10 min，棄上清，加入100 mL?0.5 mol/L、PH 5.0的MES緩沖液重懸。②稱取100 mg N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），用0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液充分溶解至10.0 mg/mL;稱取50 mg EDC，用0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液充分溶解至10.0 mg/mL。③在攪拌的條件下，往磁珠微球中先后加入10 mL NHS溶液和5 mL EDC溶液，混勻;④在攪拌的條件下，往磁珠微球中加入百草枯抗體10.00 mg，混勻;⑤磁分離10 min，棄上清，用100 mL 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸，混勻;⑥磁分離10 min，棄上清，加100.0 mL 10%BSA重懸，混勻;⑦磁分離10 min，棄上清;用100 mL?0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸，混勻即得。

（2）PQ試劑R2配制。R2生產工藝流程如圖2所示，采用抗原標記操作工藝。①稱取5 mg百草枯化合物，12 mg DSS，用200 μL DMSO溶解，再加入10 μL N-甲基嗎啉，混合均勻，37 ℃反應90 min。②反應完成之后再加入1 mL的DMSO，得到百草枯活化液待用。③取1 mg AP酶溶解在0.1 mol/L Tris，pH為8.0的緩沖液中，加入600 μL百草枯活化液，反應30 min。④反應完成之后，加入100 μL 1 mol/L甘氨酸，反應15 min。⑤用蛋白測定儀確定蛋白標記物濃度。⑥用酶標記物稀釋液稀釋至25 μg/mL。

1.3.3 標準液的制備

將百草枯國家標準物（貨號：YJ-XXXX）用0.1 mol/L PH為7.4的PBS緩沖液溶解成1 mg/mL母液;再分別稀釋成0 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL及500 ng/mL 6個不同濃度的標準液C1～C6。

2 結果與分析

用6個不同濃度標準液對發光儀進行定標后，分別進行準確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩定性分析。

2.1 準確度分析

將1 mL高濃度標準液C5（250 ng/mL）加入到9 mL低濃度標準液C1（0 ng/mL）中，混勻后在化學發光免疫分析儀上測試混合液和低濃度標準液濃度值，各測試3次，計算平均值，回收率應在85%～115%。根據公式（1）計算結果，回收率為99.58%，在要求范圍以內。測試數據見表1。

（1）

式中：R為回收率，%;V為加入高濃度標準液體積，mL;V0為低濃度標準液的體積，mL;C為混合液測試平均值，ng/mL;C0為低濃度標準液測試值，ng/mL;Cs為已知高濃度標準液濃度，ng/mL。

2.2 靈敏度評估

取標準液C1和C2作為待測樣本，在化學發光測定儀上對C1進行20次測定，C2測試3次，統計測量結果的發光值（RLU），計算C1的平均值（M）和標準差（Standard Deviation，SD），得出M-2SD;同時根據C1和C2之間的發光值（RLU）進行兩點回歸擬合得出一次方程，將M-2SD的RLU值代入上述方程中，求出對應的濃度值，即為產品的靈敏度，要求靈敏度不能大于5 ng/mL（國家標準要求最低殘留量）。從表2數據可以計算得出，試劑檢測靈敏度為0.37 ng/mL，遠遠小于5 ng/mL，產品具有很高的靈敏度。

2.3 特異性分析

往試劑盒中滴加干擾物并在化學發光測定儀上分別測定濃度為500 ng/mL的干擾物多菌靈和毒死蜱，各測試3次，測定結果應不得高于0.5 ng/mL。從表3數據可以看出，兩組干擾物的測試結果均遠遠小于0.5 ng/mL，說明試劑盒受干擾物影響很小，具有很高的特異性。

2.4 精密度

在化學發光測定儀上分別測定標準液C2和C5，各重復測試至少10次，分別計算測量值的平均值（x）和標準差（SD）[6]。計算變異系數（Coefficient of Variation，CV），結果應≤8%。由表4可知，標準液C2和C5變異系數均小于8%，產品的精密度很高。

2.5 穩定性評估

將制備好的試劑盒進行37 ℃加速老化7 d后，用化學發光免疫分析儀測試，對測試結果的發光值（RLU）進行對照，數據見表。從表5中統計結果可以看出，實驗組的蛋白活性回收率達到了95%以上，說明試劑盒穩定性很好。

3 結論

利用磁微?；瘜W發光法技術對百草枯6個不同濃度的標準液C1～C6進行檢測，通過準確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩定性分析，可以得到回收率為99.58%，檢測靈敏度為0.37 ng/mL，精密度≤8%，蛋白活性回收率可達到98.17%。

參考文獻

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[2]于超，楊少明，王術，等.不同方法檢測新型冠狀病毒血清抗體與凝血功能的結果探討[J].血栓與止血學，2020，26（6）：903-906.

[3]郭蘭英，萬東山，張怡青，等.磁微?；瘜W發光法測定牛乳中呋喃它酮代謝物抗生素殘留方法的建立[J].中國衛生檢驗雜志，2014，24（19）：2778-2780.

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[5]張立娟.磁微?；瘜W發光法與酶聯免疫吸附法測定抗中性粒細胞胞漿抗體的結果比較[J].中國免疫學雜志，2016，32（8）：1175-1178.

[6]梁高道，毛翔，黃常剛，等.全自動磁微?；瘜W發光法快速篩查呋喃類藥物殘留[J].環境科學與技術，2019，42（1）：178-183.