黑果枸杞花青素對人肝癌HepG2細胞凋亡與自噬相互作用的影響

劉嘉華，王夢杰，張龍飛，薛才華，武 強，武鴻蓮，王 碩，吳 華

(青海大學農牧學院，青海 西寧 810016)

肝癌是全球六大高發癌癥之一，其發病癥狀隱匿，病程較短，嚴重威脅著人類的健康。天然植物提取物大多具有藥用價值，從天然植物提取物中尋找無毒、綠色、作用強的抗癌藥物已成為目前的研究熱點。黑果枸杞屬于茄科、枸杞屬的灌木，是我國青海、寧夏、甘肅、新疆等地特有的藥用植物品種之一，是提取花青素的最佳原材料，素有“花青素之王”的美稱[1]。已有研究表明，黑果枸杞花青素(Anthocyanins fromLyciumruthenicumMurr，ALR)具有降血糖、降血脂和抗氧化、抗腫瘤及提高免疫能力等特性，且其抗腫瘤作用可能是通過促進癌細胞凋亡等方式實現[2-3]。

細胞凋亡與自噬是引發細胞程序性死亡的兩種方式，二者可被相同的信號通路調節或相同的刺激因素激活，在正常的生理或病理狀態下發揮重要作用。凋亡與自噬之間可能存在的關系為相互促進、相互拮抗、相互獨立等[4-5]。研究并利用這些交互作用，對于探究腫瘤的發生機制以及腫瘤疾病的治療方法具有重要作用。有研究證實，花青素可通過活化自噬信號通路，抑制大鼠軟骨細胞凋亡[6]。但目前關于ALR對人肝癌HepG2細胞凋亡與自噬相互作用的研究鮮見報道?；诖?，本試驗以黑果枸杞花青素和人肝癌HepG2細胞為研究對象，通過檢測ALR結合自噬抑制劑3-MA對HepG2細胞凋亡的影響，及ALR結合JAK2/STST3凋亡通路抑制劑AG490對人肝癌HepG2細胞自噬的影響，探究二者之間的相互關系，以期為ALR的深度開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人肝癌HepG2細胞購自中國科學院上海細胞庫。

ALR購自青海金麥杞生物科技有限公司(花青素64.4%，蛋白6%，糖1.32%，氨基酸3.56%，灰分0.6%，其他24.12%)[7]。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要試劑配制

(1)ALR溶液。稱取10 mg ALR溶于50 mL DMEM培養基，配制成200 μg/mL的溶液于4 ℃冰箱避光保存。

(2)3-MA自噬抑制劑。稱取20 mg 3-MA溶于3.36 mL PBS緩沖液，配制成20 mmoL的溶液，試驗濃度為5 mmoL。

(3)AG490凋亡通路抑制劑。稱取10 mg AG490溶于3.398 mL DMEM培養基，配制成10 mmoL的溶液，試驗濃度為10 mmoL。

1.2.2 細胞培養 使用DMEM培養基(含10%胎牛血清)，將人肝癌HepG2細胞放置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中進行培養，待細胞生長至70%～80%融合時進行細胞傳代。收集0.1 mL對數期細胞懸液于1.5 mL離心管，加入0.8 mL PBS溶液與0.1 mL 0.4%臺盼藍染液，搖勻并在室溫條件下放置2～3 min,用血球計數板在顯微鏡下計數。

1.2.3 分組及處理 細胞計數后，用DMEM培養基將細胞懸液稀釋到1×106個/孔，取24孔細胞培養板，每孔加入500 μL的細胞稀釋液，然后按分組分別加入ALR母液、AG490母液，再加入DMEM培養液調整至相應濃度,每孔終體積為2 mL，每組3個復孔，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h后收集細胞。按照青海大學農牧學院動物營養與飼料科學課題組前期試驗篩選出的ALR最佳增殖濃度(25 μg/mL)分組：①3-MA抑制劑試驗組：對照組和ALR組、3-MA組、ALR+3-MA組。②AG490抑制劑試驗組：對照組和ALR組、AG490組、ALR組+AG490組。

1.2.4 人肝癌HepG2細胞核形態變化檢測 以每孔4×104個細胞接種至24孔培養板，按對照組和ALR組、3-MA組、ALR+3-MA組進行培養。將細胞用1% PBS洗滌2次并用4%甲醛固定，加入Hoechst染液，室溫孵育30 min后再用1% PBS洗滌2次，然后使用倒置熒光顯微鏡觀察。使用Nikon Eclipse Ti熒光顯微鏡捕獲顯微照片，并使用DS-Qi1黑白相機拍照。

1.2.5 人肝癌HepG2細胞凋亡率檢測 以每孔5×106個細胞接種至24孔培養板，按對照組和ALR組、3-MA組、ALR+3-MA組進行培養。處理24 h后，離心并用PBS洗滌兩次，按試劑盒說明書進行AnnexinV/PI染色后用流式細胞儀檢測。

1.2.6 凋亡及自噬相關因子的mRNA表達檢測 用TRNzol法分別提取各組細胞總RNA,并進行RNA完整性及濃度檢測，隨后按照cDNA反轉錄試劑盒操作說明書要求將RNA反轉錄為cDNA，最后采用SuperReal彩色熒光定量預混試劑盒進行定量PCR分析。qRT-PCR引物序列見表1。

1.2.7 凋亡及自噬相關因子的蛋白表達檢測 分別提取各組細胞總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。使用SDS-PAGE電泳后進行轉膜及封閉，配制及加入一抗(p-JAK2抗體、p-STAT3抗體、LC3-Ⅱ抗體及GADPH抗體)，4 ℃孵育過夜，加入山羊抗IgG二抗，室溫下孵育1 h后洗膜，在暗室顯影，并定影。采用Image J對條帶吸光度(A)值進行分析。

1.3 統計學分析方法

試驗數據采用統計軟件(SPSS 21.0)分析，應用one-way ANOVA選擇Duncan′s法進行多重比較，采用繪圖軟件(GraphPad Prism8.0)繪圖。

2 結果與分析

2.1 ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞核形態的影響

ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞核形態的影響情況見圖1。

圖1 ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞核形態的影響

圖1顯示，對照組細胞核核膜完整，染色均勻，呈現均勻的藍色熒光；與對照組相比，ALR組、3-MA組及ALR+3-MA組細胞核均呈現明亮的藍色熒光，說明細胞發生凋亡，且ALR+3-MA組細胞凋亡特征最明顯。說明抑制自噬可促進ALR誘導的人肝癌HepG2細胞凋亡。

2.2 ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞凋亡率的影響

ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞凋亡率的影響見圖2。由圖2可知，對照組細胞凋亡率為10.52%，ALR組凋亡率為18.17%，3-MA組凋亡率為18.83%，ALR+3-MA組凋亡率為22.15%。與對照組相比，ALR組、3-MA組及ALR+3-MA組細胞凋亡率明顯提高。與3-MA組相比，ALR+3-MA組細胞凋亡率明顯提高。說明抑制自噬可促進ALR誘導的人肝癌HepG2細胞凋亡。

圖2 ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞凋亡率的影響

2.3 ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞凋亡相關因子mRNA表達的影響

ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞凋亡相關因子mRNA表達的影響見圖3。由圖3可知，與對照組相比，ALR組JAK2、STAT3的mRNA表達被顯著抑制(P<0.05)；3-MA組JAK2的mRNA表達被顯著抑制(P<0.05)，STAT3的mRNA表達被極顯著抑制(P<0.01)；ALR+3-MA組JAK2、STAT3的mRNA表達被極顯著抑制(P<0.01)。與3-MA組相比，ALR+3-MA組JAK2、STAT3的mRNA表達被顯著抑制(P<0.05)。說明抑制細胞自噬的同時ALR可通過抑制JAK2/STAT3凋亡通路中JAK2、STAT3的mRNA表達促進細胞凋亡。

圖3 JAK2和STAT3 mRNA表達水平圖

2.4 ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞凋亡相關蛋白表達的影響

ALR結合3-MA對人肝癌HepG2細胞凋亡相關蛋白表達的影響見圖4和圖5。由圖4和圖5可知，與對照組相比，ALR組、3-MA組、ALR+3-MA組p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達被極顯著抑制(P<0.01)。與3-MA組相比，ALR+3-MA組p-JAK2的蛋白表達被極顯著抑制(P<0.01)，p-STAT3的蛋白表達被顯著抑制(P<0.05)。說明抑制細胞自噬的同時ALR可通過抑制p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達促進細胞凋亡。

圖4 p-JAK2和p-STAT3蛋白條帶圖

圖5 p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平圖

2.5 ALR結合AG490對人肝癌HepG2細胞自噬相關因子mRNA表達的影響

ALR結合AG490對人肝癌HepG2細胞自噬相關因子mRNA表達的影響見圖6。由圖6可知，與對照組相比，ALR組、AG490組、ALR+AG490組LC3的mRNA表達被極顯著促進(P<0.01)。與AG490組相比，ALR+AG490組LC3的mRNA表達被顯著促進(P<0.05)。說明促進細胞凋亡的同時ALR可通過促進LC3的mRNA表達促進細胞自噬。

圖6 LC3 mRNA表達水平圖

2.6 ALR結合AG490對人肝癌HepG2細胞自噬相關蛋白表達的影響

ALR結合AG490對人肝癌HepG2細胞自噬相關蛋白表達的影響見圖7和圖8。由圖7和圖8可知，與對照組相比，ALR組、ALR+AG490組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的蛋白表達被極顯著促進(P<0.01)；AG490組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的蛋白表達被顯著促進(P<0.05)。與AG490組相比，ALR+AG490組LC3-Ⅱ的蛋白表達被極顯著促進(P<0.01)。說明促進細胞凋亡的同時ALR可通過促進LC3-Ⅱ的蛋白表達促進細胞自噬。

圖7 LC3-Ⅱ蛋白條帶圖

圖8 LC3-Ⅱ 蛋白表達水平圖

3 討論與結論

3-MA是自噬抑制劑，可通過抑制Ⅲ型PI3K及干擾自噬隔離膜的形成抑制自噬。研究已證實，3-MA可能通過經抑制饑餓處理的腫瘤細胞自噬的發生，促進腫瘤細胞凋亡[8]。在某些腫瘤的治療中，3-MA與化療藥物合用亦能夠誘導細胞凋亡[9]。JAK2/STAT3信號通路是調節癌細胞增殖與凋亡的重要通路，癌細胞的發生發展與該通路的異常激活密切相關。膜受體被激活后，引起JAK2家族蛋白酶激化，促進p-JAK2因子與p-STAT3因子表達，最終抑制癌細胞凋亡。Wang等[10]認為，自噬通過激活JAK2/STAT3信號通路抑制肺癌細胞轉移。本試驗結果顯示，ALR結合3-MA可促進細胞核凋亡，提高細胞凋亡率，抑制JAK2/STAT3信號通路中凋亡因子p-JAK2、p-STAT3的mRNA及蛋白表達。說明抑制自噬可促進ALR誘導的人肝癌HepG2細胞凋亡。

AG490是JAK2/STAT3信號通路的特異性抑制劑，可通過阻斷JAK2特異位點上絲氨酸或酪氨酸的磷酸化而阻斷下游STAT3的磷酸化，起到促進細胞凋亡的作用[11-12]。有研究表明，阻斷JAK2后的癌細胞可通過激活自噬因子產生自噬[13]。LC3是自噬體膜上的標記蛋白，主要參與自噬體的形成。正常情況下LC3以I型的形式存在于細胞質中，當自噬激活時會轉化為LC3-II。LC3-II被認為是自噬標記物，在一定程度上反映了自噬體的數量[14-15]。余揚[16]證明AG490作用人惡性黑素瘤A357細胞72 h后，可促進LC3-II的蛋白表達。本試驗結果顯示，AG490可促進LC3的mRNA及LC3-II的蛋白表達，說明AG490可促進人肝癌HepG2細胞自噬。與AG490組相比，ALR結合AG490組可促進自噬因子LC3的mRNA及LC3-II的蛋白表達。說明促進凋亡可增強ALR誘導的人肝癌HepG2細胞自噬。

綜上所述，ALR可誘導人肝癌HepG2細胞發生凋亡和自噬，抑制自噬可促進ALR誘導的細胞凋亡，促進凋亡可增強ALR誘導的細胞自噬。此結論可為ALR的深度開發利用提供理論基礎。