基于牡荊素的綠豆大曲質量控制方法研究

譚利, 高廷會，王松濤，黃張君，李陽，沈才洪，國錦琳

馬王堆《十問》記載“酒者，五谷之精氣也…故以為百藥由?！薄稘h書·食貨志》：“酒為百藥之長”。藥酒同源，從馬王堆以來藥酒處方歷代傳承創新。近代以來，國內外許多機構開展酒精損害人體的實驗，但白酒不是酒精[1]，添加含有明確藥用價值的功效成分的養生保健酒也不再是傳統意義上的白酒。

綠豆為豆科植物綠豆（Phaseolus radiatusL.）的種子，又名青小豆、菉豆、植豆等，在歷代本草中記載綠豆能清熱，補益元氣，解酒食等?！侗静菥V目》記載：“綠豆，消腫治痘之功雖同于赤豆，而清熱解毒之力過之?？伞敖饨鹗?、砒霜、草木一切諸毒”[2]?！堕_寶本草》中記載綠豆：“主丹毒煩熱，風疹，熱氣奔豚，生研絞汁服。亦煮食，消腫下氣，壓熱解毒?！?《普濟方》記載綠豆能治癰腫瘡毒。清熱解毒，以消癰腫?？蓮V泛用于熱毒、瘡癰腫毒?，F代研究發現綠豆的主要生理活性成分為黃酮、多糖、多肽等[3-4]，有增強機體免疫功能、抗炎、抗腫瘤、保肝、利尿、抗氧化等作用[5-12]。

綠豆大曲是以綠豆為主的復方提取液制成的養生酒，具有潛在的保肝功效。綠豆保肝作用的主要生理活性成分是黃酮類成分，牡荊素是綠豆黃酮的主要成分，占比達到98%[13]，文獻報道牡荊素在綠豆粉末中檢測含量為1.04~1.71 mg﹒g-1[14]。養生酒的質量評價一般采用功效成分指標[15-18]，目前綠豆大曲尚未確定功效成分質控指標。本研究應用HPLC-MS/UVD篩選綠豆大曲中與綠豆提取液共有的黃酮成分，將其作為質控指標建立質控方法對綠豆大曲功效成分添加的一致性進行質量控制。

1 材料

1.1 材料與試劑

由瀘州老窖股份有限公司提供20批酒樣，A類酒樣（酒精度標示值41.8%vol）10批次（批號210101-210110），B類酒樣（酒精度標示值51.8%vol ）10批次（批號210101-210110）。

無水乙醇為分析純，購買自成都市科隆化學品有限公司。牡荊素（CAS號3681-93-4，批號17022705）購買自成都普菲德生物技術有限公司，對照品質量分數≥98%。乙腈、甲醇純度為色譜級，購買自Fisher公司，水為超純水。

1.2 儀器與設備

DHG-系列電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），SB-120DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），SIGMA 318-KS冷凍離心機（德國SIGMA公司），LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司），LC-MS-2020型單四極桿液質聯用儀（日本島津公司），ME204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），GM-1.0A 隔膜真空泵（天津津騰實驗設備有限公司）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取牡荊素約0.0010 g，60%乙醇定容至5 mL，配制0.20 mg﹒mL-1牡荊素標準溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精確稱取綠豆粉末2 g（精度至 0.1 mg）于50 mL離心管中，加入 60%乙醇 40 mL，超聲萃取 90 min，6000 r﹒min-1離心 10 min，溫度20 ℃，收集上清液；用60%乙醇定容至50 mL，得綠豆提取液；綠豆大曲和基酒樣本由瀘州老窖股份有限公司提供，不做其他處理，直接分析。

2.3 酒樣中牡荊素定性分析

2.3.1 色譜條件InfinityLab Poroshell 120 EC- C 18（4.6 mm×100 mm，2.7 Micron）色譜柱；以乙腈（A）和超純水（B）為流動相；梯度洗脫：0 ~ 10 min，5 ~ 20% A；10 ~ 15 min，20～40% A；15 ~ 25 min，40% A；25 ~ 50 min，40～100% A；50~ 60 min，100% A；60～60.1min，100～5%A。流速0.3 mL﹒min-1；柱溫40 ℃[19]。

2.3.2 質譜檢測采用LCMS-2020單四級桿液質聯用儀，采用選擇離子模式（SIM），選擇負離子模式，檢測離子m/z（-）431.0。霧化氣流量：1.5 L﹒min-1，干燥氣流量15 L﹒min-1。[20]

2.3.3 分析結果 由牡荊素標準溶液HPLC-UVD檢測色譜圖（圖1），可見牡荊素在該色譜條件下保留時間為16.3 min。HPLC-MS選擇離子模式（SIM）檢測綠豆提取液與綠豆大曲中的牡荊素分子離子m/z(-)431.0色譜圖（圖2）中在16.3 min處均有峰，說明兩樣品中均有牡荊素，牡荊素為綠豆提取液與綠豆大曲共有黃酮成分。

為明確酒樣中的牡荊素來源，比較了綠豆大曲與其配制基酒在上述相同條件分析的HPLC-UVD色譜圖（圖3），可見16.3 min處綠豆大曲色譜峰，該峰峰面積占比為52.2%，而基酒色譜圖無此峰，說明基酒中無牡荊素?？纱_定綠豆大曲中的牡荊素來源于綠豆復方提取液。因此，篩選出牡荊素作為對綠豆大曲中添加綠豆提取液一致性的質控指標。

2.4 酒樣中牡荊素含量測定

2.4.1 色譜條件同“2.3.1”。

2.4.2 紫外檢測采用LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津公司) ，紫外可見光檢測器，檢測波長300 nm；進樣量5 μL。

2.4.3 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于1 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線。配制成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg﹒mL-1系列濃度的標準溶液。按照“2.3.1”的色譜條件進行分析。以對照品濃度C（mg﹒mL-1）為橫坐標，以峰面積積分值A為縱坐標，經過回歸處理后得回歸方程為：A=2*107C-29818，R值為0.9996，線性范圍為0.02~0.12 mg﹒mL-1，表明在此濃度范圍內有良好的線性關系。

2.4.4 供試品溶液中牡荊素含量的測定 參照“2.3.1”和“2.4.2”的方法對瀘州老窖股份有限公司提供的20批酒樣進行測定，20批酒樣含量測定結果見表1。由表1可見兩類綠豆大曲中牡荊素濃度范圍為0.03~0.07mg﹒mL-1。

表1 綠豆大曲中牡荊素的濃度（mg﹒mL-1）

2.4.5 穩定性試驗 精密吸取同一份綠豆大曲溶液，在“2.3.1”色譜條件下，分別在0、2、4、8、16、24h進樣，記錄不同時間測得的牡荊素的峰面積。穩定性試驗計算得RSD值為2.59%，表明樣品在24 h內穩定性良好；

2.4.6 精密度試驗 精密吸取綠豆大曲供試品溶液，在“2.3.1”色譜條件下連續進樣6次，記錄牡荊素的峰面積。精密度試驗計算得RSD為2.43%，小于5%，表明儀器精密度良好；

2.4.7 重復性試驗 取同一批綠豆大曲制備6份樣品，在“2.3.1”色譜條件下測定，記錄牡荊素的峰面積，計算其質量分數。重復性試驗計算得RSD值為0.81%，證明方法重復性良好；

2.4.8 加樣回收率試驗 精密量取6份已知牡荊素含量的同一批綠豆大曲，每份0.50 mL，精密加入牡荊素對照品溶液0.15mL，混勻，按“2.3.1”的色譜條件測定峰面積，計算其回收率。加樣回收率試驗計算得牡荊素的平均回收率為103.8%，RSD為2.78%（n =6），符合要求。

表2 綠豆大曲酒樣加樣回收率實驗結果

2.3 數據統計方法

2.3.1 使用GraphPad Prism 9對兩批數據進行分析 采用Nested 作圖方式對兩批數據離散程度進行分析。繪制樣品牡荊素濃度分布圖（圖4），B類酒樣中存在異常值，認為異常值樣品不符合制訂一致性標準的樣品要求，因此將該樣品數據去掉后計算綠豆大曲兩類樣品牡荊素濃度均值分別為0.04 mg﹒mL-1和0.06 mg﹒mL-1。

2.3.2 使用SPSS 23.0對數據進行分析處理 采用獨立樣本T檢驗比較兩類酒樣牡荊素含量是否有顯著性差異。經SPSS分析P=0.003，以p<0.05判斷兩類酒樣牡荊素含量有顯著性差異，因此兩類酒樣需要分別制定質量控制標準。以符合一致性樣品牡荊素均值的80%為標準，制定指標值為A類酒樣牡荊素濃度不低于0.03mg﹒mL-1，B類酒樣牡荊素濃度不低于0.05 mg﹒mL-1。

3 討論與結論

在對黃酮類成分的檢測中，綠豆提取液除牡荊素之外，蕓香柚皮苷、山奈酚-3-O-葡萄糖甙、二氫槲皮素、蘆丁、葛根素等多種黃酮成分亦有檢出，但含量遠低于牡荊素，當綠豆提取液作為添加原料調制為綠豆大曲，僅有含量高的主要黃酮成分牡荊素能被檢出。同時，經檢測驗證，綠豆大曲中的牡荊素來源于綠豆提取液而非調配用基酒，因此選擇牡荊素作為質控指標。

常規酒樣用總酸、總酯、風味物質等進行質控，本文旨在從保健酒的功效成分篩選質控指標，突出保健酒的質控特點。綠豆大曲中添加的主要功效原料是綠豆，牡荊素是綠豆中主要黃酮類成分，在綠豆大曲的質量控制中采用牡荊素為化學成分指標具有定性和定量兩方面的意義，定性方面是確定在綠豆大曲中加入了以綠豆為原料的功效組分，確保綠豆大曲養生酒的基礎物質穩定；定量方面意義則是功效成分的加入濃度對產品的影響得到控制，以及有效成分含量在生產過程中得到保證。從此次測定結果能夠發現，以牡荊素含量來指控樣品酒的質量，能夠發現不同批次樣品酒中的異常值，反映了該指標能表征樣品間的不一致情況，說明了指標選擇的合理性。

根據此篇文章研究表明，原料明確的養生酒在選擇質控指標時，優先考慮從主要原料中選擇功效明確且含量較多的成分作為指標成分，這也為養生酒行業其他類產品制定質量標準提供了一定的思路與方法。

方法學考察結果顯示，樣品測定的穩定性、精密度、重復性等均是符合要求的，選擇HPLC-UVD測定綠豆大曲中的有效成分含量準確、快速。此次實驗不足之處，樣本量少，測出的結果僅供初步參考，整個產品的質量控制標準有待于進一步分析驗證。保健酒中來源于功效添加原料的主要功效成分可作為質控指標，為對產品功效添加一致性提供定性定量方法。