生脈飲中五味子醇乙在正常和心肌缺血模型大鼠中的藥物代謝動力學研究

楊苛，周瑋玲，劉心煜，張迎，樊瑜歆，胡慧玲，游宇

心肌缺血（Myocardial Ischemia）是由于心臟的血液灌流不足從而造成了心肌缺血缺氧，導致其不能維持心肌細胞進行正常工作狀態的一種病理現象，根據個人身體情況的不同會表現為心前區或胸骨后的疼痛、心律失?；蚝粑щy等癥狀[1]。心肌缺血屬于心血管疾病中的一種類型，最近公布的《中國心血管健康與疾病報告2020》發現，由于現代經濟水平的提高，人們的生活方式和生活標準也隨之發生變化，中國心血管疾病的患病人數逐年增長，并愈加傾向于年輕化和低齡化轉變[2]。

生脈飲為“益心復脈”的經典名方，全方由人參、麥冬和五味子三藥組成，一補一潤一斂，有滋陰補氣、潤肺清心、收斂固澀之效，在臨床上被廣泛用于治療各種心系疾病[3,4]?，F代藥理研究表明，生脈飲具有保護心肌細胞的作用，從而能夠改善心臟功能[3]。生脈飲能改善氣陰兩虛型心肌缺血病癥結合大鼠模型心肌的缺血狀況，從而保護心肌細胞[5]。對五味子抗心血管疾病的研究發現，抗氧化、抑制細胞凋亡、抗炎等是其主要機制[6]。而五味子醇乙作為五味子中的主要藥效成分，也具有很強的抗氧化[7]、抗細胞凋亡[8]、抗炎[9]等作用，但對其抗心肌缺血的研究較少。因此本實驗通過對大鼠尾靜脈注射垂體后葉素建立心肌缺血模型，灌胃生脈飲后，比較正常和心肌缺血大鼠五味子醇乙的藥物代謝動力學參數。

1 實驗材料

1.1 儀器與試藥

UltiMate 3000超快速液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；BL-420N生物信號分析系統（成都泰盟軟件有限公司）；電子天平；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；RG-160AT型臺式高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；干式氮吹儀（杭州瑞誠儀器有限公司）。

紅參、麥冬、五味子飲片均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，生產批號依次為2003105、2006071、2001087。五味子醇乙對照品（CHB190121）、地高辛對照品（CHB200514）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均>98%；垂體后葉素注射液（6 U﹒mL-1, 安徽宏業藥業有限公司，批號：191135）。

1.2 實驗動物

雄性健康SPF級SD大鼠（體重220±20 g），購自成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（川） 2015-30。

大鼠于溫度24～26 ℃、相對濕度55～75 %、12 h/12 h晝夜交替的適宜環境中適應性喂養一周，給予標準飼料與自由飲水。

2 實驗方法

2.1 生脈飲灌胃液的制備

按照生脈飲處方劑量稱取紅參25 g，麥冬50 g，五味子25 g，加水煎煮2次。第一次加8倍量水武火煎煮至微沸，再轉文火慢煎30 min，藥液濾過備用；第二次加6倍量水以同樣步驟煎煮30 min，過濾后與第一次濾液合并，濃縮至含原藥材1 g﹒mL-1的灌胃液。

2.2 內標溶液的制備

精密稱取一定量的地高辛對照品，用甲醇溶解，配制成1 mg﹒mL-1的內標母液，于4 ℃保存，臨用前稀釋成20 μg﹒mL-1的內標溶液。

2.3 標準溶液的配制

五味子醇乙對照品母液的配制：精密稱取一定量五味子醇乙對照品，用甲醇溶解，并定容于25mL容量瓶中，得到各對照品儲備液（1 mg﹒mL-1），‐4℃保存。

五味子醇乙的標準曲線樣品的配制：取一定量五味子醇乙對照品母液，用大鼠空白血漿將其稀釋，得到不同濃度的標準品溶液（25.0、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 μg﹒L-1）。同時，用大鼠空白血漿稀釋制備得到高、中、低濃度為20.00、5.00、0.625 μg﹒L-1的質控工作液，‐80 ℃保存待用。

2.4 急性心肌缺血模型制備

2.4.1 正常心功能大鼠篩選 SD大鼠腹腔注射10%

水合氯醛溶液(0.38ml﹒kg-1)，麻醉后連接BL-420N生物機能實驗系統，平衡后以大鼠心電圖ST段未見異常（<0.1 mV），J點（QRS波群與ST段交界處后20 ms左右）明顯，心律整齊為特征，剔除心電圖異常者。

2.4.2 動物分組與急性心肌缺血大鼠模型制備 將篩選出的12只正常心功能大鼠隨機分成實驗組和對照組，每組6只，實驗組尾靜脈勻速注射垂體后葉素2.00 U﹒kg-1（3 U﹒mL-1），對照組尾靜脈勻速注射生理鹽水0.66 mL﹒kg-1，記錄注射后1、3、5、10、15、30分鐘時的心電圖，以ST水平下降或抬高幅度值大于0.10 mV且T波下降值大于50 %雙向、倒置、拉直線為造模成功的判斷指標。

2.5 給藥方案及血液樣品收集

實驗組和對照組大鼠在灌胃前，禁食不禁水12 h，在造模給藥結束后30 min，實驗組和對照組大鼠口服灌胃給予1 g﹒mL-1生脈飲灌胃液（10 g﹒kg-1），給藥前0 h和給藥后0.083，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，4.0，8.0，12.0，24.0 h進行尾靜脈采血0.3 ml，置1.5 mL肝素化離心管中，離心（4 ℃，12000 rpm，10 min），取上清液，‐80 ℃保存。

2.6 血漿樣品處理

精密吸取2.2.5項下血漿100 μL，加入20 .0 μL地高辛內標液（20 μg﹒L-1），先加入100.0 μL甲醇沉淀蛋白質，再加入1.0 mL乙酸乙酯，2000 r﹒min-1渦旋萃取3 min，12000 r﹒min-1離心10 min，吸取上清液37 ℃氮氣吹干，殘留物以50.0 μL甲醇復溶，取上清液進樣分析。

2.7 色譜條件

流動相為0.1 %甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～2 min，23 %B；2～4 min，23 %～35%B；4～8 min，35 %～60 %B；8～15 min，80%～90 %B）；流速0.8 mL﹒min-1；進樣量為8.0 μL；柱溫35 ℃；檢測波長為203 nm。

表1 洗脫程序

3 實驗結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 專屬性 在選定的條件下，分別取空白大鼠血漿、空白大鼠血漿＋五味子醇乙、灌胃后1 h血漿樣品，通過對比分析得出血漿中的內源性成分和待測成分不會相互影響，專屬性良好。

3.1.2 標準曲線和定量下限 取不同濃度的五味子醇乙標準品溶液，以五味子醇乙的理論濃度為橫坐標，五味子峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，進行線性回歸擬合，得到五味子醇乙的標準曲線線性回歸方程。擬合出的五味子醇乙標準曲線：Y=0.1676+0.1224（R2=0.994），在線性范圍0.39～25 μg﹒L-1內線性關系良好，該方法下的定量下限LLQQ為0.39 μg﹒L-1。

3.1.3 精密度和準確度 取高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 g﹒mL-1）五味子醇乙QC樣品，每個濃度平行制備5份，每個樣品在一天內重復測定三次，計算日內（Intra-day）的精密度和準確度；再同一時間連續三天重復測定，相同方法計算日間（Inter-day）的精密度和準確度。五味子醇乙的日內和日間的精密度RSD范圍為10.85～15.08%，五味子醇乙的日內和日間的準確度RE均小于7.79 %，表明該方法測定精密度和準確度良好。

3.1.4 穩定性 血漿樣品中五味子醇乙的穩定性采用以下方法來驗證：高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 μg﹒L-1）五味子醇乙QC樣品分別在室溫下放置12 h、‐80 ℃下凍存5天以及‐20 ℃反復凍融5次，通過以上三種不同的儲藏條件，驗證該方法血漿樣品中五味子醇乙的穩定性。

高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 μg﹒mL-1）五味子醇乙QC樣品分別在室溫下放置12 h、‐80 ℃下凍存5天以及‐20 ℃反復凍融5次的準確度范圍為91.64～108.88 %，表明該方法的穩定性良好。

3.1.5 回收率 取高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 g﹒mL-1）五味子醇乙QC樣品，每個濃度平行制備5份，根據內標法計算出實際濃度，實際濃度與理論濃度的比值即為回收率。五味子醇乙在高、中、低三個QC樣品濃度下（20.00、5.00、0.625 μg﹒mL-1）回收率分別為101.36±12.20 %、102.91±12.19 %和113.71±7.69 %，其回收率均大于80%且小于120%，表明此方法回收率良好。

3.1.6 基質效應 取高、中、低濃度（20、5、0.625 g﹒mL-1）五味子醇乙QC樣品，每個濃度平行制備5份，得到含有大鼠空白血漿基質的峰面積A；同時利用蒸餾水代替大鼠空白血漿，按照相同方法，制備不含有大鼠空白血漿的高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 g﹒mL-1）五味子醇乙樣品，每個濃度平行制備5份，進樣分析，得到不含大鼠空白血漿基質的峰面積B。

根據上述方法得到的色譜峰面積，計算基質效應因子（matrix infactor, MF）：基質效應因子=峰面積A/峰面積B；內標歸一的MF=五味子醇乙的MF/內標的MF

結果表明，在本試驗條件下，內標歸一化的MF的變異系數均小于15 %，說明該方法符合生物樣品定量分析方法驗證指導原則，基質對于實驗樣品中化學成分的測定沒有影響。

3.1.7 血漿中殘留評價 取標準曲線最高濃度樣品（25 μg﹒L-1），與50 %A流動相和50 %B流動相制備的空白樣品交叉連續進樣6次，記錄峰面積，評估五味子醇乙在色譜柱中殘留行為。結果顯示，五味子醇乙和內標血漿樣品在該方法中殘留低，不影響樣品色譜峰，實驗方法符合生物樣品定量分析方法驗證指導原則。

3.2 藥代動力學結果

3.2.1 五味子醇乙藥代動力學研究結果 五味子醇乙在心肌缺血模型和正常大鼠血漿中的血藥-濃度曲線圖如圖2所示，從圖可以看出，在灌胃給予生脈飲后，模型組與對照組相比血漿中五味子醇乙的最大濃度更高，吸收較快，藥時曲線面積更大。

通過PKSolver 2.0統計軟件進行藥代動力學擬合計算，五味子醇乙在大鼠體內的代謝過程符合非房室模型，相關藥動學參數如表2所示。結果顯示心肌缺血大鼠與正常大鼠相比較Cmax、AUC (0-inf)、MRT (0-inf)、Vz/F增大，而Cl/F減小。

表2 模型組和對照組五味子醇乙的藥代動力學參數(x±S, n=6)

4 討論

隨著對心肌缺血病因、發病機制等研究的深入，心肌缺血模型建立方法以及評價指標逐步完善，心肌缺血模型可分為：急性心肌缺血模型、慢性心肌缺血模型、可控性心肌缺血模型和離體心肌缺血模型[1]。急性心肌缺血模型是基于臨床心肌缺血特點而建立的一種短期的實驗模型，一般通過手術或者藥物進行造模。但手術造模存在操作要求高，且易造成動物死亡的問題。因此本實驗采用尾靜脈注射垂體后葉素進行藥物造模，垂體后葉素可引起冠狀動脈痙攣，血管外周阻力增大，心肌細胞的負荷增加，從而出現心機供血不足造成心肌缺血，該方法的操作簡便有效且比較接近人心絞痛的病理狀態[10]。垂體后葉素制備心肌缺血模型時的劑量通常為0.6-1.5 U﹒kg-1[11、12]，但預實驗采用1.0 U﹒kg-1劑量制備時，發現大鼠維持心肌缺血的心電圖表現時間較短，不能達到實驗要求，因此正式實驗采用2.0 U﹒kg-1[13]垂體后葉素制備心肌缺血大鼠模型，心電圖的各段指標符合心肌缺血大鼠模型的要求，認為建模成功。

運用PKSolver 2.0處理五味子醇乙的血藥濃度，擬合得到五味子醇乙在大鼠體內的過程符合非房室模型，通過比較正常組和模型組大鼠，五味子醇乙在心肌缺血模型大鼠的Cmax、AUC (0-inf)、MRT(0-inf)、Vz/F增大，而Cl/F減小，說明五味子醇乙在心肌缺血大鼠中吸收度好、體內滯留時間長，清除率小，更說明了生脈飲在治療心肌缺血方面的合理性，符合臨床上使用生脈飲用于治療心系疾病。