基于網絡藥理學研究寬筋藤治療特異性皮炎的作用機制

龔娟，楊華，唐雪勇，戚東衛

特異性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一種常見的慢性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，表現為炎性、滲出性皮損、苔蘚化及皮膚干燥，部分患者病情遷延終生嚴重影響患者生活質量[1]。AD發病于各個年齡段，常見于嬰兒、青少年以及成年人，多發于嬰幼兒。30%的兒童與8%的成年AD患者常伴有焦慮、睡眠障礙以及抑郁，對其生活質量造成要重影響[2]。高昂的醫療費用、患者生活質量的下降以及一定的死亡率使AD成為了一個全球性的健康問題。相關研究表明：遺傳、環境、皮膚屏障破壞以及免疫功能障礙是目前AD公認的病因[3]。近年來，隨著研究的不斷深入發現AD發病與Th1/Th2失衡密切相關[4]。

寬筋藤（Tinospora sinensis (Lour.) Merr.），別名松根藤、大松身、中華青牛膽以及牛掙藤等，是防己科青牛膽屬植物中華青牛膽的藤莖，主產于西藏、四川云南以及兩廣地區，其藥用部位為藤莖，全年均可采收，其味苦、性涼，歸肝經，具有舒筋活絡，祛風止痛之效，在臨床上主要用于治療類風濕性關節炎、坐骨神經痛、骨折等[5]。寬筋藤最早出現在清代的《生草藥性備要》，書中記載：“一名火炭葛”。在《陸川本草》中曰：“一名青寬筋藤，一名四方藤”，書中首次出現寬筋藤藥名。民國的《嶺南采藥錄》曰：“…酒浸舒經絡…治氣節疼痛…”，該書對其功效有較為詳細描述?，F代藥理學研究表明：寬筋藤具有抗寄生蟲、抗輻射、抗炎、鎮痛、抗氧化、保肝、調節免疫等作用，在臨床上廣泛用于風濕關節炎、腰腿疼痛，關節僵硬，骨折等[6-8]。寬筋藤是重慶市中醫院皮膚科協定處方抗炎2號的主要藥物之一，在臨床上廣泛用于AD的治療，月使用量在1000副以上，收獲較為理想的治療效果?，F代植化研究結果提示：生物堿、黃酮、木脂素、苯丙素、倍半萜及二萜、酚苷等是其主要的化學成分[9,10]。然而，寬筋藤藥效物質基礎以及藥理學分子作用機制仍有待進一步研究。中藥的多成分、多靶點、低選擇及協同作用是中藥藥理研究面臨的最大難題，網絡藥理學通過計算機的強大運算能力，結合藥學、系統生物學及多層次網絡分析的新技術，以小分子化合物、靶點、信號通路等多角度著手，能夠有效預測中藥的有效成分與作用靶點，闡釋中藥的作用機制[11]。網絡藥理學在中藥研究中已經凸顯出具有獨特的優勢以及較大的潛力。本研究采用網絡藥理學方法研究寬筋藤治療AD的藥效物質基礎與分子機制，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 活性成分的篩選

以“寬筋藤”為關鍵詞檢索中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以及BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batmantcm/），收集寬筋藤的有效成分及靶點。以生物利用度（oral bioavailability，OB），類藥性（drug-like）分別大于等于30%，0.18，并適當補充文獻中發現的新化合物。

1.2 AD相關聯靶點的獲得

通過疾病數據庫（GenneCaeds，OMIM）查找與“特異性皮炎”（Atopic dermatitis，AD）具有密切聯系的基因，獲得與AD相關的基因。

1.3 活性小分子---靶點的網絡構建

將收集到的寬筋藤活性小分子靶點及AD相關靶點交集,獲取潛在寬筋藤治療AD的靶點。梳理“寬筋藤-活性小分子-靶點-AD”的相關信息，使用Cytoscape 3.7.0軟件獲得“寬筋藤-活性小分子-靶點-AD”網絡。使用插件（network analyzer）分析“活性小分子-靶點-網絡圖”。在構建好的網絡中，活性小分子、靶點及通路使用節點（node）表示。某一些基因為某個活性小分子的潛在作用靶點，則用邊（edge）相連接表示。

1.4 構建蛋白互作網絡

為了闡明寬筋藤治療AD潛在靶基因的相互作用，把1.3項下獲得的交集靶點輸入STRING（https://string-db.org/）平臺構建構建蛋白互作網絡（Proteinprotein-interaction，PPI），把最低互作閾值設為中等，其它參數保持不變。把構建好的PPI導入Cytoscape 3.7.0軟件,使用network analyzer插件進行功能分析,確定寬筋藤治療AD的關鍵基因。

1.5 功能分析

運用Bioconductor軟件及R語言進行寬筋藤治療AD的GO富集分析以及KEGG信號通路富集分析。

2 實驗結果

2.1 寬筋藤有效成分及其靶點篩選

通過TCMSP，BATMAN-TCM數據庫，以及文獻分析，篩選獲得符合1.1項下12個有效成分（quercetin，rutin，prolinum，DTY，tinosineside B，tinosinen，syringaresinol，dimethoxyglucopyranoside，benzyl Oglucopyranoside，cycloIleAla，cycloValTyr），同時獲取了這些化合物靶點228個。

2.2 AD靶點的獲取以及互作網絡構建

通過GenneCaeds，OMIM疾病數據庫查找與AD具有密切聯系的基因，篩選出2301個基因。使用R語言將寬筋藤12個活性小分子的228靶點與AD疾病相關的2301個基因交聯，獲得寬筋藤有效成分治療AD的潛在靶點，結果通過Venn圖表示，如圖1所示，結果顯示共有113個靶點重合。將寬筋藤活性小分子靶點及AD疾病相關靶點輸入STRING數據區，將收集到的寬筋藤活性小分子靶點及AD相關靶點交集，獲取潛在寬筋藤治療AD的靶點。梳理“寬筋藤-活性小分子-靶點-AD”的相關信息，使用Cytoscape 3.7.0軟件獲得“寬筋藤-活性小分子-靶點-AD”網絡。使用network analyzer分析“活性小分子-靶點-網絡圖”，結果見圖2。

2.3 構建PPI網絡

把1.2項下Venn圖中小分子---靶點與疾病靶點重合的交集中的113個基因，錄入STRING蛋白相互作用數據庫中，研究這些主要靶點之間的相互作用關系，并篩選主要的靶點信息。把STRING數據庫中得到的蛋白互作信息輸入Cytoscape 3.7.0軟件，構建PPI網絡模型，如圖3所示。隨后對PPI網絡進行可視化以及拓撲分析得到30個核心靶點，它們分別是IL6，ALB，INS，VEGFA，AKT1，MMP9，IL1B，CXCL8，IL10，PTGS2，JUN，CCL2，ICAM1，CASP3，MAOK1，EGFR，MMP2，MYC，SRC，ESR1，IL2，VCAM1，CAT，HMOX1，MPO，ANXA5，CRP，IFNG，RELA，MMP1。這些靶基因相互作用較為緊密，在網絡中起到了關鍵作用，詳見圖 4.

2.4 GO功能富集分析

對寬筋藤的30個核心藥效靶點進行GO功能富集分析，發現細胞因子活性、細胞因子受體、蛋白激酶、蛋白磷酸化以及抗氧化活性主要參與了其生物學進程。生物進程包括了20條（圖5A，B），包括cytokine receptor binding，cofactor biding，receptor ligand activity，receptor regulator activity，cell adhesion molecule binding，protein heterodimerizationactivity，endopeptidase activity，integrin binding，cytokine activity，heme binding，tetrapyrrole binding，phosphatase binding，protease binding，growth factor binding，growth factor receptorbinding，protein phosphatase binding，serine-type endopeptidase activity，oxidoreductase activity，antioxidant activity，transmembrance receptor protein kinase activity。

2.5 寬筋藤治療AD的KEGG通路分析

將對寬筋藤的30個核心藥效靶點導入數據庫，進行KEGG通路分析。通過對交集靶點分析得到20條KEGG通路（圖6 A，B），這些通路之間聯系較為密切，并且每條KEGG通路均有多個靶點富集。AGE---RAGE signal pathway，Fluid shear stress and atherosclerosis，IL-17 signal pathway，TNF signal pathway，Chagas disease，C-type lectin receptor signaling pathway，Relaxin signaling pathway，Hepatitis B，Malaitis，Prostate cancer，Kaposi sarcoma-associated herpersvirus inferction，Bladder cancer，Leishmaniasis，Ⅰnfluenza A，Toll-like receptor signaling pathway，Th17 cell differentiation，Osteoclast differentiation，Proteglycans incancer，Tuberculosis，Toxoplasmosis。

3 討論

目前，AD被認為是一種易復發的炎癥性皮膚病，對患者生活質量造成了較大的影響?，F階段AD治療藥物有局部以及口服藥物，主要包括糖皮質激素、鈣調磷酸酶抑制劑與免疫抑制劑[12]。糖皮質激素主要用于治療中重度AD，與口服糖皮質激素相比，糖皮質激素軟膏可有效的緩解AD相關癥狀，并能獲得更高的安全性及有效性。與此同時，免疫抑制劑也收獲了較為理想的療效[13]。然而，糖皮質激素與免疫抑制劑造成了許多副作用以及耐藥性問題。因此，副作用更小的治療方案對提高AD患者的生活質量尤為重要。目前，中醫藥在在AD治療上擁有一定的優勢。多成分、多靶點、多通路是中藥發揮治療作用的重要特征，因此，這給闡釋中藥作用機制帶來了許多困難。網絡藥理學是一種基于組學與系統生物學的技術，對系統全面闡釋中藥作用機制有較大的幫助。

本研究通過TCMSP，BATMAN-TCM數據庫以及文獻挖掘查找了寬筋藤的活性成分以及潛在作用靶點，并使用GeneCards，OMIM數據庫查找了AD疾病相關靶點，通過R語言將寬筋藤的活性成分潛在作用靶點與AD疾病關聯靶點取交集，共發現113個交集靶點因子。將獲得的113個交集靶點輸入STRING數據庫，使用Cytoscape 3.7.0軟件繪制PPI網絡。對PPI網絡進行可視化以及拓撲分析得到30個寬筋藤治療AD的核心靶點。對這30個主要靶點分析發現細胞因子（IL-1B，IL-2，IL6和IL-10）主要參與了寬筋藤治療AD。然而，AD現在被認為是Th2/Th1細胞失衡引起疾病，在AD急性發病期Th2細胞激活，Th2向Th1轉變發生在AD的慢性期[14]。IL-4，IL-5，IL-10，IL-15，IL-15以及IL-25與急性期Th2細胞密切相關， IL-2，ⅠFN‐γ與AD慢性期Th1細胞密切相關。與此同時，研究者認為IL-4，IL-5，IL-10，TNF‐α，IL-1B和IgE與AD進程具有密切關系。本研究結果提示寬筋藤可能通過調控IL-1B，IL-2，IL6和IL10等細胞因子治療AD。這些結果表明寬筋藤可能通過調控Th2/Th1細胞失衡發揮其治療作用。同時，CCL2，CXCL8等參與T淋巴細胞募集到炎癥部位[15]，本研究結果表明寬筋藤可能調節CCL2，CXCL8等趨化因子招募T淋巴細胞到炎癥部位調節局部炎癥。INS，VEGFA，AKT1，MMP9，JUN，MAPK1，EGFR，MMP2，IFNG等靶點均參與了調控趨化因子（CCL2，CXCL8）以及細胞因子表達（IL-1B，IL-2，IL6和IL10）。因此，這些富集到的核心靶點初步構成了寬筋藤的藥效作用網絡。GO功能富集分析表明細胞因子活性、細胞因子受體、蛋白激酶、蛋白磷酸化以及抗氧化活性主要參與了寬筋藤治療AD的生物進程。對KEGG通路富集結果分析表明寬筋藤最有可能通過調控AGE---RAGE signal pathway，IL-17 signal pathway，Toll-like receptor signaling pathway，Th17 cell differentiation，發揮其治療作用。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法闡釋寬筋藤治療AD的潛在作用機制，闡述了寬筋藤多成分與多靶點的復雜網絡相互作用關系，為進一步開展寬筋藤治療AD的實驗研究以及為其臨川應用提供了理論依據。