血IL-35、IL-17和Th17/Treg在特發性膜性腎病中的表達及其意義

白運煥　鄧娜　王涵　王濤　陳葶　陳茂杰

[摘要] 目的 檢測特發性膜性腎?。↖MN）患者外周血白細胞介素-35（IL-35）、白細胞介素-17（IL-17）濃度及Th17/Treg比值，探討其在IMN發生發展中的作用及意義。方法? 選擇2018年8月至2020年3月于江蘇省徐州市中心醫院腎內科住院初診未經治療的特發性膜性腎病患者60例作為IMN組，按KDIGO指南分為低、中、高風險組;另選取健康者20名作為對照組。收集一般臨床資料和生化數據、24 h尿蛋白定量（24 h Upro）、流式細胞儀檢測外周血Th17與Treg、ELISA方法檢測血漿中的IL-35、IL-17。IL-35、IL-17、Th17/Treg作因變量，ALB、BUN、Cr、24 h Upro作自變量進行相關分析。結果? ①IMN組的血清IL-35水平低于對照組，且IMN組中，高風險組<中風險組<低風險組（P<0.05）;與IL-17、Th17/Treg、24 h Upro、Cr、BUN呈負相關（P<0.05），與ALB呈正相關（P<0.01）。②IMN組的血清IL-17水平、Th17/Treg均高于對照組，且IMN組中，高風險組>中風險組>低風險組（P<0.05）;與24 h Upro均呈正相關（P<0.05），與ALB均呈負相關（P<0.05）。結論? 在特發性膜性腎病中Th17/Treg表達失衡，傾向Th17，IL-17水平隨病情加重而升高，IL-35水平隨病情加重而下降，提示特發性膜性腎病在病情進展中促炎因子表達增強而抗炎因子表達減弱。

[關鍵詞] 特發性膜性腎病;IL-35;IL-17;Th17/Treg

[中圖分類號] R692? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）15-0008-04

Expression and significance of blood IL-35， IL-17 and Th17/Treg in idiopathic membranous nephropathy

BAI Yunhuan DENG Na WANG Han WANG Tao CHEN Ting CHEN Maojie

Department of Nephrology， Xuzhou Central Hospital in Jiangsu Province， Xuzhou 221000， China

[Abstract] Objective To detect the concentration of interleukin 35 （IL-35） and interleukin 17 （IL-17） and the ratio of Th17/Treg in peripheral blood of patients with idiopathic membranous nephropathy （IMN）， and to explore their roles and significance in the occurrence and development of IMN. Methods A total of 60 patients with initial diagnosed untreated idiopathic membranous nephropathy hospitalized in the Department of Nephrology of Xuzhou Central Hospital in Jiangsu Province from August 2018 to March 2020 were selected as the IMN group. They were divided into the low-risk group， the medium-risk group， and the high-risk group according to the KDIGO guideline. Another 20 healthy people were selected as the control group. The general clinical data， biochemical data， and 24-hour urine protein quantification （24 h Upro） were collected. Flow cytometry was used to detect Th17 and Treg in peripheral blood. ELISA method was used to detect IL-35 and IL-17 in plasma. The IL-35， IL-17， and Th17/Treg were used as dependent variables， and ALB， BUN， Cr， and 24 h Upro were used as independent variables for correlation analysis. Results ①The serum IL-35 level in the IMN group was lower than that in the control group， and the serum IL-35 level in the high-risk group was lower than that in the middle-risk group， and the serum IL-35 level in the middle-risk group was lower than that in the low-risk group （P<0.05）. The serum IL-35 level was negatively correlated with IL-17， Th17/Treg， 24 h Upro， Cr， and BUN （P<0.05）， and positively correlated with ALB （P<0.01）. ②The serum IL-17 level and Th17/Treg in the IMN group were higher than those in the control group， and the serum IL-17 level and Th17/Treg in the high-risk group were higher than those in the middle-risk group， and the serum IL-17 level and Th17/Treg in the middle-risk group were higher than those in the low-risk group （P<0.05）. The serum IL-17 level and Th17/Treg were positively correlated with 24 h Upro （P<0.05）， and negatively correlated with ALB （P<0.05）. Conclusion Th17/Treg expression is unbalanced in idiopathic membranous nephropathy. With the severity of the disease， Th17 and IL-17 levels increase， and IL-35 level decreases， suggesting that with the progression of idiopathic membranous nephropathy， the expression of pro-inflammatory factors is enhanced while the expression of anti-inflammatory factors is weakened.7CEC5C62-5815-494D-9E31-8D6FFC5082D0

[Key words] Idiopathic membranous nephropathy; IL-35; IL-17; Th17/Treg

特發性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）以腎小球基底膜上皮細胞下彌漫的免疫復合物沉積伴基底膜彌漫增厚為病理特點，是免疫介導的腎臟炎性病變，輔助性Th17細胞（Th17）和調節性T細胞（Treg）參與特發性膜性腎病發病，Th17/Treg二者失衡與其病情嚴重程度相關，外周血Treg、Th17含量變化對病情評估及臨床療效有重要意義[1-2]。白細胞介素-17（interleukin17，IL-17）是Th17分泌的具有激活、介導參與炎癥反應的細胞因子，在IMN的發生發展中起到重要作用。白細胞介素-35（interleukin 35，IL-35）是Treg分泌的免疫抑制性細胞因子[3]，是感染、腫瘤、免疫性疾病研究的熱點。目前，IL-17、TH17/Treg的變化及IL-35的表達在IMN尚未見報道。本研究通過檢測尚未接受治療的IMN患者外周血中的IL-35、IL-17表達水平及Th17/Treg比值變化，觀察其在IMN發生發展中的作用，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

選擇2018年8月至2020年3月江蘇省徐州市中心醫院腎內科收治的患者60例作為IMN組。其中男36例，女24例;平均年齡（57.11±2.21）歲。納入標準：①腎穿刺病理診斷為特發性膜性腎病。②受試前未接受過糖皮質激素、免疫抑制劑及細胞毒類藥物治療。③按2021年KDIGO指南IMN危險程度分級分組[4]：低風險組：eGFR正常，蛋白尿<3.5 g/d和（或）血清白蛋白>30 g/L;中風險組：eGFR正常，蛋白尿>4 g/24 h，但<8 g/24 h，血清抗磷脂酶A2受體抗體（PLA2R-Ab）<50 RU/ml;高風險組：eGFR<60 ml/min/1.73 m²，蛋白尿>8 g/24 h，PLA2R-Ab>150 RU/ml。排除標準：①患有病毒肝炎、系統性紅斑狼瘡、血液及實體腫瘤等引起的繼發性膜性腎病者;②嚴重腎功能不全者;③有糖尿病、高血壓病、心腦血管疾病等慢性病史者;④存在嚴重感染者。另選取20名健康者作為對照組，排除重要臟器疾病、感染、免疫性疾病及惡性腫瘤等。其中男10例、女10例，平均年齡（51.42±2.76）歲。

1.2 方法

①收集患者一般資料，抽取靜脈血用全自動生化分析儀（購自德國羅氏公司）測定白蛋白（ALB），總膽固醇（TC），甘油三酯（TG），血肌酐（Scr），尿素氮（BUN），24 h尿蛋白定量（24 h Upro），計算估計腎小球濾過率[eGFR（ml/min）];外送廣州金域檢驗公司檢測血清抗磷脂酶A2受體抗體（PLA2R-Ab）滴度。②細胞因子檢測：南京貝斯特生物科技有限公司提供的試劑盒，血漿細胞因子IL-35、IL-17檢測采用酶聯免疫吸附法測定，嚴格按照說明書進行操作。③Th17、Treg細胞流式檢測：細胞儀從美國BD公司購買，檢測外周血Th17與Treg比值。④以IL-35、IL-17及Th17/Treg作因變量，ALB、24 h Upro、肌酐（SCr），尿素氮（BUN）作自變量進行相關分析。

1.3 統計學方法

應用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或t檢驗，兩因素相關分析采用Spe-arman相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

與對照組比較，IMN組的ALB、eGFR、IL-35水平均較低，SCr、IL-17、24 h Upro、PLA2R-Ab（陽性率）均較高，大部分患者表現為有低白蛋白（<30 g/L），高脂血癥，大量蛋白尿（>3.5 g/24 h），符合腎病綜合征的診斷標準，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2.2 IMN組不同危險分層與對照組的IL-35、IL-17和Th17/Treg水平比較

與對照組比較，IMN組的IL-17、Th17/Treg水平均較高，IL-35水平較低，差異有統計學意義（P<0.05）;且IMN組中，隨著危險級別的增加，IL-17、Th17/Treg水平越高，IL-35水平越低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 IMN組的IL-35與IL-17、Th17/Treg相關關系

IMN組患者的血清IL-35與IL-17（r=-0.812，P<0.05）、Th17/Treg（r=-0.487，P<0.01）均呈負相關。

2.4 IL-35與相關指標相關分析

IL-35與ALB呈正相關，與24 h Upro、Cr、BUN呈明顯的負相關;IL-17與ALB呈負相關，與24 h Upro呈正相關，與Cr、BUN無明顯的相關關系;Th17/Treg與ALB呈負相關，與24 h Upro呈正相關，與Cr、BUN無明顯的相關關系。見表3。

3 討論

Th17和Treg細胞由初始的CD4⁺的T細胞分化而來。Th17細胞分泌IL-17、IL-23、IL-6等多種促炎因子。其中IL-17能與多種細胞如內皮細胞、上皮細胞、造血細胞等表面的IL-17受體結合，產生炎癥趨化因子，聚集中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞發生炎癥反應而導致組織損傷。在腎臟病體外研究中，發現IL-17可誘導腎小管上皮細胞和內皮細胞表達下游促炎因子如IL-1β、TNF-α和單核細胞趨化蛋白-1，還能與這些細胞因子協同作用，以促進腎臟免疫炎癥和導致腎小球硬化的發生發展，同時IL-17可通過上調細胞間黏附分子-1的表達，激活腎臟局部的Th17細胞，進而加重腎臟病理損傷[5-6]。這些改變在臨床研究中得到驗證，成人原發性腎病綜合征患者與對照組相比，IL-17水平明顯更高，經治療后IL-17水平較治療前明顯降低（P<0.05）[7]。在兒童腎病綜合征患者中也顯示同樣結果[8]。IL-35是Treg細胞分泌的抗炎因子，2007年Collison等首次報道其分子結構，是由α鏈p35和β鏈EB病毒誘導基因3（EBI3）組成的異源二聚體蛋白，是IL-12家族新成員。研究表明，IL-35在自身免疫性疾病、腫瘤和傳染性疾病中起重要作用[9-10]。IL-35至少有四種生物學作用：①抑制T細胞增殖;②將幼稚T細胞轉化為誘導型調節性T細胞（iTr35）增強免疫調控能力;③下調Th17細胞功能，減輕炎癥反應;④將Breg細胞轉化為產生IL-35和IL-10的Breg亞群，增加抗炎作用。IL-35在腎臟病方面的研究偶有報道，相關研究發現狼瘡性腎炎（LN）患者血清IL-35水平減低而IL-17水平升高[11]。IL-35水平與尿蛋白定量和血肌酐呈負相關，和腎小球濾過率呈正相關?？寡滓蜃拥慕档投卵滓蜃拥纳邔е履I臟病變加重。Roccatello等[12]統計發現利妥昔單抗治療IMN緩解患者的Treg細胞，12個月后可升至基線值的10倍，抗磷脂酶A2受體抗體（PLA2R-Ab）陽性者比陰性者更低，經治療后PLA2R-Ab陽性者IL-35的血清水平與基線水平相比顯著升高，該作者認為Tregs和IL-35水平可作為IMN患者對RTX反應的預測指標。大量資料顯示Th17/Treg二者之間存在動態平衡。一旦失衡則產生病理狀態。有眾多的文獻報道Th17在IMN患者中的百分比高于健康志愿者，而Treg低于健康志愿者，且病情越嚴重，Th17/Treg越向Th17偏移，提示高水平Th17/Treg與IMN發病及病情有關[13]。IMN中Treg細胞的抑制受損[14]，自身免疫耐受能力下降，最終導致IL-35等抗炎因子的降低而促炎因子的升高加重腎臟病變。7CEC5C62-5815-494D-9E31-8D6FFC5082D0

本研究觀察初次診斷尚未治療IMN患者，結果顯示：Th17/Treg比值較正常對照組明顯升高，IMN患者中Th17和IL-17與ALB呈負相關，與24 h Upro呈正相關關系;Treg和IL-35與ALB呈正相關關系，與24 h Upro、Cr、BUN呈明顯的負相關，結果顯示與以上文獻報道一致。PLA2R-Ab是診斷特發性膜性腎病、判斷疾病嚴重程度、指導治療、判斷預后的重要指標，膜性腎病危險分級越高，提示腎臟炎癥反應越重[4]，IL-35水平是重要的免疫抑制因子，病情越重水平越低，提示危險分層越高，IL-35水平越低，既往無該方面的研究，本研究設想對不同分組的IL-35比較，證實不同危險分層，IL-35水平不同，結果顯示，IMN患者高風險組的IL-17、Th17/Treg較中風險組高，中風險組較低風險組高;高風險組的IL-35水平較中風險組低，中風險組較低風險組低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果提示隨著IMN病情進展風險的增加，Th17細胞占據優勢，炎癥因子分泌增多;而Treg細胞數量減少使抗炎因子降低，二者失衡導致IMN的進展，調整二者的平衡至關重要[15]。但本文觀察的病例數有限，還需進一步擴大樣本量加以驗證，可望加深對IMN發病原理的認識同時發現更多的治療靶點。

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（收稿日期：2021-10-21）7CEC5C62-5815-494D-9E31-8D6FFC5082D0