垂直森林綠化系統中土壤微生物多樣性研究

徐嫻雅 胥一波

關鍵詞：城市生態;垂直森林建筑;土壤微生物;a多樣性;b多樣性

0引言

城市化過程中發生的土地利用類型改變是人類破壞自然生態系統的主要形式之一[1-2].在城市中綠地占比面積較小且以破碎化狀態分布，導致城市生物多樣性的維持面臨極大挑戰，威脅本已脆弱的城市生態系統服務功能，進而影響城市居民的生活品質[3-4].盡管已有越來越多的城市在規劃時加大綠地建設投入，但是在城市生態系統中開展生物多樣性保護的關鍵“瓶頸”在于城市極其有限的空間導致綠化用地緊缺[2，5].因此，為了盡可能地增加城市綠地面積，利用建筑物外表進行綠化已成為改善城市生態環境、保護生物多樣性的一種重要措施，也是“海綿城市”建設的必要組成部分[6-7].然而，目前建筑物綠化的重點普遍集中于屋頂，而其他建筑表面的綠化利用效率較低[8-9].

為了更好地開發建筑物側面的綠化潛力，提升建筑對城市生物多樣性保護的貢獻，生態建筑設計 師聯合了包括植物學、動物學、生態學專家在內的團隊，于2007年在意大利米蘭啟動了垂直森林建筑設計和建設項目，并于2014年10月完成了首批共兩座垂直森林建筑并交付使用.該設計方案將喬木與灌木運用于建筑立面綠化，種植在垂直森林建筑單體側面總面積達到8900m2的露臺上[10-11]（圖1）.此外，基于城市生態學中近自然林的人工綠地設計理念，選取建筑周邊約5km范圍內城市公園中較常見的本土植物品種用于垂直森林綠化[12].盡管垂直森林設計對地表植物群落進行了妥善保護，但是并未考慮對城市生態系統中其他生物類群開展保護.土壤微生物群落對整個綠地系統的新陳代謝以及植物生長起到決定性作用，是影響生態系統服務功能的關鍵因素[13-14].然而，目前尚不明確垂直森林建筑綠化中土壤微生物群落組成與多樣性格局，因而無法檢驗該種建筑綠化方式是否對城市土壤微生物多樣性的維持具有重要貢獻.

因此，本研究采集位于米蘭的兩座垂直森林與其周邊綠地中的土壤樣品，通過基于二代測序的高通量基因條形碼技術（meta-barcoding），分析垂直森林綠化中土壤細菌、真菌與微型動物這3類主要的土壤微生物的物種組成與多樣性水平，并與周邊綠地中的土壤微生物群落進行比較，以此檢驗垂直森林綠化方式對城市土壤微生物多樣性的貢獻.

1材料與方法

1.1 研究對象

位于意大利米蘭市區的首批兩座垂直森林建筑（45°29'N，9°11'E）分別高80m（D座）和112m（E座），共包含113戶居住單位.米蘭垂直森林建筑突破傳統藤木植物和小灌木種植綠化理念，在每座建筑中將711棵3～9m高的喬木種植于建筑側面的露臺中，同時這些露臺中還種植了5000株灌木和15000株草本植株（表1）.此外，建筑設計團隊針對風、灌溉、濕度、日照等一系列實際問題，制定了一套植物的培育、遷移和養護方案[10].自2014年建成，首批垂直森林建筑已正常使用了6年，目前綠化植物總體長勢良好.

1.2 樣品采集

于2019年7月對土壤樣品進行采集.在兩座垂直森林塔樓中（D座與E座）共設置40個采樣地點（即每座建筑各20個垂直森林露臺）.在每座建筑中各個側面都設置了5個采樣地點，位于不同的5個層高區域，每個區域中隨機選擇1個露臺作為采樣地點（圖2）.同時，在周邊綠地中隨機選取5個采樣地點作為參照進行土壤樣品采集.

在每個采樣點中，采用對角線法選取1m×1m的正方形樣地的4個頂點與對角線交點進行表層土壤樣品采集，采集深度為20cm的土壤.在去除植被根系后，將同一平臺中獲取的5份土壤樣品充分混勻，將其作為一份測試樣品，用于土壤微生物種類的鑒定.在提取環境DNA前，所有測試樣品置于℃環境中妥善保存.

1.3 基因條形碼選擇與高通量測序

采用環境生物DNA提取試劑盒提取土壤微生物的總DNA.DNA濃度與純度使用NanoDrop2000分析儀進行檢測，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳技術檢測DNA片段的完整性.采用16SrRNA、ITS與COI基因作為條形碼標記分別對土壤DNA樣品中的真菌、細菌和土壤微型動物（屬于后生動物門（Metazoa）的微型動物）種類進行分析鑒定（深圳華大基因科技有限公司（BGI））（表2）.合成這3個基因的通用引物采用基因擴增儀（ABIGeneAmp?9700）進行PCR擴增（反應退火溫度為53～57℃，循環數均為35），使用AgencourtAMPureX磁珠對PCR擴增產物進行純化，使用Agilent2100Bioanalyzer對擴增基因片段范圍及濃度進行檢測.檢測合格后，根據Illumina測序平臺（Illumina，SanDiego，USA）標準操作規程構建PE300測序文庫，采用IlluminaMiseq平臺進行測序.使用軟件Trimmomatic進行數據質控，采用Q20指標對初始測序數據（RawData）中的堿基進行質檢，過濾低質量reads，產生CleanData.采用軟件FLASH（FastLengthAdjustmentofShortReads）version1.2.11設置50bp滑動窗口和最小重疊序列10bp進行reads序列拼接，獲取條形碼基因的變異信息.將拼接后無法延長的序列片段作為基本數據處理單位進行OTU（OperationalTaxonomicUnit）聚類.

1.4 數據分析

1.4.1OTU聚類分析

使用軟件UPARSEversion7.1（http：//drive5.com/uparse/），根據97%的相似度對序列進行OTU聚類.采用軟件RDPclassifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）將聚類后的序列數據比對至Silva數據庫，對每條序列進行物種分類注釋，設置比對閾值為70%.在GenBank數據庫中進行Blast，對每條OTU進行比對搜索，以E<10–5為閾值尋找最相似的序列片段，進而確定OTU所屬的分類單位（屬或種），完成分類鑒定.由于COI位點也能檢測到部分真菌與藻類的序列信息，因此在分析時將這些序列所對應的OTUs去除，僅保留后生動物門物種OTU信息用以土壤微型動物群落組成分析.E1E90740-0DC0-4343-A25B-1540B459E182

1.4.2a多樣性分析

采用R軟件包Veganversion2.5-6進行a多樣性分析.以OTU為基本分類單元，采用ObservedOTU、Chao、Shannon、Simpson等多樣性指數分析、比較各物種類群的a多樣性水平.此外，通過隨機抽樣的方式，繪制各多樣性指數隨OTU樣本量增加而變化的稀釋曲線，以反映樣品取樣力度是否充分.

1.4.3土壤微生物群落聚類分析

在每個土壤微生物類群中，采用非度量多維尺度（Non-metricMultidimensionalScaling，NMDS）方法對不同樣品中的土壤微生物群落進行特征分類.將兩種分析方法得到的最重要的兩個維度進行可視化處理，根據樣品間離散程度可以反映出不同樣品間土壤微生物群落的相似性.上述分析采用R軟件包Veganversion2.5-6.

1.4.4b多樣性分析

為了進一步分析各微生物類群在樣品間存在的差異，采用軟件QIIMEversion1.80進行b多樣性分析.根據序列數最少的樣品對其他樣品進行序列隨機抽取，生成新的OTUtablebiom文件，并采用unweightedUniFrac指數計算b多樣性距離.該指數在比較樣品間的群落結構差異時也考慮了OTU序列間的遺傳距離，該指數越大，表示樣品間的差異越大.根據unweightedUnifrac距離矩陣做UPGMA聚類分析可以直觀地展示樣品間群落特征差異.

1.4.5差異分類單元篩選

為了揭示不同樣本組別（垂直森林D座、垂直森林E座和周邊綠地）間土壤微生物群落組成存在差異的主要成因，基于樣本中各分類單元的多度數據，采用Wilcox秩和檢驗與基于Turkey-Kramer方法的post-hoc檢驗，并采用FDR校正法篩選土壤細菌、真菌與微型動物中在不同樣本組別間相對多度存在顯著差異的綱一級分類單元.

2結果

2.1 數據質控與OTU聚類

采用高通量測序技術對各土壤樣品中不同土壤微生物類群的特異性基因片段進行測序，在每個樣品中分別獲得約37.5Mb的土壤細菌（16SrRNA基因）與土壤真菌（ITS基因）的測序數據（CleanData）以及約10.2Mb的COI基因測序數據.各樣品測序數據經質控、拼接后獲得至少7萬條16SrRNA基因、9萬條ITS基因與1.6萬條COI基因序列用于OTU聚類分析.

對16SrRNA與ITS基因序列進行OTU聚類，共計發現6721種細菌OTUs以及4300種真菌OTUs，其中多度最高的優勢細菌物種來自假單胞菌屬（Pseudomonas），優勢真菌物種為來自肉座菌目（Hypocreales）的Ilyonectriamacrodidyma.經OUT聚類和篩選后，COI基因序列中共發現3621種土壤微型動物（后生動物門）OTUs，其中千足蟲科（Blaniulidae）物種Choneiuluspalmatus為多度最高的優勢物種.在每個土壤樣品中共發現1913～3145種細菌OTUs、285～777種真菌OTUs以及134～495種土壤微型動物OTUs.

土壤細菌群落中，垂直森林D座土壤中的細菌OTU數量最多，達6284種;E座土壤次之，為6160種;而周邊綠地中的土壤細菌OTU數量較少，僅為4556種（圖3（a））.所有細菌中54.4%的OTUs為3種樣本組別共有，兩座垂直森林建筑共享84.5%的細菌OTUs;同時，周邊綠地土壤細菌OTU總數的92.8%（4226種）也存在于兩座垂直森林建筑中（圖3（a））.因此，3種樣本組別的土壤細菌群落組成相似.土壤真菌群落中，垂直森林D座土壤中的真菌OTU數量最多，達2854種;E座土壤次之，為2721種;而周邊綠地中的土壤真菌OTU數量為1750種（圖3（b））.與土壤細菌群落有所不同的是，僅17.7%的土壤真菌OTUs為3種樣本組別共有，兩座垂直森林建筑也僅共享44.7%的真菌OTUs，而各樣本組別中特有真菌OTU的數量較多，占真菌總OTUs的47.3%（圖3（b））.土壤微型動物群落格局與土壤真菌群落相似，3種樣本組別僅共享10.1%的微型動物OTUs，且各樣本組別中特有微型動物OTU數量較多，占微型動物總OTUs的57.3%（圖3（c））.因此，不同樣本組別間土壤真菌與微型動物群落物種組成存在較大差異.

2.2 a多樣性

盡管在各生物類群中不同樣品間各項a多樣性指數存在較大差異，但是不同樣本組別中各項a多樣性指數均無顯著差異（p>0.05）（圖4）.這些結果說明，垂直森林建筑與周邊綠地間單個樣品中土壤微生物多樣性無明顯差異.此外，多樣性稀釋曲線分析的結果表明，在大部分土壤樣品中的細菌、真菌與微型動物群落各a多樣性指數的變化幅度隨抽樣OTU數量增加而逐漸減?。▓D5），說明測序力度充分，能夠準確地反映各樣品中不同生物類群的a多樣性.

2.3 土壤微生物群落聚類

采用非度量多維尺度方法（NMDS）的分析結果表明，各土壤微生物類群具有相似的聚類格局（圖6（a）—（c））.盡管各垂直森林建筑中的土壤樣品間在同一生物類群的群落組成上存在一定差異，但是兩座垂直森林建筑中各樣品集中于同一區域且相互重疊，表明這些樣品具有相似的土壤群落特征，而周邊綠地與兩座垂直森林建筑間群落特征差異較大.

2.4 b多樣性

采用unweightedUniFrac指數計算樣品間各生物類群b多樣性并進行聚類分析.結果表明，周邊綠地樣品的土壤細菌和真菌群落組成與兩座垂直森林建筑中的樣品相比差異較大，而不同垂直森林建筑中樣品則往往聚為同類，說明周邊綠地與垂直森林建筑間存在較高的b多樣性（圖6（d）—（e））.然而，土壤微型動物的b多樣性聚類結果與以上兩個生物類群存在一定差異.盡管在聚類時2個周邊綠地樣品率先與其他樣品分離，但是垂直森林D座中的一個樣品（D03V06）卻與其他樣品存在較大差異，單獨形成一個二級分支，并且，其余2個周邊綠地樣品與垂直森林D座和E座中各一個樣品聚為一類（圖6（f））.這些結果說明，不同樣本組別中各樣品間土壤微型動物群落組成差異較大.E1E90740-0DC0-4343-A25B-1540B459E182

2.5 差異分類單元篩選

采用Wilcox秩和檢驗對不同樣本組別中各生物類群綱一級分類單元的相對多度進行比較檢驗.結果表明，土壤細菌群落中僅有1個綱一級分類單元在兩座垂直森林建筑間有顯著差異（p<0.05），而周遭綠地與兩座垂直森林建筑間分別有24個和17個綱一級分類單元存在顯著差異（p<0.05）;在土壤真菌群落中，兩座垂直森林建筑間以及D座與周遭綠地間無顯著差異的綱一級分類單元（p>0.05），僅E座與周遭綠地間存在1個具有顯著差異的綱一級分類單元（p<0.05）;在土壤微型動物中，兩座垂直森林建筑間中無顯著差異的綱一級分類單元（p>0.05），而周遭綠地與兩座垂直森林建筑間分別有4個（水螅綱（Hydrozoa）、蛭形輪蟲綱（Bdelloidea）、色矛綱（Chromadorea）和多毛綱（Polychaeta））與1個（水螅綱（Hydrozoa））綱一級分類單元存在顯著差異（p<0.05）.上述結果從一定程度上揭示了兩座垂直森林建筑間土壤微生物群落結構差異較小，而與周邊綠地差異較大的原因.

3討論

通常認為，城市擴張與綠化用地間存在著不可調和的矛盾，有限的綠化面積不利于城市生物多樣性的維持[1].垂直森林是一種充分利用建筑物側面拓展城市森林綠地的設計理念，為解決城市綠化用地緊缺問題提供了可行方案[10].盡管通過人工栽種、養護地上植被來保護地表植物多樣性，但垂直森林綠化系統對地下土壤微生物多樣性的貢獻仍不明確.本研究采用基于高通量測序的基因條形碼技術，對來自兩座垂直森林建筑及周邊綠地的45份土壤樣品中土壤細菌、真菌與微型動物群落組成與多樣性格局進行分析，發現不同樣本組別中各樣品土壤微生物群落具有相似的a多樣性;同時，聚類分析與b多樣性的分析結果也表明，垂直森林建筑及周邊綠地間各土壤微生物類群的群落均存在較大差異，并確定了造成群落差異的關鍵分類單元.因此，總體而言，兩座垂直森林建筑中的綠化土壤能夠容納的土壤微生物種類數與周邊綠地土壤相似;但是，這兩種不同類型的綠化系統中土壤微生物種類組成與群落特征存在較大差異，而兩座垂直森林建筑則具有較為相似的土壤微生物群落組成.

土壤微生物群落組成與地表植被有著重要關系[13-16].兩座垂直森林建筑間較為相似的土壤微生物群落可能是由于栽種相似的植物.更為重要的是，盡管栽種的都是本地植物，能夠導致不同采樣地點具有相似的a多樣性，但是周邊綠地中的植物群落組成必然與垂直森林綠化存在一定差異，進而造成土壤微生物群落組成上的差異.土壤理化條件也是影響土壤微生物群落的重要因素[17-18].垂直森林綠化由于人工養護等原因，其土壤可能含有較周邊綠地更為豐富的養分;同時，垂直森林露臺設置了良好的排水系統，使得土壤含水量較低.這些理化條件上的變化也是導致垂直森林綠化與周邊綠地土壤微生物群落存在差異的潛在因素.

此外，某些潛在的影響因素，如外界干擾等[19]，不太可能對本研究中的土壤微生物群落造成顯著影響.因為在采集土壤樣品時，垂直森林建筑已投入使用5年，其間沒有發生大規模維修等干擾事件，綠化土壤中的微生物群落已基本達到穩定狀態.垂直森林綠化的朝向與所在樓層也可能導致風力、溫度和光照時間等氣象條件發生變化，進而影響土壤微生物多樣性.然而，本研究發現，同一垂直森林建筑內具有相同朝向以及來自同一樓層或相近樓層的樣品中各土壤微生物類群均未體現出聚集分布的格局.因此，土壤微生物群落差異與朝向和樓層無明顯相關性（圖6）.在各土壤微生物類群中垂直森林綠化中發現的總物種數均多于周邊綠地，這主要是由于周邊綠地中的土壤樣品較少所致.在今后的研究中，需加強對周邊綠地的取樣力度，更好地了解原有綠地中的微生物分布格局.

綜上所述，垂直森林建筑能夠容納較多的土壤微生物種類，并為在景觀尺度上提高土壤微生物的b多樣性做出一定貢獻.這對地表植物多樣性的長期維持起到了重要的支撐作用，也為取食不同類型植物的土壤微生物和小型動物提供了豐富的食物資源，進而為吸引鳥類等體形較大的動物前來定居創造了條件，有利于城市動物多樣性的提高.因此，垂直森林建筑能夠成為城市綠地系統的重要組成部分，并參與城市生物多樣性保護，也為城市生態系統建設從平面到空間的設計革新提供了有益參考.繼米蘭垂直森林作為該類建筑原型后，荷蘭埃因霍恩、瑞士洛桑、中國南京和中國武漢的4座垂直森林相繼啟動.這些項目分別依據當地的氣候和環境，針對建筑原型的設計方法、手段開展因地制宜的調整，構建一套適合不同項目需求的動植物藍本[19]，為城市生態建筑設計提供新范式，也為城市擴張而帶來的一系列生態問題提供有效的修復策略.E1E90740-0DC0-4343-A25B-1540B459E182