山西部分地區犢牛腹瀉大腸桿菌耐藥基因分析

王國艷 范建強 黨文慶 何敏 王志宇

摘要 [目的]調查山西省某肉牛場犢牛腹瀉源大腸桿菌耐藥基因的流行情況。[方法]采用Kirby-Bauer紙片法和PCR法，對分離出的8株腹瀉大腸桿菌進行了7種臨床常用藥物的藥物敏感試驗及相關耐藥基因的檢測。[結果]耐3種藥物的菌株有1株，耐2種藥物的菌株有6株，僅有1株菌對1種藥物耐受;分離的8株犢牛源大腸桿菌菌株對四環素、慶大霉素高度耐藥，耐藥率分別為100%、87.5%;對氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素敏感性較高。分離的8株犢牛源大腸桿菌菌株的 aph3′-Ⅱ、TetD和TetB基因檢出率分別為75.0%、62.5%和37.5%。[結論]該肉牛場犢牛源腹瀉大腸桿菌存在一定程度的耐藥性。

關鍵詞 大腸桿菌;牛腹瀉;耐藥基因

中圖分類號 S 852.61? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）12-0079-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.020

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Drug Resistance Gene Analysis of Escherichia coli from Diarrhea of Calves in Shanxi

WANG Guo-yan1，FAN Jian-qiang2， DANG Wen-qing1 et al

（1.Longcheng Campus， College of Animal Medicine， Shanxi Agricultural University， Taiyuan， Shanxi 030032;2.Loufan Wanshunyuan Agriculture and Animal Husbandry Development Co.，Ltd.，Taiyuan， Shanxi 030300）

Abstract [Objective]In order to investigate the prevalence of drug resistance genes of Escherichia coli from diarrhea in calves of a beef cattle farm in Shanxi Province.[Method]8 strains of E.coli isolated by Kirby Bauer method and PCR were tested for drug sensitivity and related drug resistance genes.[Result]The results showed that 1 strain were resistant to 3 drugs， 6 strain were resistant to 2 drugs， and only 1 strain was resistant to 1 drug.Eight strains of E.coli isolated from calves were highly resistant to tetracycline gentamicin， and the resistance rates were 100%， 87.5%， respectively.The sensitivity to ofloxacin amikacin kanamycin was higher.The detection rates of aph3-Ⅱ、TetD and TetB genes of 8 strains of E.coli isolated from calves were 75.0%， 62.5% and 37.5%， respectively.[Conclusion]The study indicates that there was a certain degree of resistance to E.coli from calf diarrhea in this cattle farm.

Key words Escherichia coli;Cattle diarrhea;Drug resistance genes

犢牛腹瀉是一種臨床表現以腹瀉、脫水、發熱、消瘦為主的疾病，沒有明顯的季節性[1-3]。該病是由病毒、細菌、寄生蟲、營養、環境等眾多因素引起[4-6]，而由致病性大腸桿菌混合感染引起的占90%[3，7-8]。近幾年，山西太原地區肉牛養殖業發展較為迅速，犢牛腹瀉越來越引起人們的重視。筆者于2019—2020年在養殖場共采集分離出8株犢牛腹瀉大腸桿菌，并進行了耐藥表型及耐藥基因的檢測，旨在為養殖場犢牛大腸桿菌腹瀉的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源。

于2019—2020年共采集山西省太原地區某肉牛場分離的8株腹瀉大腸桿菌，由山西農業大學龍城校區（原山西省農業科學院畜牧獸醫研究所）保存。菌株編號為1～8號。

1.1.2 主要試劑。

水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）培養基、Mueller-Hinton 肉湯（MH肉湯）購自青島賓得生物技術有限公司;細菌基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq MasterMix、marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京） 有限公司;藥敏紙片：阿米卡星（10 μg/片）、頭孢曲松（30 μg/片）、氧氟沙星（30 μg/片）、諾氟沙星（30 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、四環素（30 μg/片），購自北京天壇生物制品有限公司。

1.1.3 引物的設計與合成。

參照參考文獻[9-11]合成相關引物，包括四環素類耐藥基因（TetA、TetB、TetD）、β-內酰胺類耐藥基因（SHV）、氨基糖苷類耐藥基因[aph3′-Ⅱ、aac（6′）-Ib]，引物信息見表 1。引物由生工生物工程（ 上海） 股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株復蘇。

將保存的菌株分別劃線接種于MH瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基（MAC）、伊紅美藍瓊脂培養基（EMB） ，37? ℃恒溫過夜培養;將EMB培養基上生長的單個菌落接種于MH營養肉湯中，37 ℃恒溫振蕩培養12～16 h。

1.2.2 藥敏試驗。

參照美國臨床實驗室標準委員會[12]（NCCLS）推薦的K-B紙片擴散法對復蘇的8株菌株進行藥物敏感性試驗，并根據臨床實驗室標準化協會[13]（CLSI） 標準判定結果。

1.2.3 大腸桿菌耐藥基因的檢測。

以大腸桿菌細菌基因組DNA為模板對分離的8株大腸桿菌進行PCR檢測。PCR擴增體系（20 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各1 μL，DNA 模板1μL，ddH2O 7 μL，各PCR擴增程序見表2。對PCR產物進行電泳分析。

2 結果與分析

2.1 菌株復蘇

8株菌株在MH上呈灰白色;在MAC上呈磚紅色或粉紅色菌落，在EMB上呈黑綠色金屬光澤菌落。

2.2 藥敏試驗 8株大腸桿菌的藥敏試驗結果見表3、4。

由表 3、4可知，四環素的耐藥率為 100%;對氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素的高敏率為均87.5%;經過對這8株菌株的耐藥譜分析發現，耐3種藥物的菌株有1株，耐2種藥物的菌株有6株，僅有 3號菌株對1種藥物耐藥，說明該肉牛養殖場腹瀉大腸桿菌有嚴重的多重耐藥性。

2.3 耐藥基因的PCR檢測結果 該研究選取了6種耐藥基因，通過PCR方法對8株分離菌株進行耐藥基因檢測，結果見圖1。結果表明，8株菌株分別攜帶不同的耐藥基因，具體結果見表5。由表5可知，氨基糖苷類aph3′-Ⅱ基因的檢出率較高，為75.0%;未檢測到aac（6′）-Ib基因。四環素類TetD基因的檢出率為62.5%;TetB基因的檢出率較低，為37.5%;未檢測到TetA基因。也未檢測到β-內酰胺類SHV基因。

3 小結

隨著人們生活水平的不斷提高，對牛肉的需求也不斷增加，肉牛規?；B殖在不斷發展，抗生素被用于預防疾病，提高經濟效益的同時，也刺激細菌產生耐藥性。細菌耐藥性的產生對動物疾病的治療有很大的影響，對健康養殖危害極大。該研究選取2019—2020年從山西省太原地區某肉牛場分離的8株牛源腹瀉大腸桿菌進行敏感藥物篩選試驗，其中耐3種藥物的菌株有1株，耐2種藥物的菌株有6株，僅1株菌對1種藥物耐受;所有菌株對阿米卡星、卡那霉素、氧氟沙星均高度敏感，可以作為該養殖場的優先選擇藥物。所有菌株對四環素均耐藥，對氨基糖苷類藥物慶大霉素的耐藥率均為87.5%。李慧等[14]對寧夏地區66株牛源大腸桿菌進行耐藥性，檢出顯示慶大霉素的耐藥率為15.15%;高?；鄣萚15]研究結果表明，寧夏地區164株犢牛腹瀉源大腸桿菌對頭孢唑啉的耐藥率達到95%。這些報道表明，不同地區分離的腹瀉大腸桿菌菌株的耐藥性不同，山西省太原地區某肉牛養殖場的腹瀉大腸桿菌菌株有其耐藥表征。

對6種耐藥基因檢測的結果表明，該養殖場分離的腹瀉大腸桿菌攜帶的耐藥基因主要是氨基糖苷類aph3′-Ⅱ基因，檢出率為75.0%。四環素類TetD基因，檢出率為62.5%;TetB基因的檢出率為37.5%。吳同壘等[16]對秦皇島地區肉牛腹瀉大腸桿菌耐藥基因的檢測結果表明，四環素類TetD基因檢出率較低，為33.3%，說明不同地區肉牛腹瀉大腸桿菌菌株的耐藥基因存在不同。

因此，在預防和治療犢牛腹瀉大腸桿菌病時，要定期進行敏感藥物篩選試驗，為臨床上合理用藥提供科學指導，避免長期使用同樣的藥物，探索新的治療方法。

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