鈦鐵試劑對低溫脅迫及恢復后秋茄幼苗光合生理特性的影響

潘曉嬌 鄭春芳 劉偉成 陳繼濃 丁文勇

摘要 [目的]探討鈦鐵試劑對秋茄幼苗的抗寒性調控作用。[方法]以秋茄幼苗為試材，研究噴灑10 mmol/L鈦鐵試劑對低溫脅迫及恢復后植株葉片光合和葉綠素熒光參數、抗氧化系統以及細胞膜透性的影響。[結果]鈦鐵試劑能顯著提高低溫脅迫及恢復后秋茄幼苗葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、PSII最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學效率（ΦPSII），光化學猝滅系數（qP），抑制非光化學猝滅系數（NPQ）;鈦鐵試劑也能增加短期低溫脅迫及恢復后秋茄幼苗葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，抑制相對電導率以及MDA含量積累。[結論]鈦鐵試劑能有效改善植株抗氧化系統，提高植株的光合作用，從而增強秋茄幼苗的抗寒性。

關鍵詞 紅樹林;秋茄;鈦鐵試劑;低溫脅迫;光合作用;酶活性

中圖分類號 S 796? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）12-0120-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.030

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Tiron on Photosynthetic Physiological Characteristics of Kandelia obovata Seedlings under Low Temperature Stress and Recovery

PAN Xiao-jiao1，ZHENG Chun-fang2，LIU Wei-cheng3 et al （1.School of Design and Digital Arts， Zhejiang Industry and Trade Vocational College， Wenzhou， Zhejiang 325000; 2.College of Life and Environmental Science， Wenzhou University， Wenzhou， Zhejiang 325035; 3.Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-resource， Zhejiang Mariculture Research Institute， Wenzhou， Zhejiang 325005）

Abstract [Objective]In order to explore the regulative role of tiron on cold tolerance of Kandelia obovata seedlings.[Method]An experiment was carried out to analyze the effects of 10 mol/L tiron on parameters of gas exchange and chlorophyll fluorescence， antioxidant system and relative electrical conductivity in K.obovata seedling to low temperature stress and recovery.[Result]The results showed that tiron significantly increased leaf net photosynthetic rate （Pn）， stomatal conductance （Gs）， photochemical efficiency of photosystem II （Fv/Fm）， actual photochemical efficiency （ΦPSII）， photochemical quenching coefficient （qP） in K.obovate， while significantly decreased leaf non-photochemical quenching coefficient （NPQ）.In addition， tiron increased the activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD） and ascorbate peroxidase （APX）， and alleviated the oxidative damage in leaves of K.obovata by reducing cell membrane permeability （relative electrical conductivity） and lipid peroxidation （malondialdehyde， MDA）.[Conclusion]The study indicates that tiron could effectively improve the antioxidant system， increase leaf photosynthesis， and enhance cold tolerance of K.obovate seedlings.

Key words Mangrove;Kandelia obovate;Tiron;Low temperature stress;Photosynthesis;Enzymatic activity

秋茄（Kandelia obovata）是我國分布緯度最北，且最耐寒的紅樹植物之一[1]，被作為向更高緯度引種的最佳紅樹植物品種之一。低溫是影響紅樹林存活及其生長發育的主要非生物脅迫因子，嚴重影響秋茄的生長發育和地理分布[2]。近年來，隨著全球氣候變暖，極端低溫發生的頻率、強度和持續時間都在不斷增加，低溫脅迫對紅樹林產生了極大的傷害[3]。研究表明，低溫脅迫會影響秋茄抗氧化系統，提高植株體內活性氧（ROS）含量，抑制葉綠素合成，最終降低植株的光合作用[4-6]。鈦鐵試劑（Tiron，disodium 1，2-dihydroxybenzene-3，5-disulfonate）是一種非毒性的自由基清除劑[7]，并已經作為植物清除ROS清除劑得以應用[8-9]。研究發現，適宜濃度的鈦鐵試劑能減輕重金屬脅迫對冬珊瑚幼苗根系生長的抑制[10]。然而，關于鈦鐵試劑調控低溫脅迫下紅樹植物秋茄葉片光合作用和保護酶的研究尚鮮見報道。為此，筆者探討了葉面噴灑鈦鐵試劑對低溫脅迫下秋茄葉片光合、熒光參數以及抗氧化系統中相關保護酶的影響，探討ROS清除劑調控秋茄抗寒的機制，以期為我國高緯度引種紅樹林的安全越冬提供新的途徑。F2511C60-F8CE-4E41-9DE6-DA4AA437BE0B

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年4月，從福建漳州購置秋茄胚軸，經消毒后種植在高30 cm直徑20 cm并裝有3 kg灘涂淤泥自然風干土的聚乙烯塑料桶內，每個桶中插種4株，自然環境下培養，定期澆灌霍格蘭氏（Hoaglands）營養液，保持水層1～2 cm。次年（2020年）12月進行低溫脅迫試驗。

1.2 試驗設計

試驗設定4個處理：①噴灑清水作為對照（CK）;②噴灑10 mmol/L鈦鐵試劑（TIR）;③低溫脅迫處理（LTS）：噴灑清水+低溫;④鈦鐵試劑緩解低溫脅迫處理（TIR+LTS）：噴灑10 mol/L鈦鐵試劑+低溫。每處理3次重復，每個重復3桶。

1.3 試驗處理 把植株大小一致的秋茄幼苗移入智能光照培養箱內適應8 d，設定溫度為20? ℃（晝）/15 ℃（夜），光照12 h/d，光照強度 400 μmol/（m2·s）。適應結束后，仍保留在光照培養箱（各設定參數均不變）內。把幼苗分為2部分，一部分葉面噴灑清水，另一部分葉面噴灑鈦鐵試劑溶液。隔天早晚各噴施1次，噴灑以葉面濕潤且不下滴為宜，共噴施4 d，共8 d。之后，一半噴施清水和鈦鐵試劑溶液的植株仍保留在原培養箱（各設定的參數仍與適應時設置一致）內作為對照（CK）和鈦鐵試劑（TIR）處理，而另一半噴施清水和鈦鐵試劑溶液的植株轉入另一個溫度設定為5 ℃（晝）/-1 ℃（夜）冷光源植物生長箱（GDX-260E;除溫度外，其他設定參數均不變）內進行低溫脅迫處理4 d，其中清水處理的植株為低溫脅迫處理（LTS），噴灑鈦鐵試劑后進行低溫脅迫的植株作為鈦鐵試劑緩解低溫脅迫處理（TIR+LTS），光照條件不變。低溫脅迫4 d后，溫度調整為20? ℃（晝）/15? ℃（夜），LTS和TIR+LTS處理的植株均恢復1 d。分別在低溫4 d和恢復1 d選取各處理幼苗頂端完全展開的倒三對葉片進行光合、熒光及生理指標測定。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 光合參數測定。分別在20 ℃和8 ℃光照培養箱內，10：00—11：30利用Li-6400型便攜式光合儀（Li-Cor Inc.， USA）測定頂端完全展開的倒三對葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）。測定光合參數時，設定光強400 μmol/（m2·s），CO2供應濃度為390 μmol/mol。

1.4.2 熒光參數測定。在測定光合參數相同的條件下，用英國Hansatech 公司生產的FMS-2型便攜調制式葉綠素熒光儀測定葉片熒光參數。測定前先暗適應30 min，然后打開FMS-2的內源光化光[400 μmol/（m2·s）]，5 min 后測定穩態熒光（Fs）、光下最大熒光（Fm′）、初始熒光（Fo）等。依據Rohácˇek[11]方法，計算光適應下實際光化學效率（ФPSII）、暗適應下最大光化學效率（Fv/Fm）、光化學猝滅系數（qP）和非光化學猝滅系數（NPQ）。

1.4.3 生理生化指標測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）法測定[12];過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法測定[12];丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[13]?？箟难徇^氧化物酶（APX）活性采用抗壞血酸法測定[14]。

將0.5 g新鮮葉片放入15 mL去離子水中，用抽氣機抽氣15 min后靜置60 min，用DDS211AT型電導儀測定外滲電解質（S1），以沸水煮10 min殺死植物組織為終電導值（S2），并計算相對電導率[15]。

1.5 數據處理 試驗數據用軟件SPSS 20.0進行方差分析和LSD顯著性測驗，并采用SigmaPlot 10.0繪圖軟件作圖。數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 鈦鐵試劑對低溫脅迫及恢復后秋茄幼苗葉片相對電導率的影響

由圖1可知，低溫4 d條件下，與CK相比，TIR處理提高了秋茄幼苗葉片相對電導率，但未達到顯著差異水平;LTS處理顯著提高了秋茄幼苗葉片相對電導率（P<0.05），為CK的1.6倍;TIR+LTS處理能顯著抑制秋茄幼苗葉片相對電導率增加，且葉片相對電導率僅為LTS處理的82.1%。正常條件下恢復1 d，LTS處理秋茄幼苗葉片相對電導率仍顯著高于CK，且為CK的1.5倍;TIR+LTS處理仍能顯著抑制葉片相對電導率的增加（P<0.05），且葉片相對電導率為LTS處理的84.0%。

2.2 鈦鐵試劑對低溫脅迫及恢復后秋茄幼苗葉片Pn和Gs的影響

由圖2可知，低溫4 d條件下，與CK相比，TIR處理能提高正常生長條件下秋茄幼苗葉片Pn和Gs，而LTS處理顯著降低秋茄幼苗葉片的Pn和Gs（P<0.05）。與LTS處理相比，TIR+LTS處理能顯著提高秋茄葉片Pn和Gs（P<0.05）。正常條件下恢復1 d后，LTS處理秋茄幼苗葉片Pn和Gs升高，但仍顯著低于CK（P<0.05）;LTS+TIR處理能加速秋茄幼苗葉片Pn和Gs恢復，但與CK相比，僅葉片Pn顯著降低（P<0.05），而Gs基本恢復正常。

2.3 鈦鐵試劑對低溫脅迫及恢復后秋茄幼苗葉片POD、APX、SOD活性和MDA含量的影響

由圖3可知，低溫4 d條件下，與CK相比，正常條件下TIR處理能提高秋茄幼苗葉片POD、APX以及SOD活性，但僅葉片POD和SOD活性與CK存在顯著差異（P<0.05）;LTS處理顯著降低秋茄幼苗葉片POD和APX活性（P<0.05），而顯著增加了SOD活性和MDA含量（P<0.05）。與LTS處理相比，LTS+TIR處理顯著提高了幼苗葉片POD、APX、SOD活性（P<0.05），且分別為TIR處理1.3、1.3、1.2倍;LTS+TIR處理反而顯著降低MDA含量（P<0.05），且為LTS處理的84.9%。正常條件下恢復1 d，TIR+LTS處理能加速葉片POD活性恢復，并與CK差異不顯著;與LTS相比，LTS+TIR處理仍顯著提高秋茄幼苗葉片POD、APX、SOD活性（P<0.05），顯著降低MDA含量（P<0.05）。F2511C60-F8CE-4E41-9DE6-DA4AA437BE0B

2.4 鈦鐵試劑對低溫脅迫及恢復秋茄幼苗葉片ФPSII、Fv/Fm、qP和NPQ的影響

由圖4可知，低溫4 d條件下，與CK相比，TIR處理對ФPSII、Fv/Fm、qP和NPQ均無顯著影響（P>0.05）。與CK相比，LTS處理顯著降低了秋茄幼苗葉片ФPSII、Fv/Fm、qP，且分別為CK的56.7%、49.0%、43.3%;顯著增加了葉片NPQ，為CK的2.2倍。與LTS相比，LTS+TIR處理顯著提高了葉片的ФPSII、Fv/Fm和qP（P<0.05），且分別為低溫脅迫處理的1.3、1.4、1.5倍，說明鈦鐵試劑能緩解低溫脅迫對秋茄幼苗葉片葉綠素熒光的傷害;LTS+TIR處理反而顯著降低葉片NPQ（P<0.05），為LTS處理的67.3%。正常條件下恢復1 d，LTS處理的秋茄幼苗葉片ФPSII、Fv/Fm和qP仍顯著低于CK（P<0.05），而葉片NPQ顯著高于CK（P<0.05）;LTS+TIR處理有助于秋茄幼苗葉片葉綠素熒光參數（ФPSII、Fv/Fm和qP）的恢復，葉片ФPSII、Fv/Fm和qP分別為LTS處理的1.2、1.3、1.3倍;反而抑制NPQ增加，約為LTS處理的79.1%。

3 討論

一般來說，在正常情況下，植物細胞內自由基的產生與清除處于動態平衡，而低溫脅迫會破壞這種平衡，使大量自由基積累，致使膜脂過氧化程度加劇，導致細胞膜損傷與破壞[16]。其中，抗氧化酶SOD、POD、APX是清除ROS的重要酶類。研究表明，紅樹植物秋茄葉片相對電導率和MDA含量是衡量植物細胞膜脂過氧化的重要指標[17]。低溫脅迫會降低秋茄幼苗葉片POD和APX活性，增加MDA含量和相對電導率，表明低溫脅迫導致植物細胞膜受損，膜脂過氧化程度加劇，最終導致秋茄葉片Pn和Gs顯著降低[5， 18]。前期研究發現，外施褪黑素[17]、烯效唑[19]以及抗寒鍛煉[19]均能通過提高SOD、POD及APX活性，減少MDA含量，增強葉片光合能力，提高秋茄植株抗寒性。該研究中，低溫脅迫4 d及恢復1 d均顯著降低秋茄幼苗葉片POD、APX活性，增加SOD活性、MDA含量和細胞膜透性，說明低溫脅迫能誘導葉片SOD清除超氧陰離子（O2-·）能力，但又因為其清除能力有限，造成ROS大量積累，從而導致MDA含量和相對電導率增加，最終降低葉片Pn和Gs，這與前人研究一致[20]。在低溫脅迫和恢復期間，鈦鐵試劑能提高低溫脅迫下葉片SOD、POD、APX活性，抑制MDA含量和相對電導率增加。表明鈦鐵試劑能提高抗氧化酶，抑制ROS積累，減輕質膜受氧化損傷的程度，提高葉片的Pn和Gs。

葉綠素熒光參數（ΦPSII、qP、Fv/Fm等）是反映植物對光能的吸收、轉化、傳遞等變化的靈敏探針，能夠快速、靈敏和無損傷地研究和探測完整秋茄植株在低溫脅迫下葉片光合作用能力[21-22]。其中，ΦPSII能反映電子在PSII與PSI的傳遞情況，Fv/Fm可反映PSII在全開狀態時能夠達到的最大光能轉換效率，qP是光合作用引起的熒光猝滅，反映PSII反應中心的電子傳遞活性，NPQ用來反映植物耗散過剩光能為熱的能力，即光保護能力[23]。 郭菊蘭等[24]研究發現，ΦPSII、qP、Fv/Fm值隨低溫脅迫程度增強而迅速下降，這是反映紅樹植物響應低溫脅迫的重要特征。鄭春芳等[25]研究發現，低溫脅迫會降低秋茄幼苗葉片ΦPSII、qP，增加NPQ，減輕葉片PSII光抑制，降低光合能力，這與該研究結果一致。該研究還發現，即使在20 ℃（晝）/15 ℃（夜）條件恢復1 d，葉片葉綠素熒光參數（ΦPSII、qP、Fv/Fm、NPQ）均與CK存在顯著差異，表明低溫脅迫使得電子傳遞活性受到抑制，光能轉化利用率下降，同時也增加PSII吸收的光能轉化為熱能消耗的比例。外施鈦鐵試劑能通過調控植物生物堿改善根系生長[7]，至于鈦鐵試劑是否影響低溫脅迫下秋茄幼苗葉片葉綠素熒光參數的變化，目前鮮見報道。該研究中，鈦鐵試劑能顯著增加低溫脅迫下秋茄葉片ΦPSII、qP、Fv/Fm，抑制NPQ增加，同時提高了Pn和Gs，而且在20 ℃（晝）/15 ℃（夜）條件恢復1 d時鈦鐵試劑仍能促進ΦPSII、qP、Fv/Fm恢復。這可能是由于鈦鐵試劑通過光合功能的改善，使吸收的光能較多地進入光化學過程，有效減少光能的熱耗散，提高了葉片Pn和Gs。這表明低溫脅迫下鈦鐵試劑有利于光合色素將捕獲的光能轉化成化學能，維持較高的PSII光化學活性，提升葉片光合作用，有效緩解低溫脅迫對幼苗生長的抑制作用。

綜上所述，一定濃度的鈦鐵試劑能提高SOD、POD和APX活性，降低秋茄幼苗膜脂過氧化產物MDA 含量，穩定了細胞膜結構;鈦鐵試劑還能提高低溫脅迫下秋茄幼苗葉片ΦPSII、qP、Fv/Fm，使光合機構趨于穩定，抑制Pn和Gs下降，緩解低溫脅迫對光合系統的損傷，進而提高秋茄葉片光合作用，減輕低溫脅迫對植株的傷害。

參考文獻

[1]

WANG W Q，YOU S Y，WANG Y B，et al.Influence of frost on nutrient resorption during leaf senescence in a mangrove at its latitudinal limit of distribution[J].Plant and soil，2011，342（1/2）：105-115.

[2] QUISTHOUDT K，SCHMITZ N，RANDIN C F，et al.Temperature variation among mangrove latitudinal range limits worldwide[J].Trees，2012，26（6）：1919-1931.

[3] LIU K，LIU L，LIU H X，et al.Exploring the effects of biophysical parameters on the spatial pattern of rare cold damage to mangrove forests[J].Remote sensing of environment，2014，150：20-33.F2511C60-F8CE-4E41-9DE6-DA4AA437BE0B

[4] WANG Z，YU D L，ZHENG C F，et al.Ecophysiological analysis of mangrove seedlings Kandelia obovata exposed to natural low temperature at near 30°N[J].Journal of marine science and engineering，2019，292：1-11.

[5] PENG Y L，WANG Y S，FEI J，et al.Ecophysiological differences between three mangrove seedlinGs （Kandelia obovata，Aegiceras corniculatum，and Avicennia marina） exposed to chilling stress [J].Ecotoxicology，2015，24（7/8）：1722-1732.

[6] 鄭春芳，劉偉成，陳少波，等.短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗碳氮代謝及其相關酶活性的影響[J].生態學報，2013，33（21）：6853-6862.

[7] AKITA M，OHTA Y.The effect of Tiron，a water soluble radical scavenger，on growth，morphology and alkaloid content of adventitious roots in Atropa belladonna[J].Plant cell reports，2000，19（7）：705-709.

[8] 王新霞.ROS和PLD在冬凌草甲素對擬南芥的化感調節中的作用研究[D].蘭州：西北師范大學，2018.

[9] 楊文華.活性氧在藍萼甲、乙和丙素對萵苣的化感調節和HL-60細胞凋亡誘導中的作用研究[D].蘇州：蘇州大學，2013.

[10] 瞿靜，吳楚.重金屬脅迫下外源鈦鐵試劑對冬珊瑚幼苗根系發育、生物量累積及其分配格局的影響[J].長江大學學報（自科版），2014，11（23）：55-59.

[11] ROHCˇEK K.Chlorophyll fluorescence parameters：The definitions，photosynthetic meaning，and mutual relationships[J].Photosynthetica，2002，40（1）：13-29.

[12] TAN W，LIU J，DAI T，et al.Alterations in photosynthesis and antioxidant enzyme activity in winter wheat subjected to post-anthesis water-logging[J].Photosynthetica，2008，46（1）：21-27.

[13] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2000.

[14]

沈文飚，徐朗萊，葉茂炳，等.抗壞血酸過氧化物酶活性測定的探討[J].植物生理學通訊，1996，32（2）：203-205.

[15] 高俊鳳.植物生理學實驗技術[M].北京：世界圖書出版公司，2000.

[16] 明萌，何靜雯，盧丹，等.低溫脅迫對“琉球紅”杜鵑生理特性的影響[J].安徽農業科學，2017，45（23）：29-31，88.

[17] 鄭春芳，劉偉成，魏龍，等.外施褪黑素對低溫脅迫下紅樹植物秋茄光合作用和抗壞血酸-谷胱甘肽循環的調控[J].植物生理學報，2019，55（8）：1211-1221.

[18] ZHENG C F，TANG J W，CHEN J N，et al.Mechanisms on inhibition of photosynthesis in Kandelia obovata due to extreme cold events under climate change[J].Ecological processes，2016，5：1-11.

[19] 鄭春芳，陳繼濃，仇建標，等.烯效唑對低溫脅迫下秋茄幼苗光合作用與抗氧化系統的影響[J].植物生理學報，2016，52（1）：109-116.

[20] LIU W C，ZHENG C F，CHEN J N，et al.Cold acclimation improves photosynthesis by regulating the ascorbate-glutathione cycle in chloroplasts of Kandelia obovate[J].Journal of forest research，2019，30（3）：755-765.

[21] 李曉，馮偉，曾曉春.葉綠素熒光分析技術及應用進展[J].西北植物學報，2006，26（10）：2186-2196.

[22] 李紅，鄭春芳，陳繼濃，等.不同溫度下秋茄樹幼苗葉綠素熒光參數對光強的響應[J].浙江林業科技，2020，40（2）：17-22.

[23] 薛曉敏，韓雪平，王來平，等.苯嗪草酮對蘋果坐果和光合生物學特征的影響[J].應用生態學報，2021，32（2）：557-563.

[24] 郭菊蘭，朱耀軍，文菀玉，等.秋茄幼苗光合特性對寒害的響應[J].林業科學研究，2018，31（6）：63-68.

[25] 鄭春芳，陳威，劉偉成，等.低溫脅迫后紅樹植物秋茄幼苗光合特性及蔗糖代謝的恢復機制[J].生態學雜志，2020，39（12）：4048-4056.F2511C60-F8CE-4E41-9DE6-DA4AA437BE0B